羌歸膝舒丸對兔膝關節骨關節炎模型關節液IL-1、TNF-α水平的影響*

柴旭斌 周英杰

（河南省洛陽正骨醫院，河南 洛陽 471002）

·研究報告·

羌歸膝舒丸對兔膝關節骨關節炎模型關節液IL-1、TNF-α水平的影響*

柴旭斌 周英杰△

（河南省洛陽正骨醫院，河南 洛陽 471002）

目的觀察羌歸膝舒丸干預后膝OA模型兔膝關節液中IL-1、TNF-α含量的變化，探討羌歸膝舒丸治療膝骨性關節炎的作用機制。方法將42只新西蘭大白兔隨機抽出11只納入空白組，余納入模型組，模型組用管狀石膏伸直位固定右后膝5周制作膝骨性關節炎模型，完成造模后，隨機抽取空白組和模型組各1只兔子處死以驗證模型成功后，拆除造模組石膏。將沒有造模的剩余10只兔分為空白組（A組），造模成功的剩余30只兔隨機分為模型組（B組）、羌歸膝舒丸組（C組）、鹽酸氨基葡萄糖組（D組）。C組予以與60 kg體質量人等效劑量的羌歸膝舒丸懸濁液10 mL、D組予以與60 kg體質量人等效劑量的鹽酸氨基葡萄糖混懸液10 mL灌胃，A、B組予以10 mL蒸餾水灌胃，灌胃處理3周后處死，行各組肉眼觀察膝關節大體形態以及取股骨髁軟骨行光鏡觀察，ELISA法測定膝關節液中IL-1以及TNF-α含量。結果1）造模5周后，造模組膝關節出現明顯的退行性改變。2）治療后肉眼觀察B、C、D組較A組相比均有退變，C、D組的退變程度較B組輕。光鏡下B、C、D組均可見軟骨退變的病理變化。3）治療后B、C、D組與A組相比較關節液中IL-1和TNF-α含量明顯升高（P＜0.05），C、D組關節液中IL-1和TNF-α含量與B組相比有明顯減少（P＜0.05），治療后C組IL-1、TNF-α含量與D組比較無顯著差異（P＞0.05）。結論羌歸膝舒丸對兔膝關節骨性關節炎有防治作用，其機理可能是通過降低關節液中細胞炎性因子IL-1、TNF-α含量從而抑制軟骨的破壞，延緩骨性關節炎的進展。

膝骨性關節炎 羌歸膝舒丸 白細胞介素-1 腫瘤壞死因子

膝骨性關節炎（KOA）是一種慢性關節疾病，又稱為增生性關節炎、肥大性關節炎、老年性關節炎、骨關節病、軟骨軟化性關節病等，屬中醫學“骨痹”范疇［1］。流行病學調查顯示，膝骨性關節炎60歲以上患病率高達50%，而75歲以上人群中增至80%，且最終致殘率達53%，隨著人口的老齡化，這些數字還在上升［2］。

骨性關節炎的病理改變主要表現為關節軟骨的退行性變和不同程度的滑膜炎癥，炎性細胞因子作為生化信號，有刺激軟骨細胞釋放降解酶，加快病變進程的作用，是炎癥反應的始動因素［3］，且IL-1、TNF-α已被證實是OA發生中的關鍵炎性因子［4］。因此如能有效抑制關節液中IL-1、TNF-α等炎性細胞因子水平，將對本病產生積極的治療作用。結合目前羌歸膝舒丸（河南省洛陽正骨醫院內部制劑）在臨床上應用所取得的良好療效［5-6］，開展羌歸膝舒丸防治膝骨性關節炎的實驗研究，為早期干預膝骨性關節炎及治療提供可靠的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 42只成年健康6～8月齡新西蘭大白兔（由山東魯抗醫藥股份有限公司試驗動物室提供，體質量2.0 kg左右雄性。動物合格證號：SCXK＜魯＞2008-0002），于河南省洛陽正骨醫院SPF實驗室飼養，飼養環境：室溫18～20℃，濕度65%～70%，1籠1只，自由進食顆粒狀飼料及飲用自來水。

1.2 試藥與儀器 羌歸膝舒丸（河南省洛陽正骨醫院內部制劑）；生理鹽水 （洛陽市制藥廠，生產批號12111409，國藥準字：H41022738）；鹽酸氨基葡萄糖（浙江誠意藥業有限公司，生產批號：120901，國藥準字：H20070173）。戊巴比妥鈉（河南省洛陽正骨醫院實驗室提供）；蒸餾水（河南省洛陽正骨醫院實驗室）；IL-1酶聯免疫分析試劑盒 （美國R＆D公司由連云港市五交化生物有限公司代購，批號：E-EL-RB0013）；TNF-α酶聯免疫分析試劑盒（美國R＆D公司由連云港市五交化生物有限公司代購，批號：E-EL-RB0011）。

1.3 造模與分組 取新西蘭大白兔42只，先于實驗室適應性飼養1周后，按體質量大小將其各自編號隨后隨機抽取11只納入空白組（A組），剩余31只進行膝骨性關節炎動物模型的制作［7］。由同組人員共同協作，紗布浸濕乙醚將造模組兔子臨時麻醉后，取兔右后肢，將踝關節至髖關節處兔毛剪短至0.5 cm長，牽拉右后膝，使其處于伸直位，先于外層纏繞一層石膏棉，后用管狀石膏固定膝關節，固定范圍約為踝關節以上2 cm至髖關節下1.5 cm處，綁定的石膏層數約為9層，待石膏硬化后，于石膏外層臨時用細鐵絲纏繞固定（不加壓），可有效防止兔子咬噬，從造模當天開始計時，固定5周，期間密切關注如出現造模肢石膏松動、脫落或出現造模肢踝關節以下腫脹則將石膏立即卸掉重新石膏固定。固定5周后，隨機從空白組以及模型組各抽取1只兔子處死以驗證模型是否成功，將剩余30只造模后的兔子再次按隨機數字表法分別分入模型組（B組）、羌歸膝舒丸組（C組）以及鹽酸氨基葡萄糖組（D組）。

1.4 給藥方法 C組：予以與人等效劑量的羌歸膝舒丸：依據使用說明，60 kg人類使用劑量為12 g/d，依據Meeh-Rubner公式A（體表面積m2）＝K（系數）×W（體質量）2/3×10-4公式計算得出每只兔每天用藥量約1.16 g，將藥丸碾成粉末后，加入生理鹽水，配置成10 mL懸濁液進行灌胃。D組：予以與人等效劑量的鹽酸氨基葡萄糖：人每天使用劑量為1.5 g，同理換算得出兔每天使用劑量為約為0.15 g，取鹽酸氨基葡萄糖0.15 g加入生理鹽水配置成10 mL溶液進行灌胃。A、B組予以等容積的蒸餾水10 mL，所有組別均每日灌胃1次，所有組別均連續灌胃3周，灌胃時間均為每日早上9點。

1.5 標本采集與檢測 于末次灌胃24 h后，將實驗兔予以3%戊巴比妥鈉溶液經耳緣靜脈注射麻醉，將關節腔中液體盡量抽出，置入凍存管后放置于-20℃的普通冰箱中保存，分別按IL-1、TNF-α試劑盒說明書采用ELISA法測試關節液中IL-1、TNF-α含量。實驗兔完成關節液抽取后，經耳緣靜脈注入空氣5 mL處死，逐層分離膝關節結構，切斷前后交叉以及韌帶組織，分離股骨髁，于髁上離斷骨組織，保留整個髁部結構，置于4%甲醛溶液中，固定48 h后，將固定標本送至病理科，進行常規HE染色軟骨切片制備。

1.6 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件處理。研究中計量資料滿足正態性、方差齊性時采用單因素方差分析（LSD法），不滿足時采用秩和檢驗，檢驗水準取α＝0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 治療前各組兔膝關節肉眼大體觀察及病理切片觀察 見圖1，圖2。正常組：行動自如，膝關節無腫脹畸形等，關節主被動活動不受限制，解剖膝關節后可見股骨髁部關節面光滑，平整，無裂隙以及缺損，關節輪廓清晰，關節面呈淡藍色，色澤明亮，觸感較硬，關節液清亮，量少（圖1A）。模型組：拆除石膏后，活動明顯跛行，關節主動被活動受限，解剖膝關節后可見股骨髁關節面粗糙，不平整，色澤明顯發黃，內側髁形態學改變明顯，且部分軟骨面有剝離現象出現，觸感硬度較正常組降低，關節液量較正常組增多呈淡黃色，周圍可見部分骨質硬化區（圖1B）。治療前病理切片觀察：正常組軟骨組織結構清晰，表層光滑，幼稚軟骨細胞位于軟骨組織的淺層，單個排列，呈扁圓形，長軸與軟骨表面平行，成熟軟骨位于深層，體積明顯增大，為圓形或橢圓形，且團狀聚集分布，基質染色正常、均勻（圖2A）。模型組可見軟骨表層纖維化，外觀失去連續性，表面糜爛，可見明顯不規則裂隙形成，表層幼稚軟骨細胞數量明顯減少，結構不清，有碎裂現象。染色變淺，成熟的軟骨細胞數量亦減少，排列無明顯規律（圖2B）。由上對比可知模型組在肉眼觀察層面以及病理切片觀察上均與正常組有明顯區別，因此可認為骨性關節炎模型是成功的。

圖1 治療前兔膝關節肉眼大體觀察

圖2 治療前兔膝關節病理切片觀察

2.2 治療后各組兔膝關節肉眼大體觀察及股骨髁軟骨病理切片觀察 見圖3和圖4。正常組：股骨髁部關節面光滑，平整，輪廓清晰，軟骨面呈淡藍色，色澤明亮，觸感較硬（圖3A）。模型組：關節面粗糙不平整，可見部分糜爛潰瘍面，缺損深達軟骨深層，色澤暗發黃，內側髁形態學改變明顯，部分軟骨有剝離現象。關節周緣出現骨質增生區（圖3B）。羌歸膝舒丸組：關節軟骨外觀輪廓較清晰，軟骨面色澤呈白色，觸之硬度較正常組軟，表面可見小面積糜爛，周緣可見少量骨贅增生（圖3C）。鹽酸氨基葡萄糖組：關節軟骨外觀輪廓較清晰，軟骨面色澤呈白色，表面可見小面積糜爛，周緣可見少量骨贅增生，基本與羌歸膝舒丸組相近。（圖3D）。治療后病理切片觀察：正常組軟骨組織結構清晰，表層光滑，幼稚軟骨細胞位于軟骨組織的淺層，單個排列，呈扁圓形，長軸與軟骨表面平行，成熟軟骨位于深層，體積明顯增大，為圓形或橢圓形，且團狀聚集分布，基質染色正常、均勻（圖4A）。模型組軟骨組織結構分層紊亂，不清晰，表層糜爛，全層軟骨細胞數目均減少，以淺層幼稚軟骨細胞為甚，基質染色變淺不均勻 （圖4B）。羌歸膝舒丸組軟骨組織結構表層不光滑，有缺損以及裂隙，幼稚軟骨細胞層消失，中間層細胞結構清晰，數目增多，可見及部分軟骨細胞成簇出現，基質染色尚均勻（圖4C）。鹽酸氨基葡萄糖組：軟骨組織結構表層不光滑，有缺損以及裂隙，幼稚軟骨細胞層消失，表層明顯纖維化，軟骨細胞數目較正常組明顯增多并可見部分軟骨細胞成簇出現，基質染色尚均勻（圖4D）。

圖3 治療后各組兔膝關節肉眼大體觀察

圖4 各組股骨髁軟骨病理切片觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組兔關節液中IL-1、TNF-α含量比較 見表1。治療后B、C、D組IL-1、TNF-α含量高于A組 （P＜0.05），C、D組IL-1、TNF-α的含量低于B組（P＜0.05），C、D組的IL-1、TNF-α的含量差異不明顯（P>0.05）。

表1 各組兔關節液中IL-1、TNF-α含量比較（mg/L，s）

表1 各組兔關節液中IL-1、TNF-α含量比較（mg/L，s）

與A組比較，△P＜0.05；與B組比較，▲P＜0.05。

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3 討 論

膝骨性關節炎屬中醫學“痹證”范疇，其發病與肝、脾、腎三臟極為密切，本病多由機體內在肝腎不足、氣血虧虛、脾虛失運；加之外在風寒濕氣邪入侵、痰阻經絡、外傷勞損等外在因素共同作用于骨骼而致病［8］。目前大多學者認為本病屬本虛標實，肝腎虧虛為本，氣滯血瘀痰凝、風寒外邪侵襲、痹阻經絡為標，治療上宜活血化瘀，兼補肝腎。羌歸膝舒丸為洛陽平樂郭氏正骨經驗方，由羌活、當歸、赤芍、紅花、乳香、沒藥、獨活、牛膝、柴胡等10余味中藥組成，本方由羌活勝濕湯加減演變而來，方中羌活祛風濕，滑利關節，止痹痛；當歸、赤芍、紅花活血化瘀，消腫止痛；牛膝滋補肝腎，引血下行；乳香、沒藥活血行氣而止痛；柴胡疏肝解郁。全方具有散寒除濕、活血通經止痛、補腎疏肝的功效，對膝痹病有散寒通經、活血化瘀的功效［9-10］。諸藥合用活血而不傷血，理氣而不傷正，溫通而不燥，祛瘀而能生新。

炎癥反應中，IL-1可提高微血管的通透性并具有趨化作用，即使微血管通透性增高，又能提高中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞的趨化作用［11］。TNF-α能選擇性地抑制軟骨膠原產生，抑制蛋白聚糖合成，同時促其降解，與OA軟骨破壞及滑膜炎有一定關系［12］。因此，抑制IL-1、TNF-α所造成的滑膜炎性反應及關節軟骨的退變，成為防治OA的關鍵［13-14］。

通過實驗發現，造模5周后B組關節液中IL-1、TNF-α的含量較A組明顯增高，說明兔膝關節發生炎癥性改變，這與切片中病理學表現一致，說明本次實驗模型穩定可靠。C組治療后IL-1、TNF-α含量較B組降低，且形態學較B組改善，說明羌歸膝舒丸可能通過抑制兔膝關節積液中IL-1、TNF-α的含量，來降低炎癥因子對關節軟骨的破壞，為關節軟骨的修復提供環境。D組在治療后IL-1、TNF-α含量與C組無統計學差異，說明在治療后，羌歸膝舒丸可以達到與鹽酸氨基葡萄糖類似的療效［15-16］。

綜上所述，羌歸膝舒丸可能通過降低KOA發生環節中炎性細胞因子IL-1、TNF-α的含量，改善骨性關節炎實驗動物膝關節解剖學形態以及軟骨顯微結構，因此可以認為該復方可對軟骨細胞起到一定的保護以及修復作用，為羌歸膝舒丸的臨床作用提供一定的實驗理論依據。由于羌歸膝舒丸為復方，其中具體功用成分以及其對軟骨保護的其他相關作用機制仍需進一步實驗研究來完善。

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Influence of Qianggui Xishu Recipe on Level of IL-1，TNF-α in Synovial Fluid of Knee Osteoarthritis Model Rabbits

CHAI Xubin，ZHOU Yingjie. Luoyang Orthopedic Hospital of Henan Province，Henan，Luoyang 471002，China.

Objective：To explore the efficacy of Qianggui Xishu recipe in the treatment of the knee osteoarthritis by observing the effects of Electroacupuncture on cell factors IL-1and TNF-α.Methods：11 rabbits were picked among 42 New Zealand rabbits randomly as normal group（A group）.The rest as the model group was managed by the plaster immobilication with right posterior knee joint in extend excessive position.Then1 rabbit was picked randomly and executed from A group and model group to prove the model was successful after 5 weeks.Then the plaster was removed in the model group.The 10 rabbits left without modeling were taken as the normal group.The rest 30 modeled rabbits were randomly divided into 3 groups：B（model group），C（Qianggui Xishu recipe），and D（Glucosamine hydrochloride）.Group A-B were received 10 mL normal saline once daily. Group C were treated with QGXS recipe 1.16g once daily，group D with 0.15g Glucosamine hydrochloride once daily.All rabbits were executed after being treated for 3 weeks.The general condition of articular cartilage was observed with eye and microscope.The expression of transforming growth IL-1 and TNF-α in articular cartilage was detected by ELISA method.Results：1）The articular cartilage was degenerative of the rabbit in model control group.2）There were more or less degenerative changes of OA in group B，C，and D group by eye and microscope. No degenerative changes occurred in group A.The group B changed more seriously than C-D group.3）After the treatment of 3 weeks，the content of IL-1 and TNF-α of B，C，D groups were higher than that of A group.The differences were statistically significant（P＜0.05）.The content of IL-1 and TNF-α of C and D groups were higherthan that of B group.The differences were statistically significant（P＜0.05）.The content of IL-1 and TNF-α of C group were more than that of D group.But there were no obvious differences between group D and group C（P＞0.05）.Conclusion：The method of plaster immobilization with the knee joint in extend excessive position can successfully induce the model of KOA.The Qianggui Xishu recipe has the preventive and curative effects on Osteoarthritis by reducing IL-1 and TNF-α in the knee joint liquid to inhibit cartilage destruction and delay the progress of osteoarthritis.

Knee osteoarthritis；Qianggui Xishu recipe；Interlenkin-1；Tumor necrosis Factor-α

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0401-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.008

2016-12-14）

河南省重點中醫學科學術帶頭人基金培養項目（2100601）

△通信作者（電子郵箱：1099168230@qq.com）