全柱成像毛細管等電聚焦電泳分析蛋白質藥物電荷異質性

孟曉光，甄 里，劉悅玫，侯利平，劉 丹，李 斌，歐陽偉民，魏開華,5*

(1.北京正旦國際科技有限責任公司，北京 102206；2.北京蛋白質組研究中心，蛋白質組學國家重點實驗室，國家蛋白質科學中心(北京)，北京 102206；3.江漢大學 護理與醫學技術學院，湖北 武漢 430056；4.北京綠綿科技有限公司，北京 100080；5.軍事醫學科學院 放射與輻射醫學研究所，北京 100850)

全柱成像毛細管等電聚焦電泳分析蛋白質藥物電荷異質性

孟曉光1,2，甄 里3，劉悅玫1,2，侯利平1,2，劉 丹1,2，李 斌4，歐陽偉民4，魏開華1,2,5*

(1.北京正旦國際科技有限責任公司，北京 102206；2.北京蛋白質組研究中心，蛋白質組學國家重點實驗室，國家蛋白質科學中心(北京)，北京 102206；3.江漢大學 護理與醫學技術學院，湖北 武漢 430056；4.北京綠綿科技有限公司，北京 100080；5.軍事醫學科學院 放射與輻射醫學研究所，北京 100850)

評價了cIEF-WCID檢測多肽與蛋白質藥物等電點的應用效果。測定標準多肽的等電點，驗證了cIEF-WCID具有高的準確度和良好的重復性(相對標準偏差<0.50%)。人血紅蛋白的4種主要異構體實現了基線分離；甘賴胰島素的重復測試均只檢出單一特征峰(pI 5.95±0.01)；比較重組人生長激素原液和成品，等電點特征峰比例差異明顯，且成品有新特征峰出現；對比進口及國產貝伐單抗，發現廠家1、3與原研藥基本一致，廠家1的主成分遷移規律與原研藥高度一致，廠家2的重鏈C末端K缺失、N末端焦谷氨酸環化或脫酰胺修飾影響了電荷異質性；通過考察尿素濃度、電解質范圍和聚焦時間，優化了檢測重組人促卵泡素等電點條件：2 mol/L尿素，兩性電解質pH 2.5～5.0與pH 3.0～10.0按1∶1混合，聚焦電壓1 000 V(1 min)～1 800 V(4 min)～2 200 V(1 min)。cIEF-WCID可快速、準確測定具有電荷異質性的蛋白類藥物等電點，分辨率和重復性好，尤其是可以跟蹤聚焦過程中樣本的遷移特征，特別適合蛋白類藥物復雜電荷異質性的檢測。

全柱成像毛細管等電聚焦電泳；電荷異質性；重組蛋白質藥物；抗體；藥學研究

等電點(Isoelectric point，pI)反映了蛋白質藥物電荷與空間構象的均一性，是蛋白質藥物質量控制的必不可少的項目。全柱成像毛細管等電聚焦電泳(Capillary iso-electric focusing electrophoresis-whole column imaging detection，cIEF-WCID)是20世紀90年代Pawliszyn等開發出的一種新型生物大分子檢測技術，采用一個動態檢測器對整個毛細管分離柱內進行實時檢測，不僅能對樣品進行常規的分離，并且在分離的同時可提取出有關動態過程的動力學參數進行分析，從而獲取多肽與蛋白質藥物電荷與空間結構相關的更豐富信息[1-2]。Randall[3]成功解析了血紅蛋白的主要電荷異構體，最近，Pawliszyn等[4]將硼酸親和富集糖蛋白再通過cIEF-WCID成功檢測到糖蛋白的電荷異構體精細分布，還通過傅立葉變換分析建立了擴散系數精確分析技術，使得cIEF-WCID開始向理論研究進展[5]。cIEF-WCID彌補了傳統cIEF的不足，為生物大分子藥物測定精確pI創造了有利條件，在分辨率、準確性和重復性等方面優勢突出，適用于蛋白質分析的基礎研究、質量標準和法規檢測。

目前，關于cIEF-WCID對蛋白質聚焦過程的跟蹤還鮮有報道，本研究采用cIEF-WCID分析不同分子量、不同復雜程度的蛋白質藥物樣本，包括甘賴脯胰島素、重組人生長激素(rhGH)、重組人促卵泡激素(rhFSH)、貝伐單抗與Avastin，并實時跟蹤抗體等藥物的聚焦過程，觀察到多數蛋白質具有“雙軌跡聚焦”的共同特征，從而對于更精細評價蛋白質藥物的電荷異質性提供了一種新方法。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

甘賴脯胰島素、rhGH、rhFSH、貝伐單抗均為國內公司生產，純度均>99%。Avastin由國內企業外購(Roche，純度>99%)。Hemoglobin human購自Sigma公司，純度均>98%；WCID-FC毛細管柱(加拿大Advanced Electrophoresis Solutions，簡寫AES，100 μm×35 cm，有效長度5 cm)；載體兩性電解質HR AESlyte 3～10，HR AESlyte 6～10與SR AESlyte 2.5～5(AES，Lot#:101016,101027,101013)；1%甲基纖維素(MC，AES)，標準品(pI 4.65，5.12，5.91，6.14，6.61，7.05，7.40，7.65，7.90，8.18，8.71，9.22，9.33，AES，Lot#：P07-111714)，尿素(AMRESCO)，陰極電解液(0.1 mol/L NaOH)和陽極電解液(0.08 mol/L H3PO4)為分析純，購自國藥集團化學試劑北京有限公司；高速冷凍離心機3-30 K購自Sigma公司，實驗用水為Milli-Q(Millipore公司)制備。

1.2 實驗方法

cIEF-WCID為CEInfinite C01型(AES)。將待測樣本配制成10 mg/mL水溶液，取2 μL與100 μL電泳緩沖液混合(含4%兩性電解質3～10，2 mol/L尿素，0.25%MC，體積比)，加入合適的等電點標準品各0.75 μL，充分混勻，10 000 r/min離心3 min后取上清進樣。手動進樣方式進樣，單次進樣量3 μL。根據樣本特性設置適當的聚焦參數，一般為：1 000 V(1 min)～2 000 V(1 min)～3 000 V(4 min)。用CEInsight軟件采集CMOS全柱成像圖并自動轉換為色譜圖，檢測波長280 nm。

圖1 等電點標準品連續進樣4次的cIEF-WCID等電聚焦圖Fig.1 Isoelectric focusing results of pI standards detected by cIEF-WCID for 4 times

圖2 人血紅蛋白的cIEF-WCID等電聚焦圖Fig.2 Isoelectric focusing results of hemoglobin human detected by cIEF-WCID

2 結果與結論

2.1 準確度

將2種標準品(pI 6.61，5.12)進行等電點測定，重復3次，測定平均值分別為pI 6.62和pI 5.10，等電點的平均值相對標準偏差小于0.50%，準確度良好。

圖3 rhGH原液與成品的cIEF-WCID等電聚焦圖Fig.3 Isoelectric focusing results of rhGH stoste and product detected by cIEF-WCID

2.2 重復性

將等電點標準品(pI 5.12，6.61，7.65，8.71，9.33)與兩性電解質混合后連續進樣4次，結果見圖1。各標準品峰形和等電點基本一致，相對標準偏差小于0.50%，重復性良好。

2.3 分離能力

通過血紅蛋白(Hemoglobin human)異構體峰A，F，S，C的分離情況來考察本系統的分離能力。血紅蛋白與兩性電解質混合溶液的cIEF-WCID等電聚焦電泳圖(圖2)顯示，A1C(pI 6.94)與A(pI 6.97)，F(pI 7.06)，S(pI 7.21)，C(pI 7.44)基本達到基線分離，且實測各峰的等電點與文獻一致[3,5]，說明本方法的分離能力和準確度極高。

2.4 重組藥物電荷異質性分析

2.4.1 甘賴脯胰島素 甘賴脯胰島素是國內原創的一種新型胰島素類降糖藥，采用cIEF-WCID考察其批間一致性和聚焦特性。選用標準品pI 5.12和pI 6.61，連續進樣3次，測定結果均為單峰，等電點分別為5.95，5.95和5.96，相對標準偏差為0.10%，單次檢測僅需6 min。

2.4.2 重組人生長激素原液與成品的比對 rhGH是由191個氨基酸殘基或N端有一甲硫氨酸的192個氨基酸殘基組成的蛋白，有調整內分泌系統、激活并維護免疫系統正常工作等作用。rhGH成品包含泊洛沙姆188、氯化鈉、檸檬酸鈉和苯酚等有機小分子和鹽等添加物，有機酸、賦形劑和較高的離子強度可能影響rhGH電荷特性，通過cIEF-WCID可快速分析原液與成品的電荷差異，結果見圖3。由圖3可見，測得rhGH原液的等電點為5.31(相對含量1.4%)、5.57(相對含量98.6%)，rhGH成品的等電點為5.29(7.1%)、5.54(88.4%)和5.77(4.4%)。盡管原液和成品的共有組分等電點極為接近(相對標準偏差為0.38%)，但相對含量有一定差異，且成品中多1個峰(峰3)。通過對成品的輔料進行cIEF-WCID分析，并未檢出峰3，提示成品中可能含有rhGH相關的電荷異質物質，因此本品質量控制需重點關注。

2.5 國內外貝伐單抗的比對

阿瓦斯汀(Avastin)化學名“貝伐單抗”，是一種阻礙血管生成的藥物，抑制腫瘤產生、擴散和轉移。該藥物被美國FDA批準用于肺癌、結腸癌、直腸癌和乳腺癌的治療，是癌癥治療暢銷藥物，國內多家藥企進行了仿制。本文對國內3家仿制品及國外1家原研藥進行了cIEF-WCID比對，比較其等電點及各電荷異構體的遷移過程差異。

圖4為3個廠家仿制藥與原研藥Avastin的等電聚焦圖，等電點結果見表1。結果表明，3個廠家貝伐單抗與Avastin均檢測到5個等電點，位于8.24～8.60，各等電點的相對標準偏差均小于0.15%，國內貝伐單抗與國外Avastin的等電點分布一致。但各等電點的相對含量略有差異(表2)，廠家1與廠家3各組分的相對含量與Avastin均一致，廠家2等電點1，4，5雖與Avastin差異不大，但峰形不同，推測主要由重鏈C末端K缺失、N末端焦谷氨酸環化或脫酰胺修飾存在微量差異等原因導致，提示其各修飾體含量可能與Avastin略有不同。

表1 Avastin與多個廠家仿制藥的cIEF-WCID等電聚焦結果Table 1 cIEF-WCID results of Avastin and biosimilars from different manufacturers

表2 cIEF-WCID測定Avastin與多個廠家仿制藥的相對含量Table 2 cIEF-WCID quantitation results of Avastin and biosimilars from different manufacturers

圖5 cIEF-WCID監測Avastin等電聚焦圖的動態過程Fig.5 Dynamic focusing process of Avastin monitored by cIEF-WCID

圖5為Avastin的動態聚焦過程。由圖可知，聚焦開始時，電壓1 000 V，Avastin與標準品同時從兩極向中部移動，暫未分離。隨著聚焦時間延長、電壓升高，Avastin與等電點標準品出現分離，分別向其pI移動(見圖5移動趨勢線)。聚焦到一定程度時為單一色譜峰，且隨聚焦時間延長峰形未發生明顯改變，此時聚焦完成。該位置即為其pI。

以Avastin的聚焦過程為基準，選取主成分X1與X2，比較國內廠家貝伐單抗與Avastin的聚焦規律。明顯得出，廠家1 X1與X2的聚焦過程幾乎與Avastin一致。廠家2 X1與X2的聚焦過程與Avastin存在一定差異。廠家3 X1與X2的聚焦過程與Avastin存在輕微差異，但整體趨勢接近一致。綜上所述，通過cIEF-WCID技術可明顯得出廠家1所提供貝伐單抗的等電點、相對含量以及主成分遷移規律與Avastin極為接近。

2.6 重組人促卵泡激素等電點條件優化

rhFSH是由α，β兩個亞基通過非共價鍵形成的異源二聚體糖蛋白。在臨床上用于治療不孕不育，前景廣泛。rhFSH是由不同的異構體構成。由于糖鏈以及糖鏈分支頂端唾液酸殘基的差異，使rhFSH的電荷異質性較復雜。rhFSH糖基化的差異產生多種異構體，每種異構體對生物學活性貢獻不同，如何有效控制各種異構體的含量成為rhFSH生產的關鍵，而rhFSH質量控制是確保各種異構體的含量達到一定的比例。cIEF-WCID技術為分析糖基化以及差異的產生多種異構體提供了可能，為rhFSH質量控制提供了有效手段。

2.6.1 尿素摩爾濃度 由于高濃度的rhFSH樣品在緩沖溶液中溶解性不好，需在樣品中添加適量的助溶劑尿素等。本實驗選擇在樣品測定液中加入不同濃度的尿素后上樣，以確定尿素最佳濃度，結果見圖6A。由圖6A可知，樣品緩沖液中不加入尿素，分離過程會出現部分沉淀。加入一定濃度的尿素可以增加樣品的穩定性，提高分離度。尿素濃度達到2 mol/L時，分離效果最佳，4 mol/L時峰形混亂，推測樣本空間結構已被破壞，故尿素濃度選擇2 mol/L[6]。

圖6 cIEF-WCID測定rhFSH等電點條件考察Fig.6 cIEF-WCID optimization for rhFSH pI measurementsA：urea concentration(a-c):0,2,4 mol/L；B：pH range(a-b):pH 2.5～5.0∶pH 3.0～10.0=1∶1,pH 3.0～10.0；C：focusing time(a-e)：2,3,4,5,6 min;D：focusing time(a-d)：360,380,400,420 s

2.6.2 兩性電解質 選擇2種范圍的兩性電解質(pH 3.0～10.0與pH 2.5～5.0)。pH 3.0～10.0兩性電解質單獨使用時，rhFSH樣品會在靠近酸性端位置聚焦，異構體未完全分開且無法加入適宜等電點標準品；pH 2.5～5.0兩性電解質單獨使用時，由于與rhFSH主成分的等電點范圍較接近，導致樣本各電荷異構體在成像范圍內呈現連續寬峰，兩者單獨使用時的分離度均低于pH 3.0～10.0與pH 2.5～5.0混合使用(體積比1∶1)，故確定pH 3.0～10.0與pH 2.5～5.0同時使用(體積比1∶1)[6]。具體結果見圖6B。

表3 rhFSH的cIEF-WCID等電聚焦結果Table 3 cIEF-WCID results of rhFSH

2.6.3 聚焦時間 由圖6C～D可知，實時跟蹤rhFSH聚焦過程，6～7 min時主成分峰形與遷移距離已無明顯改變，因此選擇聚焦時間為6 min[7]。通過尿素濃度、兩性電解質、聚焦時間和電壓等條件的優化，最終確定cIEF-WCID測定rhFSH等電點的最佳實驗條件為：2 mol/L尿素，兩性電解質pH 2.5～5.0與pH 3.0～10.0按1∶1混合，聚焦時間6 min，聚焦電壓1 000 V(1 min)～1 800 V(4 min)～2 200 V(1 min)。rhFSH的cIEF-WCID等電聚焦結果見表3。結果表明，rhFSH等電點分布范圍為4.37～7.33，主成分等電點分布范圍為4.37～6.08，主成分合計含量約94.9%。3次測定所得等電點相對標準偏差均小于1%，對應等電點相對含量，相對標準偏差大部分均小于5%，個別小于10%，說明樣本和實驗重復性良好。各組分等電點分布范圍寬，推測與rhFSH高度復雜的糖修飾相關。

3 討 論

cIEF-WCID技術結合毛細管等電聚焦的高效與全柱成像技術的創新，檢測過程無需推動毛細管柱內樣本即可實現實時成像。通過動態聚焦過程，可快速確定最佳聚焦時間，檢測結果更接近樣本的真實狀態，大大提高了結果的可靠性[7]。本研究采用標準品研究cIEF-WCID技術的準確性、重復性和分離能力，效果良好。借助cIEF-WCID技術分析顯示甘賴脯氨胰島素、重組人生長激素、貝伐單抗(Avastin)的結構修飾對電荷異質性有顯著影響[8]。優化出cIEF-WCID分析重組人促卵泡激素等電點的關鍵條件為2 mol/L尿素，兩性電解質pH 2.5～5.0與pH 3.0～10.0按1∶1混合，聚焦電壓1 000 V(1 min)～1 800 V(4 min)～2 200 V(1 min)時，方法的準確性及分離能力良好。cIEF-WCID可快速、準確測定具有電荷異質性的蛋白類藥物等電點，分辨率和重復性良好，相比現有技術具有高通量的優勢，該技術將為國內外藥廠在蛋白類藥物質量控制與新藥申報環節提供更為真實、高效和快速的新途徑[9]。

最值得關注的是，本方法的原位成像技術能實時采集樣本聚焦過程的遷移情況，無需將聚焦好的樣本推出分離柱直到檢測器進行檢測，避免了擴散等問題。大量實驗結果顯示，許多蛋白質和一些有機物是從電極兩端分別向中部遷移，從而提供了樣本左右兩條遷移軌跡——雙軌跡聚焦曲線，這種軌跡可以更精細地判別樣本的電荷特征，是本方法最獨特的優勢。然而，電泳起始時樣本并非均勻分布在溶液中，原因可能是由于本方法不是固定化的膠條(如IPG)，盡管柱內纖維素增加了溶液粘度，但兩性電解質仍有一定流動性，受電極液強酸或強堿影響，電極附近的柱內溶液pH值會形成比較明顯的梯度，因此，靠近電極附近的樣本在加電后迅速在電極附近被臨時聚焦，而柱中部的樣本仍為近溶液狀態，不能形成聚焦帶(色譜峰)。隨著聚焦的進行，電極附近的pH值逐步向中部遷移直至左右重合，此時應該停止聚焦，否則，樣本和柱內pH值將繼續遷移，導致過聚焦。但由于本系統是實時采集聚焦過程，即使最后一張電泳圖過聚焦，仍然可以從采集數據中輕易獲得聚焦的圖，從而不影響等電點和純度分析。

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Analysis of Peptide and Protein Drugs Isoelectric Point by Full Column Imaging cIEF-WCID

MENG Xiao-guang1,2,ZHEN Li3,LIU Yue-mei1,2,HOU Li-ping1,2,LIU Dan1,2，LI Bin4,OUYANG Wei-min4，WEI Kai-hua1,2,5*

(1.Beijing C&N International Sci-Tech Co.，Ltd.，Beijing 102206，China;2.National Center for Protein Sciences (Beijing),State of Key Laboratory of Proteomics，Beijing Proteome Research Center，Beijing 102206，China；3.School of Nursing & Medical Technology，Jianghan University，Wuhan 430056，China；4.Lumiere Tech Limited，Beijing 100080，China；5.Beijing Institute of Radiation Medicine，Military Medical Science Academy of PLA，Beijing 100850，China)

The application effect of isoelectric points(pI) of peptide and protein drugs containing different molecular weights and complex charge heterogeneity was evaluated by capillary isoelectric focusing electrophoresis-whole column imaging detection(cIEF-WCID ).The pI of standard polypeptide was mensured repeatedly to verify that cIEF-WCID had a high accuracy and a good repeatability(RSD<0.50%).Four serum protein isomers had achieved baseline separation.Gan Lai insulin was detected only a single characteristic peaks(pI 5.95±0.01) when repeating the test.The proportion differences of the characteristic peak’PI were significant，when comparing the recombinant human growth hormone bulk and final，and the final appeared new characteristic peaks.Comparing the imported and domestic Avastin，manufacturer 1 and 3 were found to be consistent with the innovator drug，and the migration behavior of main component in manufacturer 1 was highly consistent with the innovator drug，however，the charge heterogeneity of manufacturer 2 was influenced because of lose K，N-term pyro-Glu.The optimized pI detecting conditions of the recombinant human follicle stimulating hormone were obtained by studying co-solvent concentration，electrolyte and focusing time,namely Co-solvent:2 mol/L urea，ampholytes at pH 2.5-5.0 and pH 3.0-10.0 mixing by 1∶1，and focus voltage:1 000 V(1 min) to 1 800 V(4 min) and to 2 200 V(1 min).cIEF-WCID was fast and accurate，and it owned excellent resolution and reproducibility，especially，it could trace the focusing process of the analytes.Therefore，it was fit for analysing complex charge heterogeneity of protein drugs .

capillary isoelectric focusing electrophoresis-whole column imaging detection(cIEF-WCID)；charge heterogeneity；recombinant protein drug；antibody；pharmaceutical research

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.008

2016-08-09;

2016-11-19

國家高技術研究發展計劃863項目(2014AA020906)；國家科技部重大儀器專項(2012YQ18011710)；蛋白質組學國家重點實驗室課題(SKLP-O201412)

O657.8；O629.73

A

1004-4957(2017)03-0343-06

*通訊作者：魏開華，博士，研究員，研究方向：蛋白質組學與多肽組學，Tel：010-80727777，E-mail：wkh2006@126.com