陳遠

（上海藥明生物技術有限公司，上海 200131）

新型基因編輯技術在生物制藥領域的應用與發展

陳遠

（上海藥明生物技術有限公司，上海 200131）

隨著科學技術的不斷發展進步，新型的基因編輯技術不斷涌現，其中，鋅指核酸酶、轉錄激活子樣效應因子核酸酶以及CRISPR/Cas RNA引導核酸酶等基因組編輯技術在生物制藥領域得到廣泛應用。此類技術編輯效率高，在建立細胞模型新藥開發，新型動物模型開發建立，細胞工程改造以及蛋白產物糖基化水平優化等方面應用廣泛。本文主要介紹了三種新的基因編輯技術以及其在生物制藥方面的應用發展。

基因編輯；生物制藥；鋅指核酸酶；轉錄激活子樣效應因子核酸酶；CRISPR/Cas RNA引導核酸酶

隨著科學技術的不斷發展進步，新型的基因編輯技術不斷涌現。新出現的基因編輯工具讓研究人員能夠幾乎實現任何物種精確的修飾，并且可以達到核苷酸水平的精確度，還有著令人矚目的速度[1]。為了達到定點改造基因的目的，通過基因編輯技術人工構建一個核酸內切酶，使它能在預定的基因組位置使DNA發生雙鏈斷裂，DNA的修復系統產生突變，使斷裂的DNA得以修復。DNA修復系統主要通過兩種途徑修復DNA雙鏈斷裂[2]，一種是非同源末端連接（Nonhomologous end joining,NHEJ）另一種是同源重組（Homologous recombination,HR）[3]。通過這兩種修復途徑，基因編輯技術可以實現基因敲除、特異突變引入、定點轉入基因等目的。隨著鋅指核酸酶、轉錄激活子樣效應子核酸酶和規律成簇間隔短回文重復序列RNA引導核酸酶系列新型基因編輯工具的出現，任意目的基因的敲除、外源基因的敲入、基因的修復和替換都能具有更高的效率和更快的速度[4]。

1 新型基因編輯技術的作用原理及分子機制

1.1 細胞天然修復機制同源重組和非同源末端連接

同源重組是指發生在同一染色體或非姐妹染色單體（sister chromatin）之間，含有同源序列的DNA分子內或分子之間的重新組合。如果將同源DNA片段導入受體細胞，這段DNA片段將可基于同源重組的原理替換目的基因片段，最終可達到敲除目的基因片段的目的。基因敲除除了用正常基因敲除對應的突變基因，也可以用突變基因或其他基因敲除相應的正常基因。

另一種特殊的DNA雙鏈斷裂修復機制是非同源末端連接。非同源末端連接可以在真核生物細胞的整個細胞周期中發生，其修復不需要提供模板，相當于將DNA斷端彼此強制連接在一起。同源重組與非同源末端連接是兩種有所不同但又相互補充的修復DNA雙鏈斷裂的手段。NHEJ不需要重組，斷端之間的具有嚴格的DNA之間的同源性。如果存在一個外源性供體基因序列的情況，該序列會被NHEJ機制引入DNA雙鏈發生斷裂的位點，從而能夠實現基因的定點敲入。

1.2 不同基因編輯技術的作用機制及其特點

1.2.1 人工鋅指核酸酶（ZFNs）

人工鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases,ZFNs）是由Fok I核酸內切酶結構域和鋅指蛋白結構域人工融合而成。其中，鋅指蛋白能夠識別并結合特異的DNA序列，Fok I則可通過二聚化產生核酸內切酶活性，在該序列附近造成DNA的雙鏈斷裂[5]。

鋅指（Zinc finger,ZF）是構成ZFP結構域的基本單元，它是一種廣泛存在于多種蛋白質中的蛋白基序（Motif），能夠介導蛋白質與核酸、小分子或其他蛋白質的特異相互作用。多個可特異識別DNA并結合DNA的鋅指串聯后，構成ZFP。通過將ZFP與不同的功能結構域融合，建出不同用途的人工蛋白分子，如鋅指激活因子（Zinc finger activator,ZFA）、鋅指抑制因子（Zinc finger repressor,ZFR）、鋅指核酸甲基化酶（Zinc finger methylase,ZFM）以及現在應用最為廣泛的鋅指核酸酶等，以實現對基因組的各種定點修飾或調控[6]。

Fok I核酸內切酶結構域來源于一種IIS 型限制性內切酶。原始類型的Fok I能夠特異性識別雙鏈DNA上的靶位點，并在靶位點下游非特異性地切割DNA雙鏈。Fok I核酸內切酶結構域同ZFP的C端融合后構成ZFN單體。若在同一個雙鏈DNA序列位點處兩個ZFN單體特異結合，并且這兩個位點在DNA雙鏈上的距離和方向符合一定的要求時，兩個Fok I結構域可形成二聚體的活性形式，在兩個結合位點的間隔區（Spacer，通常為5～7bp）中發生切割，產生DSB切口。

1.2.2 轉錄激活子樣效應因子核酸酶（TALENs）

TAL效應子是一種植物細菌分泌的天然蛋白，它可以特異性識別DNA堿基對。將其附加一個可靶向修飾DNA序列的核酸酶就生成了TALENs。應用設計后的TAL效應子可識別和結合全部的目的DNA序列，TALENs可與DNA結合并在特異位點切割DNA鏈，從而導入新的遺傳物質。相比于傳統的鋅指核酸酶（ZFNs）技術，TALENs具有獨特的優勢，它的設計更簡單，特異性也更高。但缺點是具有一定細胞毒性，模塊組裝過程繁瑣，一般需要求助于外包公司完成模塊篩選[7-8]。

1.2.3 規律成簇間隔短回文重復RNA引導核酸酶（CRISPR/Cas）

CRISPR/Cas系統是一種由Cas蛋白與成簇規律間隔的短回文重復序列組成的獲得性免疫系統，它最初產生的原因是為了抵御外源性DNA的入侵。CRISPR/Cas系統作為一種功能強大的基因編輯工具，實驗人員只需針對目的DNA序列設計大約20bp的RNA序列，并將其與核酸內切酶結構Cas結合，之后形成的RNA蛋白質復合物，即可靶定目的序列并對其進行剪切[9]。

由于CRISPR/Cas系統能對目的DNA進行高效定點編輯，并且實驗操作簡單易行、費用低廉，它被迅速轉化成一種廣受歡迎的最新型基因編輯技術。不同于ZFNs和TALENs復雜的蛋白質識別結構域，CRISPR/Cas的識別組件是RNA序列，由于RNA與DNA的識別更加直接，不會有鋅指陣列那樣的互相影響，可以大大簡化篩選過程[10]。

2 新型基因編輯技術在生物制藥領域的應用

2.1 建立篩選細胞模型及新藥開發

動物生理、病理模型是藥物篩選和靶點研究的重要手段。人功干細胞技術可與新型基因編輯技術相結合，建立符合人類特征的各種細胞模型，為新藥研發奠定基礎。現今已有文獻報道了利用TALENs敲除編碼周脂蛋白的PLIN1基因，建立游離脂肪酸的釋放和甘油三酯儲存的相關模型，以及為建立脂肪代謝和胰島素抵抗的相關模型，可利用鋅指核酸酶敲除編碼RAC-b絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶的AKT2。還比如相比較傳統的RNA干擾敲除人肝癌HuH-7細胞系APOB基因的細胞模型，利用TALENs敲除APOB基因后建立的丙型肝炎病毒侵染模型具有更徹底的載脂蛋白B表達缺失[11]。

2.2 建立新型動物模型

在開發建立不同種類的動物模型上，不斷有具較高實用性和良好性狀的新興品種涌現。例如，將豬的部分基因通過基因編輯技術替換成為人類對應基因，這種“人源化”基因編輯豬將為人類的醫學實驗、器官移植等提供重要支撐[12]。

2.3 細胞工程優化改造

利用CRISPR/Cas靶向野生型CHO細胞的GS和DHFR基因，可同時敲除GS和DHFR基因，獲得GS和DHFR雙缺陷型宿主細胞，即可同時用GS、DHFR兩種篩選系統進行篩選，達到篩選出更優工程細胞的目的[13]。

2.4 蛋白產物的糖基化水平優化

利用ZFNs敲除工程細胞株乙酰氨基葡萄糖轉移酶，可使其表達的蛋白分子呈高甘露糖糖型。在針對部分罕見病的酶替代療法中，治療性酶的甘露糖糖基暴露在糖鏈外端，可提高該酶與巨噬細胞內甘露糖受體的結合效率，從而提高酶替代療法的療效。此外，高甘露糖化的抗體在血液循環中的清除速率提高，在抗體介導的酶催化前藥治療策略中，可以降低血液循環中藥物被催化產生毒性的概率。

3 新型基因編輯技術存在的問題及未來發展

隨著對新型基因編輯技術的研究不斷深入，靶定目標基因的特異性在不同的基因編輯工具中存在差異性，細胞內的脫靶效應（off-target effect）很大程度上由于基因編輯引起的。脫靶效應會造成嚴重的細胞毒性作用。脫靶效應發生時，非目的基因可能出現斷裂，導致其在非目的區域出現基因插入、刪除，可能直接導致細胞癌變甚至死亡。FokⅠ活性結構域一般為ZFNs和TALENs的酶切結構，只有在其成二聚體的狀態下才具備使DNA雙鏈斷裂的活性，但由于其二聚化存在一定隨機性，可能會激發隨機DSB。可以通過對FokⅠ結構優化設計，使其自身二聚化處于非穩定狀態，必須借助上下游才能實現穩定二聚體，從而降低脫靶效應[14]。

基因編輯技術可以通過編輯修改控制抗體分子中糖基化水平的各種基因，達到調控糖蛋白分子糖鏈功能的目的。同時也可以根據生物制藥行業發展的不同需求為現有生物藥物的優化改造提供更多路徑。另外利用新型基因編輯技術對生產重組蛋白或單抗的宿主細胞進行工程改造，可顯著提高細胞產量，延長細胞培養時間或細胞活率，相信會對生物制藥的成本控制產業發展起到重要作用。新型基因編輯技術將在生物制藥領域占據非常重要的地位，可以預見在不遠的未來，科學家能夠依據生物藥行業內的需求，充分利用手中的基因編輯工具，為生物制藥行業的發展進步作出貢獻。

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Application and Development of Novel Gene Editing Technology in Biopharmaceutical Industry

Chen Yuan
（Shanghai Pharmaceutical Biotechnology Co.,Ltd.,Shanghai 200131）

With the continuous development of science and technology,new gene editing technology continue to emerge,the zinc finger nucleases,transcription activator like effector nuclease and CRISPR/Cas RNA nucleic acid enzyme genome editing technology is widely used in the field of biological pharmacy.These techniques have high efficiency in editing,establishing cell models,developing new drugs,establishing new animal models,improving cell engineering,and optimizing the level of glycosylation of protein products.Three new gene editing techniques and their applications in biopharmaceutical industry are introduced in this paper.

Gene editing;Biological Phamaceutics;Zinc finger nuclease;Transcription activator like effector nuclease;CRISPR/Cas RNA nuclease

Q789

A

2096-0387（2017）05-00111-04

陳遠（1984—），女，四川成都人，本科，目前在職攻讀上海交通大學工程碩士專業學位，副研究員，研究方向：生物工程。