適于益生菌發酵的青稞酶解液制備工藝優化

萬 萍易曉成 鄧 娟 黃麗華

(1. 成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；2. 四川工商職業技術學院酒類與食品工程系，四川 都江堰 611830)

適于益生菌發酵的青稞酶解液制備工藝優化

萬 萍1易曉成2鄧 娟1黃麗華1

(1. 成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；2. 四川工商職業技術學院酒類與食品工程系，四川 都江堰 611830)

采用程序升溫法對青稞進行酶解，以還原糖含量為響應值，采用響應面法對青稞酶解液制備工藝進行了優化。結果表明：按料水比1∶15(g/mL)溶解青稞粉，經糊化后冷卻至45 ℃，加入8.9 U/g·青稞的α-淀粉酶和原料質量2.0%，3.5%的糖化酶、菠蘿蛋白酶，保溫20 min后升溫到60 ℃酶解，直至碘試液體呈無色，過濾得到青稞酶解液，其還原糖、氨基酸態氮含量分別為5.68%、0.47 g/L，可作為制備益生菌發酵青稞飲料的良好基質。

青稞；酶解液；還原糖；程序升溫法；益生菌發酵液

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)屬于禾本科植物，主要產自中國的青藏高原，青藏高原也是世界上最早(公元前1100年)栽培青稞的地區[1]。青稞僅含少量的脂和糖，卻含有較高的蛋白質、纖維素以及維生素等，其中蛋白質含量平均可達11.31%、脂肪1.80%～3.09%、淀粉含量 70%以上[2]，除含有包括8種人體必需氨基酸在內的18種氨基酸外，還含有12種微量元素如鈣、鎂、硒、銅、鋅、鉻、錳、鐵、磷等[3]，其β-葡聚糖含量在3.66%～8.62%，平均值為5.25%。現代醫學[2]已經證明青稞不僅營養價值高，而且在降血脂、預防糖尿病、促進胃動力等方面具有獨特的保健作用。青稞既可以作為糧食，也可用于加工各類食品，如餅干、蛋糕、麥片粥、米花、青稞酒、青稞汁飲料等。

研究證明益生菌對腸道功能紊亂、呼吸感染以及過敏性癥狀有治療作用[4]，同時具有調節人體免疫系統、提高乳糖的利用率、防癌、降低膽固醇等功能[5]。國外研究者如Martensson等[6]的研究證明了：在燕麥這樣的非乳基質上益生菌能很好地存活和生長，并在冷藏條件下存活率較高。益生菌是定殖于宿主腸道內、當達到一定量就能對宿主產生積極作用的一類活菌。利用青稞淀粉生產益生菌發酵食品，是青稞產業化創新發展的一條新途徑。益生菌不能直接利用青稞淀粉進行發酵，在生產益生菌發酵青稞飲料時，首先要將青稞淀粉進行酶解糖化，以提供能被益生菌利用的還原糖類[7]。同時，如果能先將結合于淀粉顆粒上的蛋白質降解，生成一定量的氨基酸，使酶解液有更適宜的碳氮比，則更有利于淀粉酶解，進而有效地增進益生菌的生長。

本研究擬利用由α-淀粉酶、糖化酶、菠蘿蛋白酶組成的復合酶的協同作用，采用程序升溫法對青稞進行酶解。采用程序升溫是基于45 ℃為菠蘿蛋白酶最適作用溫度，而60 ℃則為兼顧α-淀粉酶和糖化酶的最適作用溫度，可使液化和糖化同時進行，在產生足夠還原糖的同時確保淀粉最大限度水解成可溶性低聚糊精和低聚糖，以構成益生菌發酵所需的益生元；研究不同料水比、α-淀粉酶用量、糖化酶用量和菠蘿蛋白酶用量對青稞酶解液還原糖含量的影響；并以還原糖含量為響應值，采用響應面法對青稞酶解液制備工藝進行優化，以期制備出能適合益生菌發酵的青稞酶解液，并為益生菌發酵青稞飲料的進一步工業化大生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

中溫α-淀粉酶：≥3 700 U/g，北京奧博星生物技術有限責任公司；

糖化酶(固體型10萬U/g)、菠蘿蛋白酶(50萬U/g)：銳陽生物科技有限公司；

檸檬酸：食品級，市售。

1.1.2 儀器

高速萬能粉碎機：FW-100型，北京中興偉業儀器有限公司；

水浴振蕩器：HZS-H型，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；

電子天平：LD型，沈陽龍騰電子有限公司；

電熱恒溫干燥箱：DHG-9141型，上海宏精實驗設備有限公司；

分析天平：BS110S型，北京賽多利斯天平有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

青稞→粉碎、過篩→加水混勻→加熱糊化→冷卻→調節pH→加入α-淀粉酶、糖化酶、菠蘿蛋白酶→攪拌均勻→保溫酶解→滅酶→過濾→青稞酶解液

1.2.2 理化指標檢驗方法

(1) 還原糖的測定：直接滴定法[8]138-140，以葡萄糖計。

(2) 氨基酸態氮的測定：電位滴定法[8]198。

1.2.3 試驗設計 選取影響青稞酶解的關鍵因素：料水比、α-淀粉酶用量、糖化酶用量、菠蘿蛋白酶用量進行單因素試驗，在單因素試驗的基礎上，以還原糖含量為響應值，采用響應曲面法對益生菌發酵青稞飲料酶解液制備工藝進行優化。試驗結果為每組2個平行樣的平均值。

(1) 料水比對還原糖含量的影響：準確稱取10份過80目篩的青稞粉，每份5 g，盛于10個250 mL的三角瓶中，分為5組，每組2份做平行樣，分別按料水比1∶10，1∶12.5，1∶15，1∶17.5，1∶20(g/mL)加入35 ℃的水，攪拌使其充分吸水，糊化20 min后冷卻至50 ℃左右，用10%的檸檬酸調節pH至5.0左右，然后分別加入原料質量的8 U/g的α-淀粉酶，1.9%的糖化酶和3.5%的菠蘿蛋白酶，放入水浴震蕩器中45 ℃保溫20 min，繼續升溫至60 ℃酶解直至碘試液體呈無色，然后在沸水浴中滅酶10 min后進行過濾，得到青稞酶解液，測定其還原糖含量，確定最適料水比。

(2)α-淀粉酶用量對還原糖含量的影響：按1.2.3(1)確定的最適料水比溶解青稞粉，除加入青稞質量1.9%的糖化酶和3.5%的菠蘿蛋白酶外，分別按4，6，8，10，12 U/g·青稞的比例加入α-淀粉酶，其它同1.2.3(1)，測定其還原糖含量，以確定最適α-淀粉酶用量。

(3) 糖化酶用量對還原糖含量的影響：按1.2.3(1)確定的最適料水比溶解青稞粉，除加入8 U/g·青稞的α-淀粉酶和3.5%的菠蘿蛋白酶外，分別加入青稞質量的1.3%，1.6%，1.9%，2.2%，2.5%的糖化酶，其它同1.2.3(1)，測定其還原糖含量，以確定最適的糖化酶用量。

(4) 菠蘿蛋白酶用量對還原糖和氨基酸態氮含量的影響：按1.2.3(1)確定的最適料水比溶解青稞粉，除加入8 U/g·青稞的α-淀粉酶和1.9%的糖化酶外，每組分別加入青稞質量2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%的菠蘿蛋白酶，其它同1.2.3(1)，測定還原糖和氨基酸態氮的含量，以確定最適菠蘿蛋白酶用量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料水比對還原糖含量的影響 水是物料和酶的溶劑，生化酶促反應都須在水中進行，料水比影響酶促反應底物濃度進而影響青稞中蛋白質和淀粉的酶解，以及最終制得的酶解液中還原糖和氨基酸態氮的含量。本研究考察了料水比對青稞酶解液中還原糖含量的影響，結果見圖1。

由圖1可知，酶解液中的還原糖含量隨料水比的增加而減少。還原糖含量直接影響益生菌的生長以及發酵后產品的酸度，在一定范圍內還原糖含量越高經發酵后生成的酸也越多，酸度也就越高，反之亦然。酸度過高影響口感和穩定性，過低又達不到要求；通常可通過料水比控制酶解液中還原糖含量以達到設計產品的要求。在料水比為1∶15(g/mL)時，還原糖含量為5.54%，能符合設計產品的要求，因此，確定最適料水比為1∶15(g/mL)。

2.1.2α-淀粉酶用量對還原糖含量的影響α-淀粉酶又稱液化酶，作用于淀粉后其主要產物是糊精，糊精在α-淀粉酶和糖化酶的協同作用下生成還原糖和少量低聚糖[9]。本研究考察了α-淀粉酶用量對還原糖含量的影響，結果見圖2。

由圖2可知，當α-淀粉酶用量小于8 U/g·青稞時，還原糖含量隨α-淀粉酶用量的增加呈上升趨勢；α-淀粉酶的用量為8 U/g·青稞時，還原糖含量達到了最高值(5.57%)；α-淀粉酶用量高于8 U/g·青稞后，還原糖含量隨著α-淀粉酶用量的增加趨于穩定且略有下降，說明α-淀粉酶用量過多會抑制其酶活。所以，確定α-淀粉酶的最適用量為8 U/g·青稞。

2.1.3 糖化酶用量對還原糖含量的影響 糖化酶可使淀粉的α-1，4-和α-1，6-糖苷鍵水解而生成葡萄糖，同時還能水解糊精、糖原的非還原末端釋放β-D-葡萄糖[10]。本研究考察了糖化酶用量對還原糖含量的影響，結果見圖3。

由圖3可知，當糖化酶用量小于1.9%時，還原糖含量隨糖化酶用量的增加呈上升趨勢；糖化酶用量為1.9%時，還原糖含量達到了最大值(5.59%)；糖化酶用量高于1.9%后，隨著糖化酶用量的增加，其還原糖含量趨于穩定。所以，確定糖化酶的最適用量為1.9%。

2.1.4 菠蘿蛋白酶用量對還原糖和氨基酸態氮含量的影響

青稞中含有淀粉顆粒結合蛋白，利用菠蘿蛋白酶水解蛋白質為氨基酸，不僅為酶解液提供了菌體生長所需的速效氮源，同時也有利于淀粉的酶解，提高酶解液中還原糖含量，使酶解液含有適宜的碳源和氮源，更有利于益生菌的生長和發酵，并提高益生菌青稞發酵飲料的營養價值[10]。本研究考察了菠蘿蛋白酶用量對還原糖和氨基酸態氮含量的影響，其結果見圖4。

由圖4可知，菠蘿蛋白酶可以明顯提高酶解液中氨基酸態氮和還原糖的含量，當菠蘿蛋白酶用量小于3.0%時，隨著酶用量的增加，氨基酸態氮和還原糖含量均呈增長的趨勢；當菠蘿蛋白酶用量為3.0%時，氨基酸態氮和還原糖的含量均達到最高值，分別為0.45 g/L和5.65%；當菠蘿蛋白酶用量大于3.0%時，隨著酶用量的增加，還原糖含量趨于穩定，而氨基酸態氮含量則略有降低。因此，最適菠蘿蛋白酶用量確定為3.0%。

2.2 響應面優化酶解工藝試驗

2.2.1 響應面法試驗設計及結果 依據Box-Behken試驗設計的統計學要求，以α-淀粉酶用量、糖化酶用量、菠蘿蛋白酶用量3個因素為自變量，以還原糖含量為響應值，設計了三因素三水平的響應面試驗組[11-12]，試驗因素水平見表1。

根據試驗因素和水平的相關要求，設計了17 次試驗，其試驗結果見表 2。

2.2.2 響應面試驗結果與分析 應用Design-Expert 8.0.5.0統計軟件，對表2中的試驗數據進行二次回歸分析，得到α-淀粉酶用量A、糖化酶用量B、菠蘿蛋白酶用量C3個因素與還原糖百分含量Y之間的多元二次回歸方程為：

Y=5.65+0.031A+0.040B+0.036C+0.015AB-0.012AC-0.015BC-0.029A2-0.037B2-0.004 25C2。

(1)

表3為Design-Expert 8.0.5.0統計軟件分析得出的多元二次回歸模型系數顯著性檢驗結果。

運用Design-Expert 8.0.5.0 軟件對表2的數據進行分析，得出二次回歸方程的響應面及等高線圖見圖5～7。

由圖5可知，α-淀粉酶用量和糖化酶用量對還原糖含量均有較大影響，且糖化酶用量對還原糖含量的影響大于α-淀粉酶用量的影響；等高線圖橢圓度較大，說明α-淀粉酶用量和糖化酶用量兩因素間交互作用顯著。

由圖6可知，菠蘿蛋白酶用量對還原糖含量的影響大于α-淀粉酶用量的影響；等高線圖橢圓度較大，說明α-淀粉酶用量與菠蘿蛋白酶用量兩因素間交互作用顯著。

由圖 7 可知，糖化酶用量和菠蘿蛋白酶用量對還原糖含量均有較大影響，且糖化酶用量對還原糖含量的影響大于菠蘿蛋白酶用量的影響；等高線圖的橢圓度較大，說明糖化酶用量和菠蘿蛋白酶用量兩因素間交互作用顯著。

2.2.3 最佳工藝條件的驗證

由Design-Expert 8.0.5.0軟件得到優化后的青稞酶解液制備工藝，確定最佳工藝參數為：料水比1∶15(g/mL)，糖化酶用量2.03%，α-淀粉酶用量8.90 U/g·青稞，菠蘿蛋白酶用量3.50%，預測的還原糖含量為5.69%。根據最佳酶解工藝參數，考慮實驗的可操作性，以料水比1∶15(g/mL)，糖化酶用量2.0%，α-淀粉酶用量8.9 U/g·青稞，菠蘿蛋白酶用量3.5%，進行3組平行實驗，實驗測得值還原糖含量為5.68%，與理論值的相對誤差為0.17%；其氨基酸含量為0.47 g/L。采用響應面法優化法得到的青稞酶解液制備的最佳工藝條件與實際相符合。

3 結論

(1) 本研究采用程序升溫法對青稞進行酶解，運用響應面法對青稞酶解液制備工藝進行了優化，結果表明α-淀粉酶用量、糖化酶用量、菠蘿蛋白酶用量3個因素對青稞酶解液的還原糖含量均有極顯著影響，3個因素兩兩間的交互作用對還原糖含量也有顯著影響。益生菌發酵青稞酶解液的最佳工藝條件為：按料水比1∶15(g/mL)溶解青稞粉，經糊化后冷卻至45 ℃，加入8.9 U/g·青稞的α-淀粉酶和原料質量2.0%，3.5%的糖化酶、菠蘿蛋白酶，保溫20 min后，再升溫到60 ℃保溫酶解直至碘試液體呈無色，過濾得到青稞酶解液，此條件下制備的青稞酶解液的還原糖、氨基酸態氮含量分別為5.68%、0.47 g/L。

(2) 本研究利用由α-淀粉酶、糖化酶、菠蘿蛋白酶組成的復合酶協同作用和程序升溫法對青稞進行酶解，使所制得的酶解液中同時含有碳源、氮源和益生元，可作為制備益生菌發酵青稞飲料的良好基質。

[1] 臧靖巍, 闞建全, 陳宗道, 等. 青稞的成分研究及其應用現狀[J]. 中國食品添加劑, 2004(4): 43-46.

[2] 黨斌, 楊希娟, 劉海棠. 青稞加工利用現狀分析[J]. 糧食加工, 2009, 34(9): 69-71.

[3] 王鵬珍, 牛忠海, 張世滿, 等. 青稞原料營養成分淺析[J]. 釀酒科技, 1997, 81(3): 30-31.

[4] 廖文艷, 周凌華, 王蔭榆, 等. 近年來益生菌腸道功能作用機制及研究方法的進展[J]. 中國微生態學雜志, 2011, 23(2): 184-189.

[5] 李琴, 張世春, 曾曉燕, 等. 益生菌營養及保健作用[J]. 食品研究與開發, 2004, 25(2): 106-108.

[6] MARTENSSON O, OSTEB R, HOLST O. The effect of yoshurt culture on the survival of probiotic bacteria in oat-based, non-dairy products[J]. Food Research International, 2002(35): 775-784.

[7] 縱偉, 盛欣昕, 譚洪卓, 等. 益生菌發酵苦蕎粉酶解液制備工藝研究[J]. 食品與機械, 2009, 25(3): 14-17.

[8] 萬萍. 食品分析與實驗[M]. 北京: 中國紡織出版社, 2015.

[9] 顧國賢. 釀酒工藝學[M]. 2版. 北京: 中國輕工業出版社, 2012: 113.

[10] 王春萍, 高麗鵑, 潘志芬, 等. 青藏高原青棵農家品種淀粉顆粒結合蛋白組成及GBSSI基因5前導序列的多態性[J]. 作物學報, 2012, 38(7): 1 148-1 154.

[11] 萬萍, 張宇, 楊蘭, 等. 響應面法優化苦蕎干黃酒主發酵工藝[J]. 食品與生物技術學報, 2015, 34(11): 1 185-1 191.

[12] 李秀霞, 王珍, 李嬌, 等. 響應面法優化鹽藻油的超聲波輔助提取工藝[J]. 食品與發酵工業, 2012, 38(8): 203-207.

Optimizationon preparation technology of highland barley enzymolysis liquid suitble for probiotic fermentation

WAN Ping1YIXiao-cheng2DENGJuan1HUANGLi-hua1

(1.CollegeofPharmacyandBiologicalEngineering,ChengduUniversity,Chengdu,Sichuan610106,China; 2.DepartmentofWineandFoodEngineeringSichuanTechnologyBusinessCollege,Dujiangyan,Sichuan611830,China)

The program warming method was applied to carry out the enzymatic hydrolysis of highland barley. The response surface methodology was used to optimize the enzymatic hydrolysis process of probiotic fermented barley with the reducing sugar content as the response value. The result indicated that the optimal conditions could be gotten: with the ratio of solid to liquid 1∶15(g/mL) to dissolve highland barley powder, pasting and cooling to 45 ℃, addition of 8.9 U/gα-amylase, 2.0% glucoamylase, 3.5% bromelain, incubating for 20 min and then heating to 60 ℃, incubating for saccharification to the iodine test showing colorless, getting highland barley enzyme saccharification liquid by filtration. Under the condtion, the content of reducing sugar was up to 5.68% and the content of amino acid nitrogen was 0.47 g/L, which could be used to produce probiotic fermented highland barley beverage.

highland barley; enzymatic hydrolysate; reducingsugar; program warming method; probiotic fermentation liquid

四川省教育廳科研項目(編號：12ZA205)

萬萍，女，成都大學副教授。

易曉成(1962—)，男，四川工商職業技術學院講師。 E-mail:562248038@qq.com

2016-12-22

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.036