“低溫誘導植物染色體數目變化”實驗的探究與思考

鄧 琳 李加重

（1天津市靜海區瀛海學校 天津 301600 2天津市靜海區教育教學研究室 天津 301600）

“低溫誘導植物染色體數目變化”實驗是人教版高中生物學必修2“染色體變異”一節中的實驗內容。該實驗的目的是幫助學生理解低溫誘導植物細胞染色體數目變化的作用機制，有利于了解染色體變異在實際生活中的應用。但是在實際教學中，按照教材介紹的步驟進行實驗時遇到了很多問題，例如成功率低、觀察效果不理想等，不利于學生對誘導機制形成直觀感受與認知。分析原因，一方面是低溫誘導的溫度和處理時間的選擇存在爭議；另一方面是在制作裝片的過程中對解離、染色等環節條件的控制有待改進。因此筆者組織學生在實際操作中對該實驗進行了進一步的探究和改進。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 結合教材，實驗小組本著實驗材料易獲得、操作簡單、染色體條數少、易觀察等原則，確定了幾種實驗材料：蠶豆（2n=12）、洋蔥（2n=16）、豌豆（2n=14）、大蔥、大蒜。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 培養根尖 將蠶豆和豌豆種子在清水中浸泡，待種子泡發后放入鋪有濕潤紗布的培養皿中于室溫下培養。因氣溫較高，培養皿置于無光陰涼處，且每天換水2次。若實驗室具備恒溫箱，可將培養皿放入10℃中培養，每2天換一次水（水浸沒種子的1/3或1/2）。洋蔥需在實驗前去除老根和干枯的鱗片葉，放入盛有清水的容器中，水以沒過洋蔥根部為宜，于室溫下培養。

1.2.2 低溫誘導處理 待實驗材料根的長度達到1 cm左右時，將實驗材料平均分為3組，分別置于2℃、4℃的冰箱中進行低溫處理；對照組于室溫下進行培養。低溫處理時長控制在36 h（換水時注意用相應溫度的水以減少實驗誤差）。低溫處理后恢復常溫培養10 h。

1.2.3 材料處理制作裝片

1）固定和解離：借助卡諾氏液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）進入組織和細胞并將其殺死，使其形態結構和內容物盡可能保持完整，還能增強染色體的染色效果。用解離液（15%HCl∶95%酒精=1∶1）去除細胞壁間的果膠使細胞壁軟化，并使細胞間中膠層物質溶解便于細胞分離。依據教材實驗步驟［1］，取 0.5～1 cm 的根尖（可取 1 cm，便于在之后的操作中取放，在染色時再將多余部分去除）放入卡諾氏液中浸泡。教材要求固定0.5～1 h，解離3～5 min，因考慮解離效果受到自身材料、溫度和時長及固定效果的影響［2］，實驗小組學生將固定和解離結合考慮，設置多組對比實驗。通過不斷調整固定和解離的時間發現，固定時間控制在0.5 h對于之后的操作效果更好。固定后的材料用95%的酒精進行充分沖洗，以免影響解離效果。為保證數據準確，固定過程中借助恒溫箱將溫度設定為25℃，濕度40%。解離效果蠶豆以25～30 min為宜；豌豆15 min為宜；洋蔥 10 min為宜（材料保持完整形態，染色時可被搗碎，壓片時蓋上蓋玻片即可將材料壓碎使細胞分散開）。解離時間不足會導致壓片不能成霧狀、細胞不能充分分散重疊度高、染色不充分等情況。

2）漂洗：依據教材介紹的實驗步驟，解離后使用清水對實驗材料進行漂洗以去除殘留的解離液，防止解離過度。注意應漂洗3次，每次2～3 min，且注意動作力度，防止破壞根尖形態。

3）染色：可選染液包括龍膽紫、醋酸洋紅和改良苯酚品紅溶液。本次實驗選擇龍膽紫（缺點在于易對細胞質染色，染色體觀察不清，增大觀察難度）和醋酸洋紅（缺點在于配制復雜，購買配制好的染液價格昂貴）。采取2種染色方法，其一將實驗材料浸泡在染液中3～5 min；其二在載玻片上滴一滴清水，將已漂洗的實驗材料置于清水中，滴加一滴染液，再用鑷子將根尖輕輕搗碎至組織分散，染色 2 min［3］（通過比較，學生發現第 2 種方法染色更快、更均勻）。

4）蓋上蓋玻片，在蓋玻片上鋪吸水紙并加一層載玻片，輕輕按壓，注意力度。也可用鑷子鈍頭輕輕敲打蓋玻片下的材料，使材料分散成霧狀。用高倍鏡觀察細胞的染色體情況。

2 實驗結果

2.1 洋蔥和蠶豆實驗效果的比較 實驗操作中發現，蠶豆根尖因培養時間較長、根比較粗壯、細胞質豐富等原因，使得現有實驗條件下不利于染色體數目的觀察。豌豆根尖質地堅硬，不易制作壓片。與前2種材料相比，洋蔥根的培養時間較短、分裂旺盛、便于染色觀察。根據實驗結果觀察，洋蔥試驗比較容易獲得對比度較好的染色體（染色質）染色效果。

2.2 洋蔥根尖于龍膽紫、醋酸洋紅染液染色效果的比較（圖1、圖2，本文附圖見封四）。

如圖可見，0.02%龍膽紫染液較0.01%龍膽紫染液染色效果深，影響染色體（染色質）觀察，醋酸洋紅染液染色效果清晰、明亮，可清晰地觀察到細胞中染色體（染色質）的分布情況。

2.3 蠶豆、洋蔥根尖在不同處理條件下的實驗結果

1）蠶豆在 2℃、4℃條件下培養36 h，然后在室溫培養10 h，隨后鏡檢，分析實驗效果（圖3）可見，細胞分裂的中期和后期，部分細胞大小和染色區域面積明顯較大。因染色條件不易把握，不易觀察到清晰的分裂前期圖像和染色體數量加倍的現象。

2）洋蔥根尖 2℃、4℃條件下培養 36 h，然后在室溫培養10 h，隨后鏡檢。結果（圖4、圖5）顯示，2種溫度誘導處理后再進行常溫培養的根尖，細胞分裂均比較旺盛，少數細胞出現染色體數目加倍的現象。其中，4℃條件下能觀察到根尖細胞分裂更旺盛，說明洋蔥在這樣的誘導條件下實驗效果相對更好。

3 討論和分析

本次實驗在實驗前學生按教材過程進行實驗操作，針對操作中發現的問題對實驗過程進行了分析和討論，并分組進行實驗設計。針對實驗材料、原理、自變量和因變量進行了設定，例如以溫度為自變量，以誘導時間為自變量等。

3．1 對低溫范圍的設定 在操作中要將溫度控制在多少度才能更好地使植物細胞發生染色體數目變化？教材中要求將溫度設定在4℃，但學生對“低溫”這一概念存在許多疑問。在進行低溫誘導研究時，通過分組實驗，學生將溫度分別控制在2℃、4℃。對于學生提出的為何不能將溫度設置在零下，筆者保留了問題，要求學生參考低溫誘導染色體加倍和酶活性原理查閱相關資料進行思考。學生經實際培養發現，0℃誘導條件下根尖出現凍害變黑、變軟，不能用于鏡檢。

3.2 對低溫處理時間的探究 學生通過查閱低溫誘導植物染色體數目變化的原理可知，低溫阻礙細胞內酶促反應的進行，從而導致細胞分裂時紡錘體的形成途徑受阻，以致影響子染色體被拉向細胞兩極，使細胞不能分裂成2個子細胞，于是植物細胞染色體數目加倍。觀察染色體數目的最佳時期是細胞分裂的中期。因此，要在低溫條件下處理多長時間成為另一個重要問題。學生討論得出答案：只有當細胞分裂進入到第2個細胞周期的中期時才能確保觀察比較低溫誘導染色體數目變化是否成功。因此低溫處理時長至少需要長于1個細胞周期。其次，低溫降低酶的活性，細胞代謝水平整體下降，分裂速度變緩，使得細胞周期延長。筆者提供常溫下蠶豆根尖的細胞周期為17.3 h［4］，洋蔥根尖的細胞周期大于12 h，因此，實驗小組決定按教材要求將低溫處理時間設定為36 h。

3．3 實驗中如何確定染色體數目發生變化的細胞 為便于比較細胞中染色體數目是否發生變化，進行常溫培養對照實驗，用以觀察不經低溫誘導的根尖分生區細胞中染色體數目及分布情況。但在實際觀察中很難數清染色體條數。

在實驗裝片的觀察中，學生發現某些細胞中存在2個距離很近且清晰的細胞核（圖6、圖7），不同于分裂末期的細胞。學生提出質疑后，筆者組織學生對比觀察對照組材料裝片和實驗組裝片，設置表格記錄雙核細胞出現的頻率。比較發現只有實驗組裝片存在這一現象，就此問題學生深入思考雙細胞核形成的原因。經查閱資料和分析得出，低溫誘導過程中細胞分裂并未阻斷細胞的分裂行為而使分裂停止在前期或中期。由于低溫使紡錘體裝配組件受到影響，使分開的染色單體不能拉向細胞兩極，也未形成2個子細胞。對于已經進入后期但染色體未到達兩極的細胞來說，子染色體將停止運動隨后形成2個新的細胞核，同時低溫影響細胞質分裂2個子核保留在同一個母細胞中［5］。學生提出可利用雙核細胞作為“低溫誘導細胞染色體數目變化”的實驗輔助觀察指標，提高實驗的成功率。

3．4 實驗中一些細節問題 實驗小組學生通過實驗發現，經過低溫處理的根尖直接進行實驗，可觀察到的進行細胞分裂的細胞較少。分析原因可能是低溫處理后，細胞未能進入新的分裂期，即出現細胞同步化［6］。針對這一問題，選擇在低溫誘導后恢復常溫培養使細胞分裂再次進行。恢復常溫培養的時間嚴格控制在實驗材料的1個細胞周期以內即10 h，從而使低溫誘導后的細胞再次出現一個細胞分裂的高峰。

細胞分裂在24 h內旺盛程度不同，考慮細胞分裂于上午10時至下午14時較旺盛，選擇將放入冰箱進行低溫誘導的時間定為上午10時。對誘導處理后的細胞進行實驗觀察也應將時間選擇在上午10時左右進行。

4 結論

本實驗通過學生分組探究，對“低溫誘導植物染色體數目的變化”實驗中的一些細節進行了補充，對固定、解離、染色等常規操作步驟做了更詳細的處理，以提高實驗的成功率。染色體觀察效果證明，雖然蠶豆的染色體數目少、細胞大，但在高中實驗中洋蔥相比于蠶豆、豌豆等實驗材料更理想，具有操作簡單、解離時間短、染色體染色效果清晰等優點。根據實驗，醋酸洋紅染色較龍膽紫更易獲得對比度高的染色體(染色質)圖像；考慮使用安全和經濟條件等因素，可使用0.01%龍膽紫染液。

需要說明的是，蠶豆、洋蔥等都是經過許多人探索，適于教學實驗的材料；龍膽紫、醋酸洋紅等均被長期用于染色體顯色實驗。有經驗、有水平的實驗者均可利用這些材料、方法獲得高質量實驗結果。所以，這里僅從探究角度進行分析，所獲的經驗在同等條件下具有參考價值和教學意義，但不試圖無條件推廣。相反，同行在此基礎上的進一步改進（甚至糾偏）一定更有價值。

本實驗仍有許多改進之處。例如：將實驗的誘導溫度和時間進行更細化處理；在處理實驗結果時，可通過列表對細胞分裂指數進行計算和比較，從而更準確探究更好地誘導染色體數量變化的條件。筆者將進一步嘗試，并組織學生設置后續實驗方案，繼續探究。

本次實驗在教師的引導和提示下，學生充分參與實驗的探究和思考，更好地體現了學生的主導地位，從而培養學生的實驗思維和實驗能力，逐步養成不斷質疑、不斷研究的學習習慣。

［1]人民教育出版社，課程教材研究所，生物課程教材研究開發中心.生物：必修2.北京：人民教育出版社，2007.

［2]郁建強，陸文初.植物細胞有絲分裂實驗技術的改進.實驗室研究與探索，2001（6）：70.

［3]林荔，肖義軍，詹曉梅.低溫誘導植物細胞數目變化實驗的改進.中學生物學，2012，28（1）：45.

［4]顧文波.細胞周期與細胞同步化.生物學教學，2011，36（6）：54.

［5]利榮千.植物細胞學專題講座：第2講：植物細胞周期與細胞的異常分裂.湖北農業科學，1980（8）：35.

［6]周愛文，柯鐵，梅興國.低溫誘導紅豆杉細胞同步化的研究.武漢化工學院學報，2001，34（1）：12.