腎腦復元湯對MCAO大鼠腦保護作用及cyt-C，Caspase-9，Caspase-3的影響*

胡國恒劉 侃尹美美葛臻略

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208）

·研究報告·

腎腦復元湯對MCAO大鼠腦保護作用及cyt-C，Caspase-9，Caspase-3的影響*

胡國恒1△劉 侃2尹美美2葛臻略2

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208）

目的探究腎腦復元湯對MCAO大鼠腦保護作用，探討其腦保護機制與cyt-C，Caspase-9，Caspase-3表達的關系。方法72只SD大鼠造模成功后隨機分為假手術組、模型組、中藥組，根據(jù)治療后處死時間每組再隨機分為3、7、14 d 3個亞組，比較各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積，并采用Western blot法檢測各組腦組織cyt-C，Caspase-9，Caspase-3的蛋白表達。結果各時間點神經(jīng)功能缺損評分比較顯示，中藥組較模型組有明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）；腦梗死體積比較顯示，中藥組在各時間點腦梗死體積均明顯小于模型組 （P＜0.01）；中藥組3、7、14 d腦組織cyt-C、Caspase-9、Caspase-3表達均低于模型組 （P＜0.05或P＜0.01）。結論腎腦復元湯能促進MCAO大鼠神經(jīng)功能恢復，減小腦梗死體積，其機制可能通過抑制線粒體cyt-C釋放，減少Caspase-9、Caspase-3表達發(fā)揮對MCAO大鼠腦保護的作用。

腦保護 腎腦復元湯 細胞色素C Caspase-9 Caspase-3

缺血性中風又稱腦梗死，是指各種原因所致腦部血液供應障礙，導致局部腦組織缺血、缺氧性壞死，進而出現(xiàn)相應神經(jīng)功能缺損的一種疾病［1］。線粒體作為能量工廠為細胞活動提供必要能量，同時還具有傳遞電子、貯存鈣離子、抗氧化等重要生理作用。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體在細胞凋亡過程中起著中心調控作用，可以通過調控細胞色素C（cyt-C）的釋放，激活半胱氨酸-門冬氨酸特異蛋白酶（Caspase）通路，掌控著細胞的生存或死亡［1-2］。腎腦復元湯具有補腎益氣、活血祛瘀的功效，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腎腦復元湯能通過抑制炎癥因子釋放，促進神經(jīng)營養(yǎng)因子表達，改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能，從而起到腦保護作用［3-4］。本研究擬從腎腦復元湯對cyt-C，Caspase-9，Caspase-3表達的影響，探討腎腦復元湯對MCAO大鼠腦保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠72只，體質量（260±20）g，斯萊克景達實驗動物公司提供，許可證號：SYXK（湘）2011-0003，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，許可證號：SYXK（湘）2009-0001。

1.2 試藥與儀器 腎腦復元湯：熟地黃10 g，黃芪30 g，山茱萸10 g，山藥15 g，川芎10 g，紅景天20 g，丹參10 g，牡丹皮10 g，赤芍10 g，當歸尾10 g，地龍10 g。所用藥物均為道地藥材，購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。采用自動煎藥壺煎煮，煎煮方法：第一煎加水500 mL，煎取200 mL湯汁；第二煎加水300 mL，煎取150 mL湯汁；2次湯藥混合后置于60℃水浴鍋內蒸發(fā)濃縮至含生藥2 g/mL，待冷卻后置于4℃冰箱冷藏備用。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（索萊寶生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物科技有限公司），cyt-C兔抗多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司），Caspase-9兔抗多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司），Caspase-3兔抗多克隆抗體（武漢博士德生物技術有限公司）；DYYBC型電泳儀（北京市六一儀器廠），GAS7301B型凝膠成像分析系統(tǒng) （美國Bio-Rad公司）。

1.3 造模方法 采用改良Zea Longa線栓法制作大鼠MACO模型［5］。動物禁水、禁食24 h后用10%水合氯醛（0.35 mL/100g）腹腔注射麻醉。頸前皮膚剪毛后以絡合碘消毒，從腹側頸部正中切開皮膚，往右下方分離頸部肌肉及筋膜，暴露頸總動脈；沿頸總動脈向上分離頸內動脈和頸外動脈，動脈夾夾閉頸內動脈，結扎頸總動脈及頸外動脈。頸總動脈剪一小孔，用專用線栓調整好角度后緩慢插入頸內動脈約20 mm處，稍有阻力時停止。大腦中動脈阻斷成功2 h后采用Zea Longa5分制進行神經(jīng)功能評分，分值在1~3分者為造模成功。假手術組麻醉后僅分離頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，不插線，不結扎血管。實驗中使用恒溫墊加溫，電子體溫計監(jiān)測，使大鼠體溫維持在（37.0±0.5）℃。

1.4 分組及給藥 所有SD大鼠參照隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、中藥組，各組再根據(jù)處死時間分為3、7、14 d 3個亞組，每個亞組8只大鼠。造模24 h后，假手術組、模型組予灌胃等量蒸餾水，中藥組予腎腦復元湯灌胃。大鼠灌胃中藥劑量根據(jù)成人每日服用145 g生藥劑量進行體表面積比值換算［6］，灌藥體積均為20 mL/kg，每日灌胃1次。經(jīng)預實驗已證明本方中藥劑量因素對藥效的影響無顯著性差異，因此實驗中只選用臨床常規(guī)使用的中藥劑量。

1.5 標本采集及檢測 1）神經(jīng)功能缺損評分：各組于造模后2 h及處死前采用改良大鼠神經(jīng)功能缺損嚴重程度評分量表（m-NSS）［7］進行神經(jīng)功能缺損評分，各指標評分3次取均值納入結果。2）腦梗死體積測定：大鼠處死后迅速取出腦組織，從前囟前2 mm處，每隔2 mm做一冠狀切片，共切取5個層面。將切片浸泡于2%TTC溶液中，37℃，30 min，每5分鐘輕輕震蕩數(shù)次。采用Image J圖像分析軟件計算每片腦組織梗死面積，總梗死體積=總梗死面積×腦片厚度（2 mm），并通過修正公式計算腦梗死體積百分比：梗死體積百分比（%）=［總梗死體積-（梗死側半球體積-梗死對側半球體積）］/梗死對側半球體積×100%。3）腦組織cyt-C，Caspase-9及Caspase-3蛋白表達：Western blot法檢測，取各組凍存于-80℃冰箱的腦組織，加入細胞裂解液后采用超聲勻漿15 min，離心5 min，取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。各組取上清制備 50 μg蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉NC膜，分別加入cyt-C，Caspase-9，Caspase-3一抗抗體，37℃孵育2 h；TBST洗膜3次，分別加入辣根酶標記二抗，37℃孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液顯色。以β-action作為內參計算各組cyt-C，Caspase-9，Caspase-3條帶的灰度比值。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件。計量資料以（s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較 見表1。結果示，兩組在各時間點神經(jīng)功能缺損評分與治療前比較均有下降（P＜0.05或P＜0.01）。中藥組在給藥后第3、7、14天神經(jīng)功能缺損評分與模型組同時間點比較下降更顯著（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較（分，s）

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較（分，s）

與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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2.2 各組腦組織梗死體積比較 見圖1，圖2。結果示，給藥3 d后中藥組腦梗死體積小于模型組（P＜0.05）；給藥7 d及14 d后，中藥組腦梗死體積明顯小于模型組（P＜0.01）。

2.3 各組不同時間段cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達比較 見表2，圖3。結果示，假手術組cyt-C、Caspase-9、Caspase-3在各時間點表達均差別不大（均P＞0.05），模型組、中藥組cyt-C、Caspase-9、Caspase-3在各時間點表達均高于假手術組（均P＜0.01）。組內各時間點比較顯示，模型組、中藥組第3、7、14天cyt-C、Caspase-9、Caspase-3表達逐漸降低，組內比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或P＜0.01）。中藥組與模型組相應時間點組間比較顯示，中藥組cyt-C、Caspase-9、Caspase-3在各時間點表達均低于模型組，組間比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或P＜0.01）。

圖1 第7天各組大鼠腦組織TTC染色

圖2 各組腦組織梗死體積比較與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

圖3 各組不同時間段cyt-C，Caspase-9，Caspase-3蛋白表達比較

3 討 論

缺血性中風是以腦動脈硬化為基礎，以神經(jīng)功能缺損為主要表現(xiàn)的腦血管疾病，是我國目前三大致死致殘疾病之一［7］。中醫(yī)學對缺血性中風的病因病機早有認識，認為情志、痰瘀、氣虛、毒邪以及臟腑虧虛均可導致中風。《靈樞·經(jīng)脈篇》曰“髓與腦，皆精之類，精成而腦髓生”。說明腦為髓海，由腎精充盈匯聚而成，證實了腎與腦的化生關系。病機上《素問·逆調論》認為“腎不生，則髓不能滿”。說明腎氣虧虛，髓海失養(yǎng)，是導致腦病的基本病機。基于如上理論基礎，本課題組提出“從腎治腦、腎腦同治”理論，在補陽還五湯基礎上化裁而成腎腦復元湯，具有補腎益氣、活血祛瘀的功效，在臨床研究及動物實驗中均取得良好效果［8-9］。

表2 各組不同時間段cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達比較（s）

表2 各組不同時間段cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達比較（s）

與假手術組同時間比較，**P＜0.01；與模型組同時間比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與本組治療第3天比較，&P＜0.05，&&P＜0.01。

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腎腦復元湯藥物組成主要有熟地黃、山茱萸、山藥、黃芪、紅景天、牡丹皮、當歸尾、赤芍、地龍、丹參、川芎。方中以熟地黃、黃芪為君藥，熟地黃能養(yǎng)陰填精益髓，黃芪能大補元氣，兩者合用，精聚而生髓，氣行則瘀去。山藥補脾胃而養(yǎng)氣陰，山茱萸益肝腎而填精髓，共為臣藥；山茱萸與熟地黃合用助其補養(yǎng)肝腎，取“肝腎同源”之意。牡丹皮、赤芍、紅景天、當歸尾皆為活血之藥，且以丹皮、赤芍之涼血活血制山茱萸之性溫，以當歸尾養(yǎng)血活血之力助黃芪補氣行血之功，紅景天既能健脾益氣，又可活血化瘀，以上4味皆為佐藥。地龍入經(jīng)絡能搜風邪，入血脈能行氣血，帥諸藥通行全身，活血通絡。全方諸藥合用，共奏補腎益氣、活血祛瘀之效。

中風數(shù)小時內，腦組織被快速摧毀，大約每分鐘有190萬個神經(jīng)元因缺血缺氧發(fā)生凋亡，同時有140億個神經(jīng)突觸壞死［10］。線粒體的變化是決定細胞凋亡的關鍵，細胞凋亡過程中的多個重要程序都與線粒體密切相關，其中包括cyt-C的釋放及Caspase家族的激活［11］。Cyt-C位于線粒體內膜外側，在線粒體受損后釋放分泌到細胞質中，啟動細胞凋亡機制，是哺乳動物細胞體內細胞凋亡關鍵因素［12］。Caspase家族蛋白以非活性酶原形式存在于細胞質中，當細胞凋亡發(fā)生時，通過逐級活化蛋白水解，獲得生物活性，促進凋亡進程［13］。研究表明，釋放到細胞質的cyt-C與Apaf-1結合后形成Apaf-1-cyt-C復合體，其氨基酸CARD與Caspase-9酶原的CARD相互作用后形成復合體，在ATP的協(xié)助下活化Caspase-9酶原［14］，活化的Caspase-9進一步激活Caspase-3。Caspase-3是細胞凋亡的效應蛋白，特異性地加速凋亡進程［15］。由此可見，神經(jīng)細胞缺氧損傷后，線粒體受損，導致cyt-c的釋放，并激活Caspase-9及Caspase-3是引起中風后細胞凋亡的重要機制。

本研究顯示，中藥組在給藥后第3、7、14天神經(jīng)功能缺損評分與模型組同時間點比較均有下降，腦梗死體積在相應時間點明顯小于模型組，說明腎腦復元湯具有明確的腦保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，腎腦復元湯能抑制線粒體cyt-C釋放，減少大鼠腦組織Caspase-9及Caspase-3的活化表達，是其減輕神經(jīng)細胞損傷，保護腦細胞的潛在機制之一。

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Effect of Shennao Fuyuan Decoction on Cerebral Protection and Cyt-C，Caspase-9，Caspase-3 Expression in MCAO Rats

HU Guoheng，LIU Kan，YIN Meimei，et al.The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

Objective：To investigate the cerebral protection effect of Shennao Fuyuan decoction，find out its relation with the regulation of cyt-C，Caspase-9，and Caspase-3 expression.Methods：72 Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into 3 groups：sham operation group，model group，traditional Chinese medicine group（TCM group）.According to the executing time of 3，7，14 days，rats in each group were divided into three subgroups.Comparison of Neurological Severity Scores（NSS），volume of cerebral infarction among these groups was made.Western blot was used to explore the expression of cyt-C，Caspase-9，Caspase-3.Results：In comparison of NSS scores at every time point，TCM groups were lower than model groups，there were statistical differences between the two groups（P＜0.05 or P＜0.01）.In comparison of infarct volume at every time point，TCM groups were much lower than model groups；there were significant statistical differences between the two groups（P＜0.01）.In comparison of protein expression of cyt-C，Caspase-9，Caspase-3 at every time point，TCM groups were lower than model groups，there were statistical differences between the two groups（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Shennao Fuyuan decoction can promote the recovery of neurological function；decrease the infarct volume in MCAO rats.This cerebral protection effect is probably related to restraining the release of cyt-C in mitochondria，and reducing the expression of Caspase-9，Caspase-3.

Cerebral protection；Shennao Fuyuan decoction；Cyt-C；Caspase-9；Caspase-3

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0384-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.003

2016-12-08）

國家自然科學基金項目（81273751，81573941）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（CX2015B315，CX2015B326）

△通信作者（電子郵箱：hugh9198@163.com）