PI3K/CTGF信號通路在TGF-β1誘導A549細胞表達collagen I過程中的作用*

應趙建， 黃曉敏， 余埡妮， 林曉曉， 陳 晶， 李文君， 董 年， 陳成水

(溫州醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，浙江 溫州 325000)

PI3K/CTGF信號通路在TGF-β1誘導A549細胞表達collagen I過程中的作用*

應趙建， 黃曉敏▲， 余埡妮， 林曉曉， 陳 晶， 李文君， 董 年△， 陳成水△

(溫州醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，浙江 溫州 325000)

目的： 研究磷脂酰肌醇3-激酶/結締組織生長因子(PI3K/CTGF) 信號通路在轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導人肺腺癌A549細胞表達I型膠原蛋白(collagen I)過程中的分子機制。方法: 體外培養A549細胞，予TGF-β1刺激，觀察CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表達及PI3K信號通路的活化；PI3K抑制劑LY294002預先處理A549細胞后，觀察TGF-β1刺激下CTGF和collagen I mRNA和蛋白表達的變化；CTGF特異性siRNA干擾A549細胞中CTGF的表達后，觀察TGF-β1刺激下collagen I mRNA和蛋白表達的變化和PI3K信號通路的活化。結果: TGF-β1可以誘導A549細胞中CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表達以及PI3K信號通路的活化；PI3K特異性抑制劑LY294002可以部分逆轉TGF-β1誘導的A549細胞中CTGF和Collagen I mRNA和蛋白表達的升高。干擾CTGF可以降低TGF-β1誘導的A549細胞collagen I mRNA和蛋白表達，而不影響PI3K信號通路的活化。結論: CTGF是TGF-β1/PI3K信號通路調控的即刻早期反應效應蛋白，參與了TGF-β1誘導的A549細胞中collagen I表達。

轉化生長因子β1； I型膠原蛋白； 結締組織生長因子

細胞外基質(extracellular matrix，ECM)代謝異常是腫瘤的重要特征之一，肺癌是高度纖維化的腫瘤，以I型膠原蛋白(collagen I)為代表的ECM過度沉積在肺癌的發生發展中扮演了重要角色[1-2]。既往認為腫瘤間質中成纖維細胞的激活及表型轉化是ECM沉積的中心環節，目前認識到肺癌細胞在轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)誘導下可以向成纖維細胞等間質細胞分化從而參與ECM的異常沉積[3-4]。結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是新近發現的早期即刻反應蛋白，是TGF-β1調控的效應蛋白，可以協同TGF-β1促進細胞表型轉化和ECM沉積[5]，然而關于其在肺癌ECM代謝異常中的確切機制尚不清楚。結合我們之前的研究發現磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl-inositol 3-kinase，PI3K)信號通路的活化與上皮-間質轉化和ECM的沉積密切相關[6-7]，本研究擬進一步探討PI3K信號通路和效應蛋白CTGF在TGF-β1誘導人肺腺癌A549細胞 collagen I表達中的潛在角色，闡明TGF-β1/PI3K/CTGF信號通路在A549細胞ECM合成的調控機制。

材 料 和 方 法

1 細胞

人肺腺癌細胞A549細胞購于上海中科院細胞庫。

2 主要試劑

RPMI-1640培養基和胎牛血清購自Gibco；人重組TGF-β1購自PeproTech；PI3K抑制劑LY294002購自Biovision；BCA蛋白濃度測定試劑盒、預染蛋白Marker和ECL發光液購自Thermo；兔抗人p-Akt和Akt單抗購自CST；兔抗人CTGF和collagen I單抗購自Abcam；TRIzol購自Invitrogen；cDNA逆轉錄試劑盒購自TaKaRa；其它生化試劑購自上海生工生物工程公司。Real-time PCR引物由上海生工生物工程公司設計合成，見表1；siRNA-CTGF由上海吉凱基因技術有限公司設計合成，見表2。

表1 Real-time PCR引物序列

表2 CTGF干擾RNA序列

3 方法

3.1 細胞培養 A549細胞株使用包含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養基于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。

3.2 細胞干預 取生長狀態良好處于對數生長期的細胞，接種于12孔板(抽提RNA)或6孔板(抽提蛋白)，待細胞長至孔板面積80%時，進行分組干預，每個分組設立3個復孔，每個實驗重復3次。

3.3 Real-time PCR實驗 按照TRIzol說明書提取細胞總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。取總RNA 2 μg反轉錄為cDNA，再以適量cDNA為模板進行real-time PCR實驗。PCR反應條件為95 ℃10 min； 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，共40個循環。結果以GAPDH為內參照，對目的基因進行相對定量。

3.4 Western blot實驗 收集各組細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組取30 μg蛋白進行凝膠電泳，濕轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h， Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜10 min、3次，Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，再用TBST緩沖液洗膜10 min×3次，ECL化學發光法顯影。以β-actin為內參照，結果以各蛋白與β-actin灰度值比值表示。

3.5 siRNA轉染 siRNA轉染方法按照Lipofectamine 2000產品說明書進行，提前1 d將1×105個細胞接種于24孔板，次日按照24孔板每孔取2 μL CTGF-siRNA、1 μL Lipofectamine 2000和50 μL Opti-MEM I的比例配制CTGF-siRNA-轉染試劑混合液，將siRNA-轉染試劑混合液添加入細胞培養板中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，6 h后更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基。

4 統計學處理

使用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析。數據均以均數±標準差(mean±SD)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TGF-β1誘導collagen I表達升高

選取不同濃度的TGF-β1刺激A549細胞不同時間， real-time qPCR和Western blot法檢測collagen I的mRNA和蛋白的表達。結果顯示，TGF-β1可以誘導A549細胞中collagen I的表達，呈現濃度和時間依賴性升高，其中5 μg/L TGF-β1是最適刺激濃度，TGF-β1刺激48 h collagen I升高最為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of collagen I induced by TGF-β1. A: the mRNA expression of collagen I induced by TGF-β1 at different doses for the indicated time; B: the protein level of collagen I changed by TGF-β1 at different doses for 48 h; C: the protein level of collagen I changed by TGF-β1 at 5 μg/L for the indicated time. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 h; #P<0.05, ##P<0.01 vs 0 μg/L.

2 TGF-β1誘導CTGF的即刻早期表達

選取5 μg/L TGF-β1刺激A549細胞不同時間，結果顯示TGF-β1可以誘導A549細胞中CTGF即刻早期表達，mRNA和蛋白在TGF-β1刺激3 h時即發生升高，TGF-β1刺激6 h時CTGF蛋白表達最高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of CTGF induced by TGF-β1. A: the mRNA expression of CTGF induced by TGF-β1 at different doses for the indicated time; B: the protein level of CTGF changed by TGF-β1 at different doses for 48 h; C: the protein level of CTGF changed by TGF-β1 at 5 μg/L for the indicated time. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 h group; #P<0.05, ##P<0.01 vs 0 μg/L.

3 TGF-β1活化PI3K信號通路,PI3K抑制劑逆轉TGF-β1誘導的CTGF和collagen I表達升高

選取不同濃度的TGF-β1刺激A549細胞不同時間，用Western blot法檢測，可見TGF-β1可以激活PI3K信號通路，呈現濃度和時間依賴性。使用不同濃度的PI3K抑制劑LY294002預先處理A549細胞，再使用5 μg/L TGF-β1刺激48 h，結果可見PI3K抑制劑 LY294002可以逆轉TGF-β1誘導的A549細胞中CTGF和collagen I表達，呈現劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.TGF-β1 induced PI3K/Akt signaling pathway activation, and PI3K inhibitor reversed the expression of CTGF and collagen I induced by TGF-β. A: the protein levels of Akt and p-Akt changed by with the vehicle or TGF-β1 at different doses for 10 min; B: the protein levels of Akt and p-Akt changed by TGF-β1 at dose of 5 μg/L for different time; C: the mRNA and protein levels of CTGF were measured after incubation with PI3K inhibitor LY294002 at different doses and TGF-β1 (5 μg/L) for 6 h; D: the mRNA and protein levels of collagen I were measured after incubation with PI3K inhibitor LY294002 at different doses and TGF-β1 (5 μg/L) for 48 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs Con (control) group; △△P<0.01 vs 0 min group; #P<0.05, ##P<0.01 vs TGF-β1 group.

4 siRNA-CTGF-2是最佳干擾序列并影響collagen I的基礎表達

4條不同的干擾序列siRNA-CTGF轉染A549細胞24 h后，用real-time qPCR和Western blot分別檢測CTGF的mRNA和蛋白表達，結果可見siRNA-CTGF-2干擾A549細胞中CTGF表達的效果最佳，見圖4A。與對照組及siRNA陰性對照組相比，siRNA-CTGF-2組的collagen I基礎表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖4B。

Figure 4.siRNA-CTGF-2 was the best interference sequence and impaired the basal collagen I synthesis. A: the mRNA and protein expression of CTGF modified by different siRNAs; B: the mRNA and protein expression of collagen I were measured after CTGF interference by siRNA-CTGF2. Mean±SD. n=3. *P<0.05,**P<0.01 vs Con (control) group; #P<0.05, ##P<0.01 vs siRNA-Con group.

5 干擾CTGF表達影響TGF-β1誘導的collagen I表達升高而不影響PI3K信號通路的活化

siRNA-CTGF-2轉染24 h干擾A549細胞中CTGF的表達，再用5 μg/L TGF-β1刺激10 min，結果顯示siRNA-CTGF-2轉染并不影響TGF-β1活化PI3K信號通路，差異無統計學顯著性，見圖5A。然而，siRNA-CTGF-2轉染明顯降低TGF-β1誘導的collagen I表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5B。

Figure 5.Interference of CTGF expression impaired TGF-β1-induced collagen I synthesis but not PI3K/AKT signaling pathway activation. A: the protein levels of Akt and p-Akt changed by the vehicle or TGF-β1 at dose of 5 μg/L for 10 min after CTGF interference; B: TGF-β1-induced mRNA and protein expression of collagen I was measured after CTGF interference. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs Con (control) or siRNA-Con group; ##P<0.01 vs siRNA-CTGF-2 group; △P<0.05, △△P<0.01 vs TGF-β1+siRNA-Con group.

討 論

既往認為腫瘤間質中成纖維細胞的激活及表型轉化是腫瘤胞外基質代謝異常的關鍵[8]，目前逐漸認識到腫瘤細胞可以發生間質轉化不僅扮演了ECM沉積啟動細胞，釋放的TGF-β1等轉化生長因子參與腫瘤間質中成纖維細胞的活化，更扮演了繼發受體的角色，其分泌的炎癥因子可以以自分泌或旁分泌的方式作用于自身[9]。TGF-β1是關鍵的促纖維化因子，主要激活經典的Smad通路和非經典Smad通路共同介導ECM中膠原蛋白(collagen)和纖連蛋白(fibronectin)等的沉積[10-11]。近來的研究揭示非經典Smad通路PI3K的過度活化參與了肺癌的發生發展，我們之前的實驗發現PI3K抑制劑可以逆轉慢性氣道重塑中膠原的沉積，然而關于PI3K如何參與肺癌胞外機制代謝異常研究甚少。CTGF屬于早期即刻反應蛋白，影響成纖維細胞的活性，在纖維化的發生發展中發揮重要作用[12-13]。作為TGF-β1的調控蛋白，研究報道TGF-β1主要是經Smad通路調控CTGF，然而有報道稱哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑可以反向激活PI3K通路促進肺癌細胞中CTGF的過度表達，協同TGF-β1參與了ECM沉積[14-15]。本研究旨在探究PI3K信號通路和效應蛋白CTGF在TGF-β1誘導A549細胞的collagen I表達中的的潛在角色，為未來針對肺癌ECM代謝異常揭示潛在的干預靶點。

我們研究發現TGF-β1可以誘導A549細胞的collagen I的表達升高，與之前的研究報道類似，除此之外，TGF-β1可以誘導CTGF的早期表達和PI3K信號通路的活化。使用PI3K抑制劑可以逆轉TGF-β1誘導的CTGF的早期表達和collagen I的表達升高，提示我們PI3K信號通路和經典的Smad通路共同參與了TGF-β1調控的CTGF早期表達。我們進一步經siRNA-CTGF特異性降低A549細胞中CTGF的表達，發現A549細胞的collagen I基礎表達及TGF-β1誘導的collagen I表達同時發生了降低，而不影響TGF-β1活化PI3K信號通路。

總而言之，我們研究發現TGF-β1經活化PI3K信號通路調控A549細胞中collagen I的表達升高，CTGF是TGF-β1/PI3K信號通路潛在的調控蛋白，協同TGF-β1誘導A549細胞中collagen I的表達升高，初步闡述了TGF-β1/PI3K/CTGF信號通路在調控A549細胞collagen I表達中的分子機制。CTGF和PI3K信號通路可能是未來針對肺癌ECM過度沉積的潛在干預靶點。

[1] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation[J]. Cell, 2011, 144(5): 646-674.

[2] Shintani Y, Maeda M, Chaika N, et al. Collagen I promotes epithelial-to-mesenchymal transition in lung cancer cells via transforming growth factor-beta signaling[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2008, 38(1): 95-104.

[3] 岳喜磊, 成 瑩, 許繼德, 等. TRPC1在 TGF-β1誘導支氣管上皮細胞間充質轉化中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2015,31(3): 492-498.

[4] Wang X, Adler KB, Erjefalt J, et al. Airway epithelial dysfunction in the development of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome[J]. Expert Rev Respir Med, 2007, 1(1): 149-155.

[5] 楊 敏, 黃海長, 王海燕. 結締組織生長因子促纖維化作用及其表達調節的研究進展[J]. 中國病理生理雜志, 2005, 21(1): 199-202,208.

[6] Chen C, Fang X, Wang Y, et al. Preventive and therapeutic effects of phosphoinositide 3-kinase inhibitors on acute lung injury[J]. Chest, 2011, 140(2): 391-400.

[7] Fang X, Li K, Tao X, et al. Effects of phosphoinositide 3-kinase on protease-induced acute and chronic lung inflammation, remodeling, and emphysema in rats[J]. Chest, 2013, 143(4): 1025-1035.

[8] Phan SH. Genesis of the myofibroblast in lung injury and fibrosis[J]. Proc Am Thorac Soc, 2012, 9(3): 148-152.

[9] Yang J, Velikoff M, Canalis E, et al. Activated alveolar epithelial cells initiate fibrosis through autocrine and paracrine secretion of connective tissue growth factor[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2014, 306(8): L786-L796.

[10]王來亮, 羅 群. 腎小管上皮間充質轉化與腎臟纖維化[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(10): 1910-1914,1920.

[11]馬文東, 袁 媛, 楊 奕, 等. TGF-β1介導的RhoA/ROCK通路在大鼠肺肌成纖維細胞分化中的調節作用[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(10): 1758-1763.

[12]王達安, 林逸心, 王 崢, 等. 沙利度胺抑制 TGF-β1誘導的 HELF 細胞中結締組織生長因子基因啟動子的激活[J]. 中國病理生理雜志, 2014,30(4): 693-697.

[13]Mason RM. Connective tissue growth factor(CCN2), a pathogenic factor in diabetic nephropathy. What does it do? How does it do it? [J].J Cell Commun Signal, 2009, 3(2): 95-104.

[14]Xu X, Wan X, Geng J, et al. Rapamycin regulates connective tissue growth factor expression of lung epithelial cells via phosphoinositide 3-kinase[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2013, 238(9): 1082-1094.

[15]Xu X, Dai H, Geng J, et al. Rapamycin increases CCN2 expression of lung fibroblasts via phosphoinositide 3-kinase[J]. Lab Invest, 2015, 95(8): 846-859.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of PI3K/CTGF signaling pathway on TGF-β1-induced collagen I expression in A549 cells

YING Zhao-jian, HUANG Xiao-min, YU Ya-ni, LIN Xiao-xiao, CHEN Jing, LI Wen-jun, DONG Nian, CHEN Cheng-shui

(DepartmentofPulmonaryandCriticalCareMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:wzmudongnian@foxmail.com;wzchencs@163.com)

AIM: To investigate the molecular mechanism of transforming growth factor β1/phosphatylinositol 3-kinase/connective tissue growth factor (TGF-β1/PI3K/CTGF) signaling pathway in the induction of collagen I expression in human lung adenocarcinoma A549 cells. METHODS: The A549 cells were culturedinvitroand stimulated by TGF-β1. The expression of CTGF and collagen I at mRNA and protein levels as well as the activation of PI3K was measured. The A549 cells were pre-treated with PI3K inhibitor LY294002, the expression of CTGF and collagen I at mRNA and protein levels was measured upon TGF-β1 stimulation. Under the condition ofCTGFinterference by siRNA-CTGF, the expression of collagen I at mRNA and protein levels as well as the activation of PI3K by TGF-β1 stimulation was measured. RESULTS: TGF-β1 stimulated the expression of CTGF and collagen I at mRNA and protein levels as well as the activation of PI3K at a dose- and time-dependant manner. PI3K inhibitor LY294002 partly reversed TGF-β1-induced CTGF and collagen I expression. Interference ofCTGFdown-regulated TGF-β1-induced collagen I expression without the effect on the activation of PI3K. CONCLUSION: PI3K signaling pathway plays a pivotal role in TGF-β1-induced collagen I expression in the A549 cells. CTGF is an immediate early response effector protein of TGF-β1/PI3K signaling pathway and synergizes with TGF-β1 in the induction of collagen I expression in the A549 cells.

Transforming growth factor β1; Collagen I; Connective tissue growth factor

1000- 4718(2017)03- 0489- 06

2016- 09- 21

2016- 12- 01

國家自然科學基金資助項目(No. 81270131； No. 81570075)

△通訊作者 董 年 Tel: 0577-86352962; E-mail: wzmudongnian@foxmail.com; 陳成水 Tel: 0577-55578186; E-mail: wzchencs@163.com

▲并列第1作者

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.017