清肝滋腎中藥對高脂喂養自發性高血壓大鼠肝臟組織Sirt1蛋白表達的影響*

占美錦張簫簫殷曉威嚴 羽任煒煒蔣衛民

（1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210000；2.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029）

·研究報告·

清肝滋腎中藥對高脂喂養自發性高血壓大鼠肝臟組織Sirt1蛋白表達的影響*

占美錦1張簫簫1殷曉威1嚴 羽1任煒煒1蔣衛民2△

（1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210000；2.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029）

目的觀察清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號）對高脂喂養的自發性高血壓（SHR）大鼠肝臟組織Sirt1蛋白表達及肝細胞脂肪浸潤的影響。方法18只4周齡雄性SHR大鼠，隨機分為正常飲食對照組（普通飼料+安慰劑）、高脂飲食模型組（高脂飼料+安慰劑）及清肝滋腎中藥組（高脂飼料+針箭顆粒Ⅱ號），每組大鼠均為6只，干預8周后取各組大鼠肝臟組織，采用Western blotting法檢測Sirt1及其裂解酶Caspase1蛋白的表達，并分別進行HE染色、油紅O染色觀察肝臟細胞脂肪浸潤情況。結果與正常飲食對照組相比，高脂飲食模型組Sirt1蛋白表達降低，Caspase1表達水平顯著增高 （P＜0.001）；與高脂飲食模型組相比，清肝滋腎中藥組Sirt1蛋白表達水平升高，Caspase1表達水平明顯下降（P＜0.05）。HE染色及油紅O染色顯示高脂飼料喂養導致肝臟組織結構紊亂，大量脂肪浸潤，清肝滋腎中藥組脂滴密度和大小較高脂模型組均有顯著降低。結論清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號）能顯著上調高脂喂養SHR大鼠肝臟組織Sirt1蛋白的表達，顯著減輕SHR大鼠的肝臟脂肪浸潤，從而在改善高血壓相關代謝障礙中發揮重要作用。

高血壓 高脂 清肝滋腎 Sirt1

高血壓是一種以動脈血壓持續升高為特征的進行性“心血管綜合征”。隨著社會經濟的發展，人們生活方式及飲食結構改變，臨床中高血壓合并不同程度、形式的代謝紊亂越來越常見，帶來的心腦血管疾病風險也明顯增高［1-3］，但其發生機制還不十分明確。Sirt1是一種NAD+依賴的組蛋白脫乙酰基蛋白酶，研究表明，它能參與體內眾多蛋白酶和轉錄因子的活性調節，發揮改善胰島素抵抗，調節糖脂代謝，干預代謝紊亂的作用［4-5］。Caspase1作為一類蛋白裂解酶能在高脂飲食等誘發的炎癥發應過程中被激活，并通過選擇性剪切Sirtl，使Sirt1表達下調［6-7］。清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號）的前期研究已證實在穩定血壓的同時，具有改善胰島素抵抗、糖脂異常等高血壓相關代謝紊亂的作用［8-9］。本實驗通過觀察其對高脂誘導SHR大鼠肝臟組織Sirt1蛋白表達及脂肪浸潤的影響來探討清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號）改善高脂誘導的SHR大鼠代謝紊亂的作用機制，為臨床進一步拓展其應用提供依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 18只4周齡雄性SHR大鼠，體質量（102.50±5.54）g，購自北京維通利華公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物與試劑 大鼠普通飼料由南京中醫藥大學GLP中心提供，高脂飼料 （Rodent diet with 60%kcal fat irradiated）、0.5%纖維素鈉安慰劑均由南京普克泰生物技術中心提供，清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號，由鬼針草、鬼箭羽、玄參等6味組成）由江蘇省中醫院制劑室供應。GAPDH、羊抗兔IgG-HRP（江蘇凱基生物科技發展有限公司），Sirt1（武漢三鷹13161-1-AP），ECL檢測試劑盒、全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、Western blotting檢測試劑盒、Braford蛋白含量檢測試劑盒、預染蛋白分子量、麗春紅染色液、蘇木素-伊紅染液試劑盒及FBS（江蘇凱基生物科技發展有限公司），顯色液、定影液（無錫市靈琦服務用品廠）。

1.3 分組與造模 18只4周齡雄性SHR大鼠自由攝食飲水，適應性喂養2周后（6周齡），隨機分成3組，即正常飲食對照組、高脂飲食模型組、清肝滋腎中藥組，每組大鼠均為6只。正常飲食對照組給予普通飼料喂養及等劑量的0.5%纖維素鈉安慰劑，高脂飲食模型組予高脂飼料喂養及等劑量的0.5%纖維素鈉安慰劑，清肝滋腎中藥組給予高脂飼料及針箭顆粒［（22.5 g/（kg·d）］混懸液2 mL進行灌胃，共灌胃8周。

1.4 標本采集與檢測 灌胃結束后，處死大鼠提取肝臟組織，冰水浴中冷0.9%氯化鈉溶液沖洗，4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋備用。另取8 mm×8 mm肝臟組織置于10%中性甲醛溶液中固定，OCT包埋后，制成4~ 5 μm冷凍切片行油紅 O染色。1）肝組織Sirt1及 Caspasel蛋白表達的檢測。取凍存的肝組織，切成小塊，加入FBS均液沉淀，吸取上清放入Buffer緩存液反復離心后提取胞漿蛋白和核蛋白，用Braford法進行蛋白定量，根據要求制膠，取適量待測樣品蛋白加入染液中測定OD值，經SDS-PAGE電泳后，凝膠上鋪上NC膜進行轉模，再加入5%脫脂奶粉室溫封閉1~2 h，用TBST洗膜10 min×3次，加入含一抗的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜，TBST洗10 min×3次。二抗室溫搖床震蕩1~2 h后，TBST洗膜10 min×3次，最后顯影成像，使用Gel-Pro32軟件對結果進行灰度分析，GAPDH作內參照。2）蘇木精-伊紅（HE）染色制片檢測肝臟的病理變化。取實驗大鼠肝臟組織石蠟切片按常規方法進行脫蠟，水合，將切片用二甲苯浸泡5 min，更換二甲苯后再浸泡5 min；分別用無水乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；70%乙醇中浸泡5 min，PBS浸洗3 min×3次；根據蘇木素-伊紅染液試劑盒 （中國江蘇凱基生物科技發展有限公司KGA224）操作步驟完成染色過程。3）油紅O染色制片檢測肝臟的病理變化。取新鮮肝臟組織制成冰凍切片，厚度4~5 μm；將標本置入60%異丙醇中浸10 min；入油紅O染液中浸染，室溫3~4 h；入60%異丙醇分化至背景無色；自來水沖洗1~3 min；蘇木素復染；再予自來水沖洗1~3 min；甘油明膠封片。

1.5 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件分析。計量資料以（s）表示，兩組間均數比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 清肝滋腎中藥對高脂喂養SHR大鼠肝臟組織Sirt1和Caspase1蛋白表達的影響 見表1、圖1。與正常飲食對照組相比，高脂飲食模型組肝臟組織Sirt1蛋白表達明顯下降，Caspase1蛋白表達顯著升高（P＜0.001）；與高脂飲食模型組比較，清肝滋腎中藥組肝臟組織Sirt1蛋白表達上調，Caspase1蛋白表達降低（P＜0.05）。

表1 清肝滋腎中藥對高脂喂養SHR大鼠肝臟組織Sirt1、Caspase1蛋白表達的影響（s）

表1 清肝滋腎中藥對高脂喂養SHR大鼠肝臟組織Sirt1、Caspase1蛋白表達的影響（s）

與正常飲食對照組比較，*P＜0.001；與高脂飲食模型組比較，△P＜0.05。

組 別 n Sirt1/GAPDH Caspase1/GAPDH正常飲食對照組 6 0.617±0.021 0.070±0.010高脂飲食模型組 6 0.143±0.047*0.570±0.095*清肝滋腎中藥組 6 0.303±0.081△0.173±0.086△

圖1 各組大鼠肝臟組織Sirt1、Caspase1蛋白表達電泳條帶

2.2 肝臟組織HE染色、油紅O染色結果 見圖2。HE染色光鏡觀察正常飲食對照組大鼠肝小葉結構清晰，細胞索整齊，核結構清晰，肝細胞無明顯病理改變；高脂飲食模型組大鼠肝組織結構紊亂，部分肝細胞脂肪變性、沉積，呈大泡樣改變；清肝滋腎中藥組中亦可見脂肪浸潤及脂肪空泡，但較高脂飲食模型組程度明顯減輕。正常飲食對照組大鼠肝臟沒有脂肪沉積，而高脂飲食模型組大鼠肝臟組織可見密集的脂滴，顯示大量脂肪浸潤，而清肝滋腎中藥組脂滴密度和大小較高脂飲食模型組均有顯著降低，表明清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號）干預后可顯著改善肝臟脂肪沉積。

圖2 各組SHR大鼠肝臟組織學檢測結果

3 討 論

高血壓是最常見的一種心腦血管疾病，以往多單純將其歸為血流動力學異常疾病范疇，隨著對其病機認識的深入，明確其發生發展與肥胖、血脂異常、高血糖、胰島素抵抗等代謝紊亂之間存在著密切的關系。眾多研究也證實，在高血壓患者人群中單純高血壓患者只占少數，絕大多數高血壓均合并有不同形式的代謝紊亂［10］。因此，新的防治策略中，在強調降壓達標的同時，更重視已明顯發生或存在潛在發生風險的與高血壓密切相關的各種代謝紊亂，從而最大程度地降低高血壓患者的心腦血管風險。肝臟組織是調控機體糖脂代謝的重要組織器官，也是糖脂代謝紊亂的靶器官，研究表明，高脂飲食及肥胖可通過慢性炎癥、氧化應激、脂質沉積等機制引起肝臟、肌肉等組織中出現脂肪的異位累積，導致機體糖脂等代謝紊亂［11-13］，沉默調節蛋白1（Sirt1）屬于一類具有多種生理功能的蛋白去乙酰化酶，在哺乳動物的肝臟、脂肪組織、肌肉等多種器官、組織中廣泛表達，其與SIR2的同源性最高，也是近年來Sirtuins家族成員中得到最深入研究的一項，在人體內，Sirt1通過調控多種控制代謝和胰島素信號通路的轉錄因子，來參與體內眾多生理功能的調節，在糖脂代謝、炎癥反應、胰島素分泌等過程中發揮著重要的調節作用［14-16］。即機體可通過升高或降低Sirt1表達水平，來發揮其調節相關的轉錄因子的活性，從而起到影響物質代謝平衡的作用。清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號）是導師蔣衛民教授基于對高血壓相關代謝紊亂的中醫基本病因病機的探索，對既往已被基礎及臨床研究證實可以明確改善高血壓相關代謝障礙的針箭顆粒組方的進一步優化，并通過本研究進一步探討其改善高血壓代謝紊亂的機制。本實驗通過分析高脂飲食SHR大鼠和正常飲食SHR大鼠及清肝滋腎中藥干預后的大鼠肝臟組織Sirt1蛋白的表達水平變化，發現與正常飲食對照組比，高脂飲食模型組Sirt1蛋白表達顯著下調，其裂解酶Caspase1蛋白表達升高（P＜0.001），與高脂飲食模型組相比，清肝滋腎中藥干預后肝臟組織Sirt1蛋白表達水平明顯上調，Caspase1蛋白表達也出現顯著降低（P＜0.05），提示清肝滋腎中藥（針箭顆粒Ⅱ號）可能通過抑制Caspase1活性，上調Sirt1蛋白表達，而發揮其改善高血壓相關代謝紊亂的作用，但其作用的確切機制還待今后的研究中設計Sirt1基因敲除相關動物模型的實驗來證實。

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Effect of Qinggan Zishen Chinese Medicine on Sirt1 Protein Expression in Liver Tissue of Spontaneously Hypertensive Rats Fed with High Fat Diet

ZHAN Meijin，ZHANG Xiaoxiao，YIN Xiaowei，et al.Nanjing U-niversity of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210000，China.

Objective：To investigate the effect of Qinggan Zishen traditional Chinese medicine（Zhenjian granuleⅡ）on the expression of Sirt1 protein in liver tissue and fatty infiltration in hepatocytes of spontaneously hypertensive rats（SHR）fed with high fat diet.Methods：Eighteen male SHR aged 4 weeks were randomly divided into the normal diet group（normal diet+placebo），the high-fat diet model group（high fat diet+placebo）and the Qinggan Zishen herbs group（high fat diet+Zhenjian granuleⅡ）.After 8 weeks of intervention，the liver tissues of rats were taken，and the expression of Sirt1 and Caspase1 protein was detected by Western blotting method，and the fatty infiltration of hepatocytes was observed by HE staining and oil red O staining respectively.Results：Compared with the normal diet group，the expression of Sirt1 protein in the high-fat diet model group was lower，and the expression level of Caspase1 was significantly higher（P＜0.001）.Compared with the high-fat diet model group，the Qinggan Zishen herbs group increased the expression level of Sirt1 protein，the expression level of Caspase1 was decreased obviously（P＜0.05）.HE staining and oil red O staining showed that the liver tissue structure disorder and large amount of fat infiltration were caused by high fat diet，and the density and size of lipid droplet in the Qinggan Zishen herbs group were significantly lower than those of the high-fat diet model group.Conclusion：Qinggan Zishen traditional Chinese medicine（Zhenjian granuleⅡ）can significantly raise the expression of Sirt1 protein in liver tissue of spontaneously hypertensive rats（SHR）fed with high fat diet，and markedly reduce the fatty infiltration of liver in SHR rats，and thus playing an important role in improving hypertension-related metabolic disorders.

Essential hypertension；High fat；Qinggan Zishen herbs；Sirt1

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0381-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.002

2016-12-10）

國家自然科學基金資助課題（81373605）；江蘇省中醫藥局資助課題（LZ13030）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（PAPD）

△通信作者（電子郵箱：jwm0410@163.com）