補肺通絡方對肺纖維化大鼠模型IL-4、TNF-α、TGF-β1活性表達影響的研究*

毛 毳李 佳鄒 燕彭艷紅

（1.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032）

·研究報告·

補肺通絡方對肺纖維化大鼠模型IL-4、TNF-α、TGF-β1活性表達影響的研究*

毛 毳1李 佳2鄒 燕1彭艷紅1

（1.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032）

目的研究補肺通絡方對博萊霉素所致大鼠肺纖維化模型的治療作用，以及對肺組織內IL-4、TNF-α、TGF-β1含量的影響，并初步闡釋其作用機制。方法將SPF級大鼠80只隨機分為4組，隨機分為對照組、模型組、西藥組（潑尼松）、聯合組（補肺通絡方+潑尼松）。采用氣管切開滴入博萊霉素方法建立大鼠肺纖維化模型，15 d后開始對西藥組及聯合組進行灌胃治療，觀察大鼠肺組織中IL-4、TNF-α、TGF-β1的含量及肺組織病理情況。結果檢測結果提示造模成功，西藥組、聯合組與模型組相比IL-4、TNF-α、TGF-β1含量均有統計學差異（P＜0.01）。結論補肺通絡方對肺纖維化大鼠模型有顯著療效，其機制可能與下調IL-4、TNF-α、TGF-β1等因子的表達有關。

補肺通絡方 肺纖維化 IL-4 TNF-α TGF-β1

特發性肺纖維化（IPF）是臨床中一種以慢性炎癥為主的間質性肺疾病，病因尚未有明確闡述，臨床特點主要為肺部出現成纖維細胞灶，同時出現細胞外基質（ECM）的沉積，導致肺泡結構及相關肺組織呈現出慢性、進行性破壞的現象。特發性肺纖維化的病理改變難以逆轉，是一種危險性極高的肺疾病［1］。由于其發病機制較為復雜，至今尚未完全明確，目前臨床上對特發性肺纖維化的治療主要使用糖皮質激素、細胞拮抗劑等［2］，但費用高，且副作用大，故尋求一種安全可靠的治療方法尤為重要。補肺通絡方為遼寧中醫藥大學附屬醫院臨床自擬方，依托國家重點專科絡病專科，在前期臨床實踐研究和文獻研究的基礎上進行動物實驗研究［3-5］。補肺通絡方具有平補陰陽，理肺通絡的功效。為探討其作用機制，本課題組選擇IL-4、TNF-α及TGF-β1作為檢測指標研究補肺通絡方對肺纖維化的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級大鼠80只，雌雄各40只，體質量（200±20）g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK遼2010-0001。

1.2 試藥與儀器 補肺通絡方中藥煎劑，組方：黃芪20 g，人參12 g，補骨脂12 g，當歸12 g，川芎12 g，半夏12 g，海藻12 g，鉤藤6 g，雞血藤12 g（所用藥物由遼寧中醫藥大學附屬醫院提供），藥材加水1000 mL浸泡30 min后煮沸30 min濾過取汁，再加水1000 mL煮30 min濾過取汁，合并2次藥液，水浴濃縮成含藥1 g/mL的藥液，高壓滅菌后分裝，4℃冰箱保存備用。博萊霉素（zeocin）（日本化藥株式會社高崎工廠，H20090885）；潑尼松片 （天津力生制藥股份有限公司，國藥準字H12020123）；10%水合氯醛；PBS緩沖液（pH=7.4）；IL-4試劑盒（美國bender，BMS613）、TNF-α試劑盒（上海博邁生物科技有限公司，96T）、TGF-β1試劑盒 （上海中喬新舟生物科技有限公司，96 tests）。勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司，DY89-II）；酶標儀（上海永創醫療器械有限公司，SM800）；離心機（上海趙迪生物科技有限公司，GL-25MS）；培養箱（上海森信實驗儀器有限公司，DRP-9052）。

1.3 分組與造模 造模分組前將實驗大鼠于實驗室內適應性喂養2 d（實驗室溫度控制在23~25℃；濕度控制在50%~60%），適應性喂養后觀察大鼠一般情況，確保實驗前大鼠的狀態良好，然后進行分組。采用簡單隨機數字表法，將大鼠分為對照組、模型組、西藥組（潑尼松）、聯合組（潑尼松聯合補肺通絡方），每組20只，雌雄不限，分開飼養。對照組不進行造模。其余3組于正式實驗第1天進行造模，選用10%水合氯醛（4 mL/kg），經腹腔注射將3組實驗鼠進行麻醉，大鼠麻醉后將博萊霉素（5 mL/kg）一次性注入大鼠氣管，形成大鼠肺纖維化模型，期間注意觀察大鼠生理狀態，于實驗第15天，完成大鼠肺間質纖維化造模。

1.4 給藥方法 依照體表面積公式［6］，參照人的體質量給藥量，計算出大鼠每天體質量的給藥量，在實驗第16天起，西藥組大鼠給予潑尼松（3 mL/kg）和生理鹽水的混合制劑（5 mL/kg）灌胃，聯合組大鼠用中藥煎劑（5 mL/kg）+潑尼松混合制劑 （3 mL/kg）灌胃，每天1次。在此期間對照組、模型組正常飼養。

1.5 標本采集與檢測 實驗進行至30 d，給藥結束后，限制大鼠進食不限制飲水，保證第31天取材時空腹時間8 h。實驗進行至31 d進行取材；麻醉采用10%水合氯醛腹腔注射；麻醉成功后于大鼠腹主動脈取血留存；摘取大鼠雙側肺葉，切取400~500 mg大鼠左肺下葉于冰浴條件下制備肺組織勻漿，并在4℃、3000 r/min條件下進行離心，時間為20 min，抽取上清液，送往生化實驗室檢測。TGF-β1、IL-12和TNF-α的含量采用ELISA方法檢測。大鼠右肺上葉用于做病理檢測，將右肺上葉采用10%甲醛進行固定，而后進行石蠟包埋切片的制備，而后染色觀察。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計分析軟件，計量資料以（s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。另外在數據符合正態分布時采用方差分析；在數據為非正態分布時采用秩和檢驗后，進行組間的非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 對照組大鼠狀態良好，體態正常，活動靈活，皮毛光亮，無脫毛，眼耳口鼻無異常分泌物，顏色淡紅；呼吸、飲食、排泄正常，無異常死亡；模型組大鼠消瘦明顯，行動緩慢，皮毛顏色暗淡無光澤，口鼻存在少量分泌物，口唇、耳、鼻色偏暗紅，飲食較少，大便不成形甚至出現稀溏現象，部分大鼠出現喘息氣促，但無異常死亡；西藥組大鼠體態偏瘦，活動量減少，皮毛色暗無光澤，口、鼻、耳分泌物量少，色暗紅，飲食偏少，出現大便稀溏現象，但無異常死亡；聯合組大鼠體態接近正常，但個別略瘦，皮毛光澤度欠佳，口、鼻、耳無異常分泌物，口唇色紅，飲食正常，大便正常但量稍多，質地黏稠，無異常死亡。

2.2 肺組織形態學變化 （外觀檢查） 對照組兩肺葉表面光滑，色澤粉紅明潤，飽滿；模型組表面凸凹不平，為暗紅色，肺葉成灰白色，表面有灰白色斑點，邊緣有點狀出血點；西藥組、聯合組部分肺葉表面光滑，部分呈暗紅色。

2.3 肺組織形態學變化（光鏡檢查）

2.3.1 HE染色 見圖1。對照組支氣管腔內整潔，外壁間質狹窄，肺泡壁薄，肺泡皺壁、內膜完整；模型組支氣管管腔存在脫落的黏膜上皮，外壁間質明顯增厚，局限性肌層增厚，肺泡壁大部分增厚，肺泡結構破壞，肺實質結構紊亂，局部炎細胞浸潤，西藥組、聯合組支氣管黏膜完整，肺泡壁大多較薄，支氣管壁輕度增厚或增厚不明顯，大多數肺泡壁較薄或增厚不明顯。

圖1 光鏡肺組織形態學變化（HE染色，20倍）

2.3.2 Masson染色 見圖2。對照組可見支氣管壁及血管壁內存在少量的膠原纖維，而肺泡壁和肺間質內大部分則為肌纖維組織；模型組可見支氣管壁、血管壁、肺泡壁及肺間質大量膠原纖維明顯增生，以大量的藍綠色膠原沉積模式為主，表現為灶性纖維形成，肺纖維化多為中重度。西藥組、聯合組支氣管壁、血管壁、肺泡壁及肺間質僅存在少量的膠原纖維增生，纖維化程度遠較模型組減輕。

圖2 光鏡肺組織形態學變化（Masson染色，20倍）

2.4 各組大鼠肺組織勻漿中IL-4、TGF-β1、TNF-α表達水平比較 見表2。模型組肺組織中TNF-α、TGF-β1及IL-4表達明顯高于對照組（均P＜0.01），說明模型組TNF-α、TGF-β1、IL-4增高屬于異常的病理狀態。治療后，西藥組及聯合組的大鼠肺組織勻漿中TNF-α、TGF-β1及IL-4表達均低于模型組，均有顯著差異（均P＜0.01）；聯合組TNF-α、TGF-β1及IL-4表達低于西藥組，差異具有顯著統計學意義（均P＜0.01）。故可認為補肺通絡湯可以明顯抑制大鼠肺組織中TNF-α、TGF-β1及IL-4的表達，從而延緩纖維化的進程。

表2 各組大鼠肺組織勻漿中IL-4、TGF-β1、TNF-α表達水平比較（ng/L，s）

表2 各組大鼠肺組織勻漿中IL-4、TGF-β1、TNF-α表達水平比較（ng/L，s）

與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.01。

組別 n 大鼠T N F -α（n g / L）I L -4（n g / L） T G F -β 1（n g / L）對照組 2 0 2 0 3 . 6 7 ± 2 . 6 7 1模型組 2 0 2 7 0 . 6 6 ± 2 . 3 0 3*西藥組 2 0 2 4 0 . 3 8 ± 1 . 9 8 9△4 . 7 8 ± 1 . 3 6 7 2 6 . 4 7 ± 1 2 . 8 9 7 . 8 2 ± 1 . 7 8 6*1 1 0 . 8 9 ± 1 8 . 8 9*6 . 5 6 ± 2 . 0 8 9△8 9 . 3 7 ± 1 7 . 4 8△聯合組 2 0 2 2 0 . 4 5 ± 1 . 6 7 6△▲5 . 6 8 ± 1 . 5 8 9△▲4 7 . 8 9 ± 1 8 . 9 0△▲

3 討 論

肺纖維化在臨床中早期特點是出現肺泡炎癥，中晚期特點是肺出現纖維化，屬于一種慢性進行性的復雜性疾病［7］。中醫亦無特定病名歸屬，大多數學者則根據肺纖維的發病特點、臨床表現、及病變趨勢等方面，將其劃分為中醫學 “肺痿”“肺痹”“肺脹”“咳喘”等范疇，其病位在肺，與脾腎兩臟相關密切，病機為本虛標實，即以肺氣虧虛為本，痰瘀互結阻于絡脈為標，故肺纖維化的治療關鍵在于平補肺氣，化痰祛瘀通絡，使氣虛得以糾正，臟腑氣機運行通暢，氣行則血行，肺宣發肅降權衡，通調水道規律，則痰瘀漸化，氣血津液運行恢復至正常，則臨床癥狀逐步好轉［8-9］。本實驗旨在研究補肺通絡方對肺纖維化的治療作用以及作用機制，縱觀全方，黃芪、人參補益肺脾，益氣活血；補骨脂補益肺腎，溫陽納氣；當歸、川芎辛香走竄，養血行血；半夏、海藻祛濕化痰，通暢肺氣；鉤藤、雞血藤通補肺氣、榮養肺絡。諸藥合用，肺吸入清氣攝納有節，氣血津液輸布正常，痰濁瘀血歸于正化，肺絡通暢，肺之氣血循脈絡流注不已，則肺體自安。現代藥理學認為［10］，人參總皂苷具有抗氧化損傷的作用，能夠保護纖維化的肺臟；黃芪多糖能夠調節細胞因子Th1/Th2的平衡及NO代謝，提高機體抗氧化能力；當歸多糖能夠改善肺功能和肺系數；川芎能夠改善機體自由基損傷，提高肺功能；異鉤藤堿能夠在肺動脈高壓及PASMCs增殖的作用下起到對肺部的保護作用。

近年來，特發性纖維化的發病機制一直是研究的重點，TH1/TH2細胞因子失衡學說［11-12］更是成為肺纖維化發病機制的研究熱點，因此筆者選取TH2型細胞因子IL-4、TNF-α及TGF-β1作為觀測肺纖維化治療程度的指標。TGF-β1是導致纖維化的機制成為近年來研究重點［13］，普遍認為TGF-β1主要是通過介導肺泡炎癥、損傷以及促進細胞外基質的沉積兩種作用途徑，誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，最終導致纖維化的形成。IL-4作為一種促纖維化細胞因子，主要通過促進B細胞的增殖、促進CD4+T細胞向Th2細胞分化和Th2細胞增殖以及產生炎性介質3種作用途徑直接刺激成纖維細胞的趨化、增殖和分化，促進膠原、纖連蛋白及細胞粘合素的合成［14］，促進肺組織纖維化。TNF-α在肺纖維化形成中發揮著重要。Sullivan的研究發現，在博萊霉素致纖維化的大鼠模型中，TNF-α通過啟動TNFRI、TNFRZ信號傳導，誘導TGF-β的表達，從而促進膠原合成和成纖維細胞增殖，從而確定TNF-α的促纖維化作用［15］。黃成亮［16］經臨床實驗證實，丹參聯合川芎可以通過可能與減少血清TGF-β1和TNF-α的含量，從而起到防治肺纖維化的目的。TGF-β1、IL-4、TNF-α均是導致纖維化的發病過程的主要細胞因子［17-19］，故被選為本實驗研究的效應指標，通過應用補肺通絡方治療本病，觀察3組指標的變化并解釋其作用機制。結果比較3組數據，模型組肺組織中，TGF-β1、IL-4、TNF-α的表達水平高于正常，說明高表達的3種指標屬于本病的一種病例狀態；治療后，西藥組以及聯合組的大鼠肺組織勻漿中，TGF-β1、IL-4、TNF-α表達均低于模型組，均有顯著性差異，證明無論是西藥組或是聯合組均可以降低TGF-β1、IL-4、TNF-α的水平，即均對特發性肺纖維化有治療作用；最后西藥組與聯合組進行組間比較：聯合組的大鼠肺組織勻漿中TGF-β1、IL-4、TNF-α表達均明顯低于西藥組，兩組結果具有顯著統計學差異（P＜0.01），證明聯合組的治療作用明顯優于西藥組，由此可以確定補肺通絡湯對特發性纖維化的治療作用。綜上所述，補肺通絡方能夠明顯降低TGF-β1、IL-4、TNF-α在肺組織勻漿的表達，從而起到防治肺纖維化的作用，且結果優于單純使用西藥潑尼松。

本研究基于肺纖維化的西醫發病機制以及中醫致病特點，在傳統經方“補肺湯”的基礎上加減，自擬補肺通絡方，經大鼠動物實驗證實，補肺通絡方可以明顯降低IL-12、TNF-α和TGF-β 3種指標在肺組織中的表達，從而起到抑制成纖維細胞在肺部的增殖，同時降低膠原的合成，達到減緩本病發病的進程的目的，為中醫學治療肺纖維化提供新的思路。

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Study on the Effect of Bufei Tongluo Decoction on the Expression of IL-4，TNF-α，TGF-β1 in the Rat Model of Pulmonary Fibrosis

MAO Cui，LI Jia，ZOU Yan，et al. Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110032，China.

Objective：To research on the therapeutic effect and influence of Bufei Tongluo decoction on the content of IL-4，TNF-α，TGF-β1 in lung tissue on pulmonary fibrosis rat model caused by zeocin and interpretate its mechanism.Methods：The SPF 80 rats were randomly divided into 4 groups，respectively group A（control group），group B（model group），group C（prednisone treatment group），group D（Bufei Tongluo decoction+prednisone treatment group）.Pulmonary fibrosis model was set up by tracheotomy driping zeocin.After 15 days，lavage treatment was applied to group C and group D.The content of IL-4，TNF-α，TGF-β1 in rat lung tissue and lung tissue pathology were observed.Results：Test result suggested model building success.Compared with model group，IL-4，TNF-α，TGF-β1 of prednisone treatment group，Bufei Tongluo decoction+prednisone treatment group had statistical significance（P＜0.05）.Conclusion：Bufei Tongluo decoction has significant curative effect on pulmonary fibrosis in rat model，the mechanism may be related to downgrade of IL-4，TNF-α，TGF-β1.

Bufei Tongluo decoction；Pulmonary fibrosis；IL-4；TNF-α；TGF-β1

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0397-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.007

2016-08-09）

遼寧省臨床能力建設項目（LNCCC-C04-2015）