PM2.5對血管內皮細胞氧化應激和凋亡的影響及機制*

王 芳， 李 巖， 盧昕爍， 楊杰波， 劉方芳， 余雪松， 李 明△

(1廣東藥科大學基礎學院， 2廣州中醫藥大學基礎醫學院， 廣東 廣州 510006)

PM2.5對血管內皮細胞氧化應激和凋亡的影響及機制*

王 芳1， 李 巖2， 盧昕爍1， 楊杰波1， 劉方芳2， 余雪松1， 李 明1△

(1廣東藥科大學基礎學院，2廣州中醫藥大學基礎醫學院， 廣東 廣州 510006)

目的： 從大氣細顆粒物PM2.5對血管內皮細胞氧化應激和凋亡的影響，研究PM2.5對血管內皮細胞的毒性。方法: 體外培養血管內皮細胞株EA.hy926，用不同濃度的PM2.5染毒24 h后，用CCK-8法測細胞的活性，用DCFH-DA熒光標記法檢測細胞內氧自由基生成情況，用流式細胞術檢測細胞凋亡率，然后用Western blot法檢測凋亡相關蛋白細胞色素C、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表達變化。結果: CCK-8法結果顯示PM2.5對血管內皮細胞有明顯的毒性，在濃度大于25 mg/L時可使EA.hy926細胞活性顯著下降；PM2.5染毒24 h后可見DCFH-DA熒光染色增強，說明細胞內有大量的氧自由基形成；流式細胞術和Western blot檢測證實PM2.5可以通過上調細胞色素C表達和活化cleaved caspase-9和cleaved caspase-3而誘導EA.hy926細胞凋亡。此外,用N-乙酰半胱氨酸抑制氧自由基生成可以抑制血管內皮細胞凋亡，提示PM2.5引起的細胞凋亡與氧化應激有關。結論: PM2.5可導致血管內皮細胞氧化應激水平增強和凋亡增加，這可能是其影響心血管系統功能的機制之一。

PM2.5； 血管內皮細胞； 氧化應激； 細胞凋亡

隨著我國經濟發展和城市化進程的不斷加快，工業生產、交通和燃煤等所產生的大量顆粒物(particulate matter，PM)使大氣污染問題日益嚴峻，并嚴重危害人體健康[1]。與健康相關的PM按其空氣動力學直徑可以分為PM10、PM2.5和PM0.1，PM的粒徑越小，進入呼吸系統部位越深，尤其是PM2.5和PM0.1，現在研究證實其不僅可以沉積在肺泡，還可以穿透血氣屏障進入血液循環[2]，因此目前大氣污染除與呼吸系統疾病有關外，還可以影響心血管系統疾病的發生[3]。以上結果也得到了流行病的證實，調查顯示灰霾天氣時醫院住院人數增多，人群總死亡率明顯增高，其中以呼吸系統和心血管系統疾病患者為主[4-5]。

目前，PM2.5已經被認為是重要的心血管疾病危險因素之一，對于其作用機制，由于以往認為PM2.5主要通過造成肺部損傷引起全身炎癥性反應，以間接作用的方式影響心血管系統疾病的發生[6]。直到近年來研究者發現PM2.5可以進入血液循環，才有學者提出PM2.5可能直接造成心血管系統毒性[2-3]。血管內皮細胞受損或功能障礙是動脈粥樣硬化等心血管疾病發生的共同基礎[7]，PM2.5進入血液循環后可與血管內皮細胞相接觸，因此PM2.5可能通過直接影響內皮細胞功能來促進心血管系統疾病的發生。為研究該問題，本研究在體外培養血管內皮細胞，用PM2.5進行干預，從氧化應激和細胞凋亡兩方面研究PM2.5對內皮細胞的影響，以期加深對PM2.5心血管系統毒性的認識。

材 料 和 方 法

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器 AvantiTMJ25低溫高速離心機(Beckman)；MCO-175 CO2培養箱(SANYO)；MS800顯微鏡(Olympus)；ELx800酶標儀(BioTek)；流式細胞儀(BD)；蛋白電泳儀、電轉儀和凝膠成像儀(Azure Biosystems)。

1.2 主要試劑 PM2.5(Sigma)；胰酶、DMEM 培養基和胎牛血清(Gibco)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；活性氧檢測試劑盒H2-DCFDA(江蘇凱基生物技術有限公司)；凋亡試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；抗β-actin抗體、抗caspase-3抗體和HRP標記的羊抗兔IgG(ABclonal)；抗caspase-9抗體(CST)；抗細胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)抗體(Abcam)；蛋白預染Marker(Thermo)；脫脂奶粉、蛋白定量試劑盒和RIPA細胞裂解液(上海碧云天生物有限公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 人血管內皮細胞EA.hy926株購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2 細胞活性的檢測 取對數生長期的EA.hy926細胞，以每孔8×103個接種96孔板，分為對照組和不同濃度PM2.5染毒組(PM2.5終濃度分別為12.5、25、50、100和200 mg/L)，每組設6個復孔。根據實驗分組，對細胞進行染毒，24 h后按照CCK-8試劑盒說明書，用酶標儀在450 nm處檢測各孔吸光度(A)值，按公式計算細胞存活率。細胞存活率(%)=染毒組A值/陰性對照組A值×100%。

2.3 細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成的檢測 細胞以每孔1×106個接種于6孔板，分為對照組、不同濃度PM2.5染毒組(PM2.5濃度根據結果選擇25、50和100 mg/L)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)處理組(以NAC 10 mol/L 預處理1 h后加入PM2.5 100 mg/L)。細胞孵育24 h后去除培養基，加入DCFH-DA探針(10 μmol/L)孵育90 min，用溫PBS漂洗2次，然后用溫無血清培養基繼續培養30 min，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞分組和處理同上，孵育24 h后用無EDTA胰酶消化細胞，冷PBS離心洗滌2次，然后用400 μL binding buffer重懸細胞，先加入Annexin V-FITC 5 μL 4 ℃避光孵育15 min，再加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)10 μL，4 ℃避光孵育5 min后，立即以流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.5 凋亡相關信號分子的檢測 實驗分組和處理同上，24 h后用冷PBS洗滌3次，用含PMSF的RIPA細胞裂解液冰上裂解細胞30 min，然后4 ℃、12 500×g離心5 min，收集上清液，用BCA法測量蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE分離、轉膜。Western blot主要步驟如下：5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST清洗10 min、3次，加入相應Ⅰ抗(1∶1 000)，其中抗caspase-9抗體和抗caspase-3抗體可同時檢測未活化的凋亡蛋白酶及被切割活化后的凋亡蛋白酶。4 ℃孵育過夜，TBST清洗后加入酶標Ⅱ抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h，最后用TBST清洗并用ECL法顯色，凝膠成像系統拍照，用ImageJ分析軟件分析條帶的灰度值，用目標蛋白與β-actin灰度值的比值來表示蛋白的相對表達水平。

3 統計學處理

以GraphPad Prism 5統計軟件進行分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多樣本組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PM2.5對EA.hy926細胞的毒性作用

當PM2.5濃度為12.5 mg/L時， EA.hy926細胞的存活率雖然有所降低，但與對照組無顯著性差異；當PM2.5濃度大于25 mg/L時，EA.hy926細胞存活率明顯下降，與對照組相比差異有統計學顯著性(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The viability of EA.hy926 cells exposed to PM2.5 for 24 h. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs 0 mg/L group.

2 PM2.5對EA.hy926細胞內 ROS水平的影響

熒光染色結果顯示，對照組細胞在熒光顯微鏡下幾乎看不到熒光，而PM2.5刺激后細胞內可見較強的熒光，且隨著PM2.5濃度的增大熒光強度逐漸增加，說明PM2.5染毒可以使血管內皮細胞內ROS生成增多，引起細胞的氧化應激狀態。以抗氧化劑NAC預處理后細胞內熒光強度明顯減弱，說明NAC可減少PM2.5誘導的ROS生成，見圖2。

Figure 2.The production of ROS in the EA.hy926 cells exposed to PM2.5 for 24 h (×400).

3 PM2.5對EA.hy926細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示用25 mg/L的PM2.5作用于EA.hy926細胞，24 h后即可檢測到凋亡細胞數增多，隨著PM2.5濃度的增加，細胞凋亡明顯增多，當PM2.5作用濃度為100 mg/L時，凋亡率是對照組的近4倍。實驗還顯示用NAC預處理后再給予PM2.5染毒可以減輕細胞凋亡，與對應濃度的PM2.5組比較細胞凋亡率明顯下降，見圖3。

Figure 3.Apoptosis of EA.hy926 cells induced by PM2.5 for 24 h detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs 100 mg/L PM2.5 group.

4 PM2.5對EA.hy926細胞凋亡信號分子的影響

PM2.5作用于EA.hy926細胞24 h后，與對照組相比，胞漿中的Cyt-C含量明顯增高，同時cleaved caspase-9和cleaved caspase-3增加。實驗中發現用抗氧化劑NAC預處理可以抑制PM2.5引起的上述信號分子改變，說明氧化應激參與了PM2.5引起的細胞凋亡，見圖4。

討 論

Figure 4.The levels of apoptosis-related proteins in the EA.hy926 cells exposed to PM2.5 for 24 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05， ##P<0.01 vs 100 mg/L PM2.5 group.

近年來，PM對心血管系統的影響逐漸被研究者所認識[2-5]。流行病學和臨床觀察顯示空氣動力學直徑小于2.5 μm的PM2.5升高可使包括動脈粥樣硬化、心律失常和高血壓在內的多種心血管疾病的發病率明顯增高[8-9]，而降低PM2.5濃度則可以減緩動脈中層硬化(動脈粥樣硬化的前期病變)的進程[10]，因此目前PM2.5 已被美國心血管協會認為是動脈粥樣硬化發病的危險因素之一。

以往認為PM2.5主要通過造成肺部損傷引起全身炎癥性反應來間接影響心血管系統功能[6]，然而近年來有研究在小鼠體內證實PM2.5除滯留在肺組織外，還可以借助巨噬細胞或上皮細胞間隙進入血液循環[11]，據此有研究者提出PM2.5對心血管系統的直接毒性作用，即PM2.5可能通過直接接觸血管內皮細胞引起其功能改變或損傷最終促進心血管系統疾病的發生[3, 12]。目前有部分報道提出PM2.5可引起內皮細胞損傷，如萬強等[13]證實廣州等地的PM2.5可造成內皮細胞損傷，王菲菲等[14]證實燃煤來源的PM2.5能抑制血管內皮細胞增殖，但上述實驗僅報道了PM2.5對細胞活性的抑制效果，對于PM2.5的作用機制并未進行探討。同時為了避免PM2.5因采集地區和采集時間不同而造成的實驗誤差，本實驗購買了由美國標準與技術研究院提供的PM2.5作為研究對象，該PM2.5作為標準品或對照品被用在多個有關PM2.5毒性的體內外實驗中[15-16]。實驗采用CCK-8法也證實PM2.5可以降低血管內皮細胞EA.hy926細胞的活力，和上述研究結論一致。在此基礎上，我們進一步采用流式細胞術觀察了PM2.5對血管內皮細胞凋亡的影響，結果顯示PM2.5處理組血管內皮細胞凋亡明顯強于對照組，在實驗所用的最高濃度時細胞凋亡率是對照組的近4倍，證明引起細胞凋亡是PM2.5損傷血管內皮細胞的主要方式之一。

血管內皮細胞凋亡是多種心血管疾病發生的基礎。線粒體通路是各種細胞毒性物質引起細胞凋亡主要途徑[17]。其中主要步驟包括線粒體膜通透性增加，細胞Cyt-C釋放到胞漿中，然后Cyt-C與凋亡蛋白酶激活因子結合，并募集caspase-9形成凋亡小體，caspase-9被激活后進而裂解激活下游的凋亡執行蛋白caspase-3，破壞細胞最終引起細胞凋亡。我們采用Western blot法證實PM2.5作用后細胞胞漿內Cyt-C的含量明顯增高，caspase-9和caspase-3活化增加，說明線粒體途徑可能是PM2.5引起細胞凋亡的機制之一。

氧化應激是線粒體損傷的常見原因，2015年Lawal等[18]報道PM2.5可上調血管內皮細胞ROS生成。我們用熒光標記法在顯微鏡下見到PM2.5刺激后血管內皮細胞內熒光染色明顯增強，說明細胞內氧自由基產生增多，與其研究結果相一致。據此我們推測PM2.5可能通過誘導氧自由基生成進而損傷線粒體，使其通透性增加引起Cyt-C釋放到細胞漿內，從而啟動線粒體通路導致細胞凋亡。為了證實該推測，實驗進一步采用NAC作為氧自由基清除劑進行了研究[19]。熒光染色結果顯示加入NAC明顯抑制了PM2.5誘導的血管內皮細胞氧自由基生成，同時NAC組與PM2.5組比較血管內皮細胞凋亡顯著下降，胞漿Cyt-C含量降低、caspase-9和caspase-3活化減少，說明減少氧自由基生成可以抑制PM2.5引起的血管內皮細胞凋亡，證實了PM2.5誘導的內皮細胞凋亡與氧化應激相關。

綜上所述，本實驗發現PM2.5能夠造成血管內皮細胞氧化應激，從而通過線粒體途徑激活caspase-3誘導血管內皮細胞凋亡，這可能是其造成心血管毒性的機制之一，實驗同時證實抑制細胞的氧自由基生成可以保護PM2.5造成的血管內皮細胞損傷，為防治PM2.5相關心血管疾病提供了研究思路。此外，由于本實驗是采用體外細胞模型，將PM2.5直接施加于內皮細胞上來觀察PM2.5的毒性作用，這種模型雖然是目前體外研究中常用的方法，但可能和體內并不完全一致，因此我們在后繼研究中擬采用PM2.5呼吸道吸入的方式建立PM2.5染毒動物模型來進行進一步的研究。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Oxidative stress and apoptosis in endothelial cells exposed to PM2.5

WANG Fang1, LI Yan2, LU Xin-shuo1, YANG Jie-bo1, LIU Fang-fang2, YU Xue-song1, LI Ming1

(1SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,2SchoolofBasicMedicalScience,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China.E-mail:Lim99011@163.com)

AIM: To study the toxicity of PM2.5 in the endothelial cells by investigating the induction of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis in EA.hy926 cells exposed to PM2.5. METHODS: The endothelial cell line EA.hy926 was culturedinvitroand exposed to PM2.5 at different concentrations for 24 h. The cell viability was measured by CCK-8 assay and the generation of intracellular ROS was stained with DCFH-DA. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining, and the protein levels of cytochrome C, caspase 9 and caspase 3 was detected by Western blot. RESULTS: After the treatment with PM2.5, the viability of the EA.hy926 cells was decreased markedly and the production of ROS was increased significantly. PM2.5 exposure upregulated the expression of cytoplasm cytochrome C and activated caspase-9 and caspase-3, resulting in the increase of the cell apoptosis significantly. The ROS generation was directly involved in PM2.5-mediated endothelial cell apoptosis asN-acetyl-L-cysteine pretreatment abolished both ROS production and cell apoptosis induced by PM2.5. CONCLUSION: PM2.5 induces oxidative stress and apoptosis in the vascular endothelial cells, which may be one of the mechanisms that PM2.5 influences the function of cardiovascular system.

PM2.5; Endothelial cells; Oxidative stress; Apoptosis

1000- 4718(2017)03- 0423- 05

2016- 10- 12

2016- 11- 01

廣東省科技計劃(No. 2014A020212266；No. 2016A020215156)

△通訊作者 Tel: 020-39352194； E-mail: Lim99011@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.007