N-棕櫚酰乙醇胺對慢性束縛應激小鼠焦慮抑郁樣行為的影響*

李苗苗， 王 丹， 畢文鵬， 宋靈云， 于海玲△

(延邊大學 1醫學院， 2藥學院，吉林 延吉 133002)

N-棕櫚酰乙醇胺對慢性束縛應激小鼠焦慮抑郁樣行為的影響*

李苗苗1， 王 丹1， 畢文鵬1， 宋靈云2， 于海玲1△

(延邊大學1醫學院，2藥學院，吉林 延吉 133002)

目的： 采用慢性束縛應激小鼠模型，研究N-棕櫚酰乙醇胺(N-palmitoylethanolamide，PEA)對小鼠焦慮抑郁樣行為的影響，進一步探討PEA抗小鼠焦慮抑郁作用的可能機制。方法: 小鼠分為正常對照組、模型組、氟西汀(10 mg/kg)組和PEA 2.5、5、10 mg/kg組，每天灌胃給藥后30 min，將小鼠(除了正常對照組)放置于有機玻璃管內接受4 h的慢性束縛應激，持續21 d。第22天采用曠場實驗和強迫應激實驗觀察PEA對慢性束縛應激小鼠抑郁樣行為的影響；高架十字迷宮實驗探討PEA對慢性束縛應激小鼠焦慮樣行為的影響；水迷宮方法分析PEA對慢性束縛應激小鼠學習、記憶、空間定向和認知功能等方面的作用；ELISA方法檢測慢性束縛應激小鼠血清促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、皮質醇(cortisol，CORT)及海馬5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)含量的變化；可見分光光度法檢測海馬乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)活性的改變。結果: 與模型組相比，在小鼠強迫應激實驗中，PEA及氟西汀組小鼠不動時間明顯減少；曠場試驗中，PEA及氟西汀明顯增加小鼠水平移動距離及運動總時間，但只有PEA 10 mg/kg及氟西汀組增加了小鼠直立次數；在高架十字迷宮實驗中，PEA及氟西汀明顯增加小鼠開臂進入次數、開臂停留時間百分比及在臂總移動距離；在水迷宮實驗中，PEA 5、10 mg/kg及氟西汀組明顯縮短小鼠尋臺潛伏期，PEA 10 mg/kg及氟西汀組明顯縮短小鼠搜尋距離。與應激模型組比較，PEA 2.5～10 mg/kg及氟西汀顯著降低小鼠血清中ACTH水平，PEA 5、10 mg/kg及氟西汀顯著降低小鼠血清CORT水平及小鼠腎上腺指數，PEA 10 mg/kg及氟西汀顯著增高海馬5-HT含量，降低海馬AChE活性，但PEA 2.5和5 mg/kg組海馬組織中5-HT含量及AChE活性則無明顯改變。結論: PEA對束縛應激模型小鼠的焦慮及抑郁樣行為具有一定的拮抗作用，其具體作用機制可能與調節下丘腦-垂體-腎上腺軸功能、增加海馬單胺類遞質5-HT水平及參與中樞膽堿系統的調節有關。

N-棕櫚酰乙醇胺； 束縛應激； 焦慮； 抑郁

焦慮和抑郁癥是兩種最常見的慢性病，屬于精神系統疾病[1]。抑郁癥患者通常表現出顯著而持久性心境低落、思維遲緩和意志活動降低。焦慮癥是指在缺乏相應的客觀因素情況下，表現為顧慮重重、緊張恐懼，伴有心悸、出汗、手抖、尿頻等自主神經功能紊亂癥狀。近期研究表明，焦慮障礙與抑郁障礙的共病在臨床上非常普遍，具有癥狀明顯、病程多遷延易反復、社會功能損害、出現自殺觀念及行為、預后差等特征。抑郁癥的患者常伴有焦慮癥狀，焦慮又可加重抑郁的癥狀。但目前常用的選擇性5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)再攝取抑制劑類抗抑郁藥對頑固的抑郁癥尚不能達到滿意療效，且存在副作用，故研究和開發更高效的抗抑郁藥物一直是近些年研究的熱點。

N-棕櫚酰乙醇胺(N-palmitoylethanolamide，PEA)作為內源性大麻素類似物，屬于內源性脂肪酸乙醇胺家族(結構見圖1)，具有抗炎[2]、鎮痛[3]、抗驚厥、抗癲癇作用[4]和其它神經活性[5]。PEA在中樞神經系統內廣泛分布，多由神經元和神經膠質細胞分泌，其抗痛覺過敏和神經保護特性主要與神經元活動的減少相關。越來越多的證據表明，PEA可能在中樞神經系統神經退行性疾病中發揮神經保護作用[6]，特別是在周圍神經病變模型中[7]。近年來生理學及藥理學對PEA作用的研究日漸增加。Cordaroa等[3]研究發現，靜脈注射PEA可以預防糖尿病大鼠的腎功能不全和改善腎切除手術后造成的生化指標紊亂。在小鼠福爾馬林疼痛實驗中，PEA和反胺苯環醇聯合應用可以增強單獨應用時的鎮痛效果[8]。在本實驗室的前期研究中也發現PEA在小鼠強迫游泳和懸尾實驗中均表現出明顯的抗抑郁作用[9]。

Figure 1.The structure of N-palmitoylethanolamide.

為了進一步探討PEA對束縛應激小鼠的抗焦慮及抗抑郁作用，本研究采用兩種經典的小鼠強迫應激模型(懸尾實驗和強迫游泳實驗)以及曠場實驗，探討PEA對束縛應激模型小鼠的抗抑郁作用；采用高架十字迷宮實驗探討PEA對束縛應激小鼠的抗焦慮作用；采用水迷宮方法分析PEA對小鼠學習、記憶等方面的影響。我們還采用生化實驗方法檢測小鼠血清中促腎上腺皮質激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH)和皮質醇(cortisol，CORT)水平以及海馬中5-HT含量，探討PEA是否通過調節下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA軸)以及經典單胺類神經遞質5-HT含量，改善束縛應激引發的焦慮抑郁樣癥狀，從而發揮其潛在的抗焦慮、抗抑郁作用；另外采用分光光度法檢測海馬乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)含量的變化，以分析PEA對小鼠學習記憶的影響是否與其改變AChE的活性有關，以進一步探討PEA在改善小鼠束縛應激中的作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物

健康雄性清潔級昆明種小鼠，體重20～24 g，延邊大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(吉2011-0007)。動物經適應性喂養3 d后，隨機分組，自由攝食和飲水，自然光照，在溫、濕度恒定[室溫(23±2) ℃，相對濕度(55±5) %]的清潔空調室內飼養。每籠5只。行為學實驗于上午9:00～11:00 之間，各實驗組在安靜溫暖的環境中，平行進行。

2 主要藥品與儀器

2 .1 藥品與試劑 受試化合物PEA，其結構式見圖1，延邊大學藥學院提供; 氟西汀(fluoxetine)購自上海中西制藥有限公司；羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose)購自沈陽化學試劑廠；小鼠ACTH和CORT酶聯免疫試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)；小鼠5-HT酶聯免疫試劑盒(上海酶聯生物技術有限公司)；BCA法總蛋白測定測試盒和AChE測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。PEA和氟西汀均于實驗前用0.3%羧甲基纖維素鈉配置成混懸溶液備用，藥物均按動物每公斤體重給予。

2.2 實驗儀器 TST-100小鼠懸尾實驗視頻分析系統和TM-Vision行為學實驗系統(成都泰盟軟件有限公司)；DW-2102A酶聯免疫檢測儀(北京六一生物科技有限公司)；UV-5800可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；DW-40L262醫用低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)。

3 方法

3.1 動物分組及模型制備 60只小鼠適應性飼養3 d后，按體重隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照組(氟西汀10 mg/kg)和PEA(2.5、5和10 mg/kg)劑量組，每組10只，每天上午8:00～9:00 灌胃給藥，灌胃0.5 h后，除正常對照組小鼠外，其它小鼠接受4 h的慢性束縛應激，持續21 d。慢性束縛應激模型制備方法為將小鼠放置在有機玻璃制成的束縛管內，其長度和直徑分別是25和2.5 cm，束縛管表面設小孔以確保通風良好。小鼠在束縛管內有限的空間活動, 但不會造成肉眼可見的軀體上的傷害。在此階段，小鼠禁食水直至應激完成。

3.2 曠場實驗(open field test，OFT) 實驗裝置由曠場反應箱以及數據自動采集和處理系統兩部分組成。OFT-100實驗系統是一個不透明的塑料容器(625 mm×740 mm×510 mm)，實驗區的體積是525 mm×525 mm×415 mm。底面被分為25個區域，實驗全程由計算機控制并記錄。動物活動性被TM-Vision行為學實驗系統檢測，全程由敞箱上方攝像機錄制，其視野可覆蓋整個敞箱。在實驗過程中，實驗區分為4個區域：四邊、四角、四周和中央區域，每只小鼠被單獨放置在實驗區的中心，記錄3 min內的實驗數據。實驗者將動物輕柔地置于實驗區中央，在實驗間歇期，實驗器材四壁和底面均用10%乙醇擦拭，以避免對下只小鼠的影響。

3.3 懸尾實驗(tail suspension test，TST) 小鼠懸尾實驗的活動性由TST-100懸尾視頻分析軟件測試。懸尾實驗參照Steru等的方法[10-11]，實驗裝置有6個活動區域，以確保實驗平行進行，實驗者用醫用膠帶在距小鼠尾尖2 cm處粘貼，沿附固定桿方向進行粘貼固定，將固定磁鐵吸附于小鼠活動箱通道頂部，小鼠倒置懸掛在活動箱空間內，確保小鼠頭部距底面5 cm。實驗在安靜、微光的室內進行，全程由攝像機記錄，實驗者可以觀察小鼠掙扎反應強度并通過計算機記錄小鼠累計不動時間。

3.4 強迫游泳實驗(forced swimming test，FST) 強迫游泳測試實驗方法參照Porsolt等[12]和本研究室以前的方法[11]，以小鼠累計不動時間作為小鼠抑郁狀態評估[13-14]。實驗中，小鼠被單獨放入一個透明的玻璃容器(高22 cm，直徑14 cm)，水深10 cm，水溫(25±0.5) ℃，測試環境保持安靜，各受試組平行測量，小鼠自由游泳，當小鼠頭露出水面呈漂浮狀態而不盡力尋求逃脫，反映了其絕望和無助狀態[15]，測試時間為6 min，觀察后4 min內小鼠累計不動時間。

3.5 高架十字迷宮 (elevated plus maze, EPM)實驗 裝置由高架臺和TM-Vision行為學實驗系統兩部分組成。該裝置分為2個開臂和2個閉臂，距底面高度為100 cm，小鼠被單獨放入中心區，面向閉臂。測試全程保持環境安靜，微光下進行，實驗過程由攝像頭記錄，當小鼠四肢都進入開臂或閉臂時數據才能被記錄。為排除人為因素，實驗者盲選動物，實驗測試時間為3 min。每只小鼠測試后，均用10%乙醇擦拭設備，以避免上一只小鼠留下的氣味對下一只受試小鼠的影響。計算動物在開臂停留時間百分比和開臂進入次數百分比。

3.6 水迷宮(water maze)實驗 裝置由水迷宮設備和TM-Vision行為學實驗系統兩部分組成。在正式實驗前，小鼠經過2 d的低難度訓練。第3天，每只小鼠接受3 min測試，由攝像機記錄小鼠找到安全區域所需時間和運動距離，進行統計學分析。每只小鼠在接受測試后用干毛巾擦拭身體并置于安靜溫暖環境中。

3.7 生化檢測標本制備 最后一次行為學檢測結束后1 h，斷頭取血，分離血清；快速取腦，冰上分離雙側海馬；開腹摘取腎上腺、稱重，標本于-80 ℃保存備用。

3.8 ACTH、CORT 和5-HT的測定 小鼠血清ACTH和CORT以及海馬5-HT檢測均采用酶聯免疫試劑盒。實驗方法參照使用說明書，具體操作步驟如下：稀釋標準品，具體檢測孔包括標準孔、樣本孔和空白孔，添加100 μL辣根過氧化物酶，37 ℃ 孵育30 min，洗滌液每孔洗滌5次，最后1次洗后，拍干剩余清洗液，分別將50 μL顯色劑A和顯色劑B加入孔中，輕輕晃動混勻，37 ℃避光顯色15 min，加入終止液50 μL，空白孔調零，終止液加入后15 min，450 nm測定吸光度值。血清ACTH和CORT分別以ng/L和 μg/L表示。5-HT含量用ng/g海馬組織蛋白表示。

3.9 AChE活性的測定 海馬AChE的活性根據AChE試劑盒使用說明書，以可見分光光度法，在波長412 nm處，0.5 cm光徑下檢測其吸光度值，計算小鼠海馬AChE的活性，單位以×103U/g 海馬組織蛋白表示。

4 統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學處理。數據均以均數±標準誤 (mean±SEM)表示，多組間比較用單因素方差分析和Bonferroni多重檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PEA對強迫應激小鼠不動時間的影響

在連續用藥21 d后，由圖2可見，束縛應激模型組與正常對照組相比，小鼠懸尾不動時間及強迫游泳不動時間均明顯延長(P<0.01)；與模型對照組比較，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠懸尾不動時間減少32%、35%和29%(P<0.05)，強迫游泳不動時間減少33%、39%和35%(P<0.05)，PEA 2.5 mg/kg組小鼠的強迫游泳不動時間減少29%(P<0.05)，但此劑量組小鼠的懸尾不動時間則無明顯改變。

Figure 2.The effect of PEA on immobility time in tail suspension test (TST) and forced swimming test (FST) in the mice. Mean±SEM. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs model group; ##P<0.01 vs control group.

2 PEA對小鼠曠場實驗行為的影響

在連續用藥21 d后，束縛應激模型組小鼠與正常對照組相比，水平移動總距離及運動總時間，直立次數均明顯減少(P<0.05)；與模型對照組比較，PEA 2.5、5、10 mg/kg和氟西汀均明顯增加小鼠的水平移動總距離和運動總時間(P<0.05)，但只有PEA 10 mg/kg及氟西汀增加了小鼠直立次數(P<0.05)，見圖3。

3 PEA對高架十字迷宮實驗小鼠行為學的影響

如圖 4顯示，束縛應激模型組小鼠與正常對照組比較，開臂停留時間百分率及開臂進入次數百分率均明顯縮短(P<0.01)；與模型對照組比較，PEA 2.5、5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠開臂進入次數百分比明顯延長(P<0.05)，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠開臂停留時間百分率明顯延長(P<0.05)，而PEA 2.5 mg/kg組小鼠開臂停留時間百分率與模型組相比無明顯差異，但與正常對照組相比卻明顯縮短(P<0.05)，說明PEA 2.5 mg/kg劑量組無明顯改變小鼠開臂停留時間百分率作用。與模型對照組相比，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀明顯延長小鼠在十字迷宮總在臂移動距離(P<0.05)。

4 PEA對水迷宮實驗小鼠行為學的影響

圖5顯示，束縛應激模型組小鼠與正常對照組比較，水迷宮實驗中的逃逸潛伏期及總游泳距離均明顯延長(P<0.01)；與模型對照組比較，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠逃逸潛伏期明顯縮短(P<0.05)，PEA 10 mg/kg和氟西汀組小鼠總游泳距離明顯縮短(P<0.05)。

以上行為學結果提示PEA 2.5～10 mg/kg劑量組可以一定程度地改善小鼠的焦慮和抑郁癥狀，且存在一定的量效關系。

5 PEA對束縛應激小鼠腎上腺指數的影響

由圖6 顯示，束縛應激模型組小鼠與正常對照組比較，腎上腺指數明顯增加(P<0.01)；與模型對照組比較，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠的腎上腺指數明顯降低(P<0.05)。

6 PEA對束縛應激小鼠ACTH和CORT的影響

表 1 結果顯示，21 d的束縛應激后模型組小鼠與正常對照組比較，小鼠血清ACTH和CORT水平均明顯增高(P<0.01)；與應激模型組比較，PEA 2.5、5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠血清ACTH水平顯著降低(P<0.05)，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠血清CORT水平顯著降低(P<0.05)。

Figure 3.The effect of PEA on the open field test in the mice. Fxt: fluoxetine. Mean±SEM. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs model group; #P<0.05 vs control group.

Figure 4.The effect of PEA on the elevated plus maze test in the mice. A: the percentages of the time spent in open arms and the entries into open arms; B: the total distance of mouse movements in four arms. Mean±SEM. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs model group; ##P<0.01 vs control group.

Figure 5.The effect of PEA on the water maze test in mice. A: the escape latency; B: the total swimming distance. Mean±SEM. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs model group; ##P<0.01 vs control group.

Figure 6.The effect of PEA on the changes of mouse adrenal index. Mean±SEM. n=10. *P<0.05 vs model group; ##P<0.01 vs control group.

表1 血清ACTH和CORT含量測定結果的比較

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vscontrol group.

7 PEA對束縛應激對小鼠5-HT含量和AChE活性的影響

由表2顯示，21 d 的束縛應激后模型組小鼠與正常對照組比較，海馬5-HT含量降低(P<0.01)，AChE活性增高(P<0.05)；與應激模型組比較，PEA 10 mg/kg和氟西汀組小鼠海馬5-HT水平顯著增高(P<0.05或P<0.01)，AChE水平顯著降低(P<0.05)。

表2 海馬5-HT含量和AChE活性的測定結果

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vscontrol group.

討 論

近年來研究發現，應激和抑郁癥密切相關。慢性、低強度、長期的應激源是促進抑郁發生、加速抑郁癥發展的主要原因。應激動物模型通常被用在抑郁癥的病理生理機制研究和抗抑郁藥物篩選等方面[16]。慢性束縛應激模型是抑郁癥常用的應激模型，具有可操作性強、重復性好的特點，其作為一種對機體無損傷性刺激，且能夠模擬抑郁癥的核心癥狀(快感缺乏)，被廣泛應用于抑郁癥機制研究和藥物篩選模型的制備[17]。若抑郁癥或焦慮癥發生，動物行為會表現為抑制狀態，機體出現神經-內分泌系統紊亂、神經遞質失衡，而抗抑郁藥可緩解或逆轉此類癥狀。

小鼠TST和FST是評價抗抑郁藥物的兩種經典動物模型，在動物無法擺脫環境刺激而導致絕望行為時，給予抗抑郁藥物可使其累積不動時間減少。本實驗結果顯示，慢性束縛應激21 d后，模型組小鼠累計不動時間明顯延長，連續灌胃給藥21 d后，受試化合物PEA 2.5～10 mg/kg及陽性對照藥氟西汀10 mg/kg組小鼠表現為累計不動時間顯著減少，且PEA 10 mg/kg組小鼠不動時間的減少程度明顯強于氟西汀10 mg/kg劑量組，說明PEA對于慢性束縛應激誘導的小鼠抑郁樣行為具有改善作用，且效果優于等劑量的氟西汀。

OFT通常被用來探究實驗動物在新異環境中的自發活性、探索性行為、抑郁樣行為和對新環境的警覺性，能夠反映中樞神經系統的興奮性[18]。OFT實驗中的直立次數、靜止時間和運動距離反映動物的活動性及其探索行為。EPM被用來評價小鼠焦慮樣行為，這是對于探究-回避沖突產生的條件性應答，與小鼠大腦邊緣區、海馬、杏仁核、中縫背核等腦區密切相關[19]。焦慮行為產生下，小鼠進入開放臂的次數和時間均明顯多于封閉臂，而抗焦慮藥能明顯逆轉此狀況，使動物進入開放臂的次數和時間增加。通過計算動物在開臂停留時間百分比和開臂進入次數百分比以評價抗焦慮抑郁藥的作用，兩者均升高表示該藥物具有抗焦慮樣作用[20]。

慢性束縛應激21 d后，OFT實驗中模型組小鼠總運動時間和總運動距離均顯著減少，表明小鼠活動遲緩，自主活動性降低；其直立次數減少說明小鼠對于外界的探索意識降低。EPM實驗中，模型組小鼠開臂/在臂進入次數百分比，開臂/在臂滯留時間百分比和總在臂運動距離均明顯降低，表明小鼠的探索性和活動性降低，表現出明顯的焦慮樣行為。在給予慢性束縛應激小鼠21 d藥物處理后，PEA 2.5～10 mg/kg顯著逆轉了慢性束縛應激所造成的小鼠自主活動和探索性降低現象，說明PEA可能對抑郁癥的運動遲緩和焦慮癥的探索性降低等行為均具有改善作用，存在潛在的抗焦慮和抗抑郁作用。

學習記憶是人類大腦的主要功能，其形成是一個復雜認知過程，主要涉及神經生理機制及生化機制兩方面，包括獲得、鞏固、保持和再現4個階段[21]。水迷宮的主要機制是通過動物努力逃避水環境而激發其學習和記憶能力[17, 22]，通過訓練次數增加，小鼠對固定位置(隱蔽平臺)產生記憶力得到鞏固，形成穩定的空間位置認知。越來越多的研究表明，長期應激將會損壞動物的空間學習和記憶能力[23-24]。水迷宮的實驗結果顯示，與空白對照組相比，模型組小鼠水迷宮尋臺潛伏期明顯增加，固定時間內的運動距離也增加，表明慢性束縛應激使小鼠學習興趣降低，學習記憶能力受損，空間認知能力也明顯下降，可能與慢性束縛應激引起的小鼠反應遲鈍，學習記憶能力下降有關，與文獻相符[24]。PEA 5、10 mg/kg及氟西汀10 mg/kg組小鼠水迷宮尋臺潛伏期顯著縮短，說明5～10 mg/kg PEA對小鼠學習記憶能力有一定改善作用；PEA 10 mg/kg及氟西汀10 mg/kg組小鼠水中運動距離明顯減少，說明PEA 10 mg/kg可以改善小鼠空間認知能力。本研究中PEA對應激小鼠學習記憶能力的改善是由于其對小鼠焦慮抑郁行為的改善作用抑或由于其它機制的作用，為此本課題組也初步探討了其對海馬膽堿系統的影響。

HPA軸是神經內分泌系統的樞紐，維持著機體內環境穩定。精神神經系統研究發現，抑郁癥多伴隨HPA軸功能亢進[25]。HPA軸由下丘腦、垂體和腎上腺3個部分構成整個反饋系統，三者相輔相成。HPA軸是應激反應的中樞，機體在接受長期的應激下，HPA軸不斷激活，通過作用于腎上腺皮質，誘發糖皮質激素過度分泌。HPA軸持久的機能亢進可以嚴重影響人體腎上腺的功能和結構[26]。有報道長期的應激引起促腎上腺皮質激素釋放激素、ACTH和糖皮質激素釋放[27]，形態學觀察表現為小鼠腎上腺皮質增生，髓質萎縮，故檢測過程中可以出現腎上腺指數的顯著增加，這與HPA軸機能亢進密切相關。

慢性束縛應激21 d后，與空白對照組相比，慢性束縛應激模型小鼠血清ACTH和CORT水平顯著增高，腎上腺指數也增加，提示模型組小鼠存在HPA軸功能亢進；與應激模型組比較，PEA 2.5～10 mg/kg和氟西汀10 mg/kg顯著降低小鼠血清ACTH水平，PEA 5、10 mg/kg顯著降低小鼠血清CORT水平和小鼠腎上腺指數。這些結果提示PEA可逆轉應激誘導的腎上腺增生、ACTH和CORT分泌異常增加，緩解應激引發的小鼠焦慮抑郁樣癥狀，其效應與陽性對照藥氟西汀無明顯區別。

5-HT為單胺類神經遞質，目前普遍認為其腦內含量異常是抑郁癥主要發病機制之一。5-HT假說認為抑郁癥是由于中樞神經系統中5-HT釋放減少，突觸間隙含量下降所致，并且直接參與調節精神與情緒變化[28]。越來越多的研究表明，5-HT含量耗竭后，在動物受到應激之后，其抑郁、焦慮等癥狀表現更加明顯，認知和空間記憶能力也顯著下降，抗抑郁藥物治療后，伴隨中樞內5-HT含量的增加其抑郁癥狀亦明顯改善[26, 29]。這與本實驗的結果相符，在慢性束縛應激21 d后，小鼠海馬5-HT含量顯著下降。在經過陽性對照藥氟西汀(5-HT再攝取抑制劑，通過抑制5-HT轉運體、增加突觸間隙中5-HT含量發揮抗抑郁作用)10 mg/kg及PEA 10 mg/kg處理后其海馬5-HT含量明顯升高，但PEA 10 mg/kg對海馬5-HT的增高程度低于等劑量的氟西汀，且PEA 2.5、5 mg/kg組對小鼠海馬5-HT含量無明顯影響，說明PEA對中樞5-HT的調節效應弱于5-HT再攝取抑制劑氟西汀。以上結果提示PEA抗焦慮抑郁樣作用的機制可能與調節HPA軸功能和5-HT含量有關，且存在一定的量效關系，但對單胺類遞質5-HT的作用可能不是其主要機制。

在腦內神經遞質中，分布廣泛的乙酰膽堿與學習記憶密切相關，其主要功能是維持意識的清醒[30]，乙酰膽堿酯酶參與乙酰膽堿的分解，膽堿酯酶的含量和腦內膽堿能纖維分布復雜性決定了中樞膽堿能系統在影響認知功能方面的重要性[31-32]。Mineur等[23]研究證實膽堿能信號還參與焦慮和情緒相關行為。Müller等[33]通過藥動學數據分析表明，臨床上常用的抗抑郁藥氟西汀為人類血清和紅細胞膜的膽堿酯酶抑制劑，Machado等[29]也證實，嗅球切除抑郁模型小鼠表現出抑郁樣行為同時伴隨海馬乙酰膽堿酯酶活性的增加，而氟西汀慢性應用可以逆轉此效應。本研究中對海馬乙酰膽堿酯酶的檢測結果顯示，與空白對照組相比，慢性束縛應激模型小鼠AChE活性顯著增加，說明慢性束縛應激可以通過提高AChE活性以增加ACh的水解，從而降低ACh水平而使小鼠學習記憶能力下降。與模型組比較，僅PEA 10 mg/kg及氟西汀10 mg/kg可以降低小鼠海馬AChE活性，PEA 2.5、5 mg/kg對小鼠AChE活性均無明顯影響。因為乙酰膽堿的生物學功能與乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿轉移酶水平、膽堿能受體亞型的結合能力和突觸前后乙酰膽堿受體數目均直接相關，所以單一指標檢測無法完全評估藥物對中樞乙酰膽堿系統的影響，僅初步推測中樞膽堿系統也可能參與了PEA的抗焦慮抑郁樣作用，確切結論尚需要進一步研究。

綜上所述，PEA 2.5～10 mg/kg可以改善慢性束縛應激小鼠抑郁及焦慮樣行為，且存在一定的量效關系，其作用機制可能與逆轉亢進的HPA軸功能及增高中樞5-HT含量，參與中樞膽堿系統調節有關，但其具體作用機制有待進一步研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects ofN-palmitoylethanolamide on anxiety- and depression-like behaviors in mice induced by chronic restraint stress

LI Miao-miao1, WANG Dan1, BI Wen-peng1, SONG Ling-yun2, YU Hai-ling1

(1CollegeofMedicine,2CollegeofPharmacy,YanbianUniversity,Yanji133002,China.E-mail:hlyu@ybu.edu.cn)

AIM: To study the effects ofN-palmitoylethanolamide (PEA) on the anxiety- and depression-like behaviors of the mouse model induced by restraint stress, and to explore the possible mechanism of anxiolytic and antidepressant effects of PEA.METHODS: The mice were intragastrically treated with 2.5, 5 and 10 mg/kg of PEA for 21 consecutive days once daily. Thirty min after intragastric administration, the mice (except the normal control group) were placed in the glass tube to accept 4-h chronic restraint stress for 21 d. After the last administration, the mice were submitted to the forced stress test and the open field test (OFT) to observe the effects of PEA on the depression-like behaviors. The cumulative immobility time was recorded during the 4-min interval in the forced swimming test (FST) or during the 5-min interval in the tail suspension test (TST). The elevated plus maze (EPM) test was used to investigate the effect of PEA on the mouse anxiety-like behaviors, and the water maze method was used to investigate the learning and memory abi-lities, spatial orientation and cognitive function of mice. After the behavior tests, the serum was collected and the hippocampus was removed. The serum contents of adrenocorticotropic hormone (ACTH), cortisol (CORT) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) in the hippocampus were detected by ELISA. The changes of acetylcholinesterase (AChE) activity in the hippocampal homogenate was measured by spectrophotometry. RESULTS: Compared with model group, in the FST or TST, the immobility time in the mice treated with PEA at 2.5～10 mg/kg and fluoxetine was significantly reduced. In the OFT, the total locomotion distance and total movement time were increased significantly in the mice, but only 10 mg/kg PEA and fluoxetine increased the numbers of rearing. In the EPM test, the percentage of the time spent in open arms, the entries into open arms and the total locomotion distance in 4 arms in the mice were significantly increased. In water maze test, PEA at 5 and 10 mg/kg and fluoxetine significantly shortened the latency to find the security zone in the mice, and PEA at 10 mg/kg and fluoxetine obviously shorten the swimming distance. Compared with model group, PEA at 10 mg/kg and fluoxetine reduced the mouse serum levels of ACTH and CORT, and the adrenal index, increased the 5-HT content and decreased the AChE activity in the hippocampus. CONCLUSION: PEA produces antagonistic effects on an-xiety- and depression-like behaviors in the mice induced by restraint stress. Its specific mechanism may be related to the re-gulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis function by increasing the 5-HT level in hippocampus, thus participating in the regulation of central cholinergic system.

N-palmitoylethanolamide; Restraint stress; Anxiety; Depression

1000- 4718(2017)03- 0435- 09

2016- 10- 29

2016- 12- 22

國家自然科學基金資助項目(No. 81460217)

△通訊作者 Tel: 0433-2435153； E-mail: hlyu@ybu.edu.cn

R363; R749

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.009