GDF10在神經病理性疼痛大鼠脊髓中的表達*

江 龍， 李 森， 王 莉， 洪有建， 劉 媛， 伍亞民， 黃顯凱

(第三軍醫大學大坪醫院創傷外科， 重慶 400042)

GDF10在神經病理性疼痛大鼠脊髓中的表達*

江 龍， 李 森， 王 莉， 洪有建， 劉 媛， 伍亞民， 黃顯凱△

(第三軍醫大學大坪醫院創傷外科， 重慶 400042)

目的： 觀察生長和分化因子10(GDF10)在神經病理性疼痛大鼠脊髓中的表達變化。方法: 取雄性SD大鼠60只，通過結扎左側L5脊神經制備神經病理性疼痛模型，于術前1 d，術后當天及術后1 d、3 d、10 d、21 d檢測大鼠左后爪50%縮爪閾值，并采用免疫熒光染色及Western blot檢測大鼠L5脊髓后角GDF10的表達變化。結果: 脊神經結扎大鼠在術后1 d縮爪閾值開始降低，自3 d起，與正常對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，到10 d閾值下降最明顯，至21 d呈現持平狀態。免疫熒光檢測觀察到傷側L5脊髓組織中GDF10主要表達于脊髓背角神經元細胞的胞漿內。GDF10在術后持續降低，到10 d降低最為顯著，與正常組相比差異具有統計學意義(P<0.05)，一直持續低水平表達至21 d。Western blot證實術后10 d脊髓中GDF10蛋白的表達較正常組大鼠明顯降低(P<0.05)。 結論: 大鼠脊神經結扎使脊髓背角中GDF10表達減少，其減少可能與大鼠脊神經損傷后對機械刺激引起的疼痛過敏有關聯。

神經病理性疼痛； 脊髓背角； 生長和分化因子10； 縮爪閾值

神經病理性疼痛是一種嚴重影響生活質量的慢性疼痛性疾病，主要表現為自發性疼痛和痛覺過敏。但是由于我們對其病理發生機制并不完全清楚，所以阻礙了開發新的用于神經病理性疼痛的治療方法。因此，研究神經病理性疼痛的機制，對開發新的治療神經病理性疼痛的藥物具有重要意義[1]。

轉化生長因子β(transforming growth factor，TGF-β)超家族是一類具有多功能并且具有環境依賴性的細胞因子，由超過30種蛋白質所組成。在哺乳動物，這類因子分為不同的亞家族：TGF-β、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、活化素(activin)、生長和分化因子(growth and differentiation factor，GDF)等。TGF-β家族是由細胞內的大前體蛋白所產生，作為細胞外分泌的同二聚體或者異二聚體而引發生物學反應。TGF-β超家族成員是通過Ⅰ型絲氨酸/酪氨酸激酶受體(TGFβRⅠ)、Ⅱ型活化素受體樣激酶(activin receptor-like kinases，ALKs)或BMP Ⅰ型受體(BMPR Ⅰ)、BMP Ⅱ型受體(BMPR Ⅱ)傳遞信號[2]。TGF-β1具有神經炎癥抑制作用，不但可以預防神經損傷造成的神經病理性疼痛，還能逆轉已穩定存在的神經病理性疼痛[3]。生長和分化因子10(growth and differentiation factor 10, GDF10)是BMPs亞家族成員之一，與其它亞家族成員相比，GDF10有著獨特的基因結構，并且信號是通過TGFβRⅠ/Ⅱ傳導而非BMPRⅠ/Ⅱ[4]。對GDF10在神經病理性疼痛中的作用及機制的研究對干預神經病理性疼痛的發生及維持具有中重要意義，而有關其在神經損傷引起的神經病理性疼痛中的變化及作用尚未見報道。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

成年雄性SD大鼠60只，體重230～250 g，由第三軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所動物中心提供。

2 主要試劑和儀器

抗GDF10兔多克隆抗體(北京博奧森)；抗小鼠GAPDH單克隆抗體(Proteintech)；抗神經元特異性核蛋白(neuron-specific nuclear protein, NeuN)單克隆抗體、抗膠質細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)單克隆抗體、PVDF膜和ECL化學發光底物(Miliipore)；山羊抗兔Alexa Fluor 488熒光Ⅱ抗、山羊抗兔IgG/HRP Ⅱ抗和山羊抗小鼠IgG/HRP Ⅱ抗(北京中杉金橋)；Triton X-100、DAPI和Tween 20(Sigma)；RIPA裂解液、PMSF和Alexa Fluor 647熒光標記的山羊抗小鼠Ⅱ抗(碧云天)；蛋白酶抑制劑(Roche)。低溫離心機(Beckman)；冰凍切片機和von Frey針刺痛覺測試套件(Stoelting)；激光共聚焦掃描系統(Leica)；蛋白質電泳和免疫印跡系統、凝膠成像系統(Bio-Rad)。

3 方法

3.1 動物模型的制作 隨機將大鼠分為正常組(10只)、假手術組(10只)和手術組(40只)。采用大鼠左側L5脊神經結扎(spinal nerve ligation，SNL)術制作大鼠神經病理性疼痛模型[5]。SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，將大鼠俯臥位固定在鼠板上，背部皮膚備皮，確定兩側髂嵴，兩側髂嵴連線與脊柱相交處為L6棘突，以相交處為中點，作背部正中一長為3 cm的縱行切口，沿脊柱左側椎旁肌作縱行切口，撐開器撐開后用止血鉗鈍性分離肌肉筋膜，暴露L6橫突后用蚊氏鉗咬除L6橫突，注意不要損傷橫突下的脊神經，咬除L6橫突后可見L4和L5脊神經，分離L4和L5脊神經，用5-0手術絲線結扎L5脊神經遠端，局部注射青霉素溶液后依次縫合肌肉、皮膚，置于鼠籠內25 ℃恒溫待蘇醒。對照組僅暴露分離L5脊神經而不予以結扎。凡有運動功能障礙、無觸覺異常的大鼠不入組。正常組大鼠不予以任何處理，假手術組大鼠僅暴露分離左側L5脊神經而不予以結扎。模型組大鼠取材時間點為1 d、10 d和21 d。

3.2 50%縮爪閾值的測定 根據Dixon報道的“up and down”方法[6]，用von Frey針刺痛覺測試套件對大鼠進行50%縮爪閾值測定，從0.41 g的von Frey針刺痛覺測試套件開始，刺激大鼠左后爪足底，刺激維持2～3 s，觀察大鼠6次的反應，以突然把腳抬離von Frey針刺痛覺測試套件為陽性反應，測量6次的結果，對照閾值表查出50%縮爪閾值。

3.3 免疫熒光觀察 各組大鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，經心臟灌注0.01 mol/L PBS 200 mL至經心耳流出的液體無色透明為止，再灌注4%多聚甲醛150 mL固定后，取腰膨大脊髓，于固定液中后固定過夜后，依次經含20%、30%蔗糖的0.1 mol/L PBS中脫水沉底后行連續冰凍切片，切片厚30 μm，切片挑入切片保護液中-20 ℃保存備用。免疫熒光實驗步驟：切片撈入0.01 mol/L PBS中漂洗3次，每次10 min；用含0.3% Triton的正常山羊血清(5%)中封閉1 h；單標為GDF10(1∶100)；雙標為GDF10(1∶100)與NeuN(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜；PBS漂洗10 min×3次；加入Alexa Fluor 488熒光標記的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶200)，Alexa Fluor 647熒光標記的山羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶200)，37 ℃孵育1 h；PBS漂洗3次，每次10 min；DAPI (10 mg/L) 3 min；PBS漂洗3次，每次5 min；50%甘油封片。于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

3.4 Western blot實驗 正常組、假手術組和模型10 d組大鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，冰上取L5節段左側脊髓后放入液氮中備用。于10 mL RIPA裂解液中加入100 μL PMSF和一片蛋白酶抑制劑配制組織蛋白裂解液。將脊髓組織按照按1∶10的比例加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，勻漿后置于冰上裂解30 min，隨后用超聲儀打碎細胞5 min，4 ℃、12 000 r/min離心25 min后吸取上清，用BCA法測定蛋白濃度，定量并分裝后置于-80 ℃保存備用。大鼠脊髓蛋白樣品經10% SDS-PAGE(80 V 20 min；120 V直到溴酚藍指示劑到底部)分離后，濕轉法電轉至PVDF膜(恒流300 mA 70 min)，按照分子量大小位置裁剪GDF10(50 kD)與GAPDH(35 kD)所在位置的PVDF膜，用含0.1% Tween 20 的TBST配制的5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，分別在PVDF膜上加入兔GDF10多抗(1∶500)和小鼠GAPDH單抗(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次10 min，分別加入TBST配制的山羊抗兔IgG/HRP Ⅱ抗(1∶5 000)和山羊抗小鼠IgG/HRP Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次，ECL發光底物顯色，于凝膠成像系統中掃描采集圖像。

4 統計學處理

運用SPSS 19.0軟件對數據進行處理。結果用均數±標準差(mean±SD)表示。組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 左側L5脊神經結扎后大鼠痛覺行為的變化

實驗組大鼠術側后肢50%縮爪閾值從術后1 d開始即持續下降，到10 d閾值下降最明顯，至21 d呈現持平狀態，自3 d起,與正常對照組相比各時點的差異均有統計學意義(P<0.05)，表明術后機械痛敏顯著增加，見圖1。

Figure 1.50% paw withdrawal threshold in each group. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs normal group; #P<0.05 vs sham group.

2 大鼠術側脊髓背角GDF10表達變化

用免疫熒光染色檢測了L5脊髓背角GDF10的表達變化，結果顯示正常組和假手術組大鼠脊髓背角中有大量GDF10的表達。手術組大鼠術側GDF10表達則在術后1 d、3 d、10 d和21 d逐漸減少，且以10 d減少最為明顯，在21 d時呈持續低水平表達；手術組與正常對照組、假手術組GDF10免疫熒光強度的差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.Immunofluorescence observation of GDF10 in the rat spinal dorsal horn of each group. The scale bar=160 μm. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs normal group; #P<0.05 vs sham group.

3 GDF10在脊髓背角神經元中的表達

為明確GDF10是否由在背角神經元中表達，通過NeuN和GDF10雙標顯示大鼠脊髓背角中能觀察到大量NeuN和GDF10雙標的神經元，提示GDF10在脊髓背角神經元中特異表達，見圖3。

Figure 3.Double staining of NeuN and GDF10 in the spinal dorsal horn. The scale bar=160 μm.

4 神經病理性疼痛大鼠術側脊髓中GDF10蛋白的表達

行為學分析結果顯示在術后10 d縮爪閾值降低最為顯著，以及免疫熒光顯示GDF10在脊髓背角中的表達在術后10 d顯著下降，由此我們重點觀察了術后10 d組大鼠與正常對照組、假手術組大鼠術側脊髓中GDF10的表達。Western blot結果顯示手術組大鼠GDF10的表達較其余2組明顯降低,統計分析提示該差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The expression of GDF10 in the rat dorsal horn of each group. Mean±SD. n= 5. *P<0.05 vs normal group; #P<0.05 vs sham group.

討 論

神經病理性疼痛是一種難治性的疼痛狀態，主要見于中樞神經系統損傷(脊髓損傷)和外周神經損傷(坐骨神經壓迫和糖尿病性神經病理性疼痛等)。然而患者在體研究神經病理性疼痛的相關機制很困難，因而建立合適的動物模型對揭示神經病理性疼痛的發生機制具有重要意義。目前常用結扎L5脊神經的方法來建立神經病理性疼痛模型，此模型的優點在于L5脊神經主要包含感覺纖維而運動纖維較少，因此結扎以后不會對大鼠運動功能產生影響，因而排除了運動功能損傷帶來的疼痛行為學測試的誤差；其次，此模型神經損傷穩定，疼痛重復性好，脊神經損傷導致的脊髓變化固定在同一節段，具有較好的實驗重復性，大鼠不會發生自噬現象，并且此模型更有利于研究脊髓中星形膠質細胞和小膠質細胞變化的相關機制。所以在本研究中，我們采用了結扎大鼠左側L5脊神經制備神經病理性疼痛模型。

有研究發現神經病理性疼痛后大鼠可表現出后肢稍外翻，足趾間距變窄，行走時發生抬腿動作的機械性疼痛反應及舔舐損傷側后足的自發性疼痛反應[5]。von Frey針刺痛覺測試套件是一種經典的用于檢測動物機械痛敏的行為學測試方法，對大鼠足底采取不同強度的刺激可以得到相對客觀的大鼠縮爪閾值，反映大鼠對機械刺激閾值的變化，因此在本實驗中對采用von Frey針刺痛覺測試套件檢測了大鼠左后爪足底對機械刺激的縮爪閾值，我們發現脊神經結扎組大鼠縮爪閾值從術后1 d開始下降，到10 d閾值下降最明顯，至21 d維持閾值低水平狀態，通過統計學比較發現自術后3 d起與正常對照組相比，各時點差異顯著。該結果提示該神經病理性疼痛模型中，大鼠后爪足底疼痛敏感隨術后時間的延長而增加，兩者具有時間-效應關系。

不同的BMP家族成員對神經病理性疼痛的發生過程具有不同作用，如脊髓內注射BMP2可以誘發神經炎癥并使大鼠產生痛覺過敏[7]，而脊髓內轉染BMP7可以促進大鼠坐骨神經損傷后的功能恢復，卻未對疼痛過敏的發生產生作用[8]。我們通過免疫熒光檢測發現GDF10主要表達于正常大鼠脊髓背角內；在結扎大鼠左側L5脊神經后，用免疫熒光及Western blot檢測發現GDF10的表達在術后10 d時降低最明顯，其表達降低的改變與術后大鼠縮爪閾值的變化一致。GDF10的這一性質對我們研究TGF-β超家族在神經病理性疼痛發生過程中發揮作用的機制研究具有提示意義。由于脊髓背角與神經病理性疼痛發生具有重要關系，上述結果提示GDF10與神經病理性疼痛的發生密切相關，可能參與了神經病理性疼痛的調控。

星形膠質細胞和小膠質細胞是神經病理性疼痛發生時脊髓內2種主要的神經炎性細胞[9]。研究發現在脊神經結扎致神經病理性疼痛模型中，小膠質細胞主要在疼痛早期活化，而星形膠質細胞主要在晚期活化，這提示了小膠質細胞主要參與了神經病理性疼痛的發生，而星形膠質細胞主要參與了疼痛的維持[10]。在神經損傷后，脊髓背角神經元的NMDA受體活化，使神經元表達并分泌某些分子如CXCL13等，作用于星形膠質細胞和小膠質細胞，使其活化并分泌炎性因子，促進了中樞敏化作用，從而導致了疼痛的發生[11]。由此可見神經元與膠質細胞的相互作用在神經病理性疼痛的發生中發揮了重要作用。我們在本實驗中通過免疫熒光雙標觀察到GDF10與NeuN特異性共表達于脊髓背角神經元胞漿內，說明GDF10是主要由背角神經元分泌；當神經病理性疼痛發生時，背角神經元內GDF10的表達減少。據此我們推測GDF10參與了神經病理性疼痛模型中神經元與膠質細胞的相互作用，可抑制神經病理性疼痛模型中膠質細胞發生炎性反應。但GDF10參與2種細胞相互作用的分子機制，以及調控GDF10的表達是否能對神經病理性疼痛產生相應的保護作用尚需進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Expression of GDF10 in spinal cord in a rat model of neuropathic pain

JIANG Long, LI Sen, WANG Li, HONG You-jian, LIU Yuan, WU Ya-min, HUANG Xian-kai

(DepartmentofTraumaticSurgery,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China.E-mail:hxkai123@sina.com)

AIM: To observe the expression change of growth and differentiation factor 10 (GDF10) in the spinal cord of the rats with neuropathic pain. METHODS: Male SD rats (n=60) were used. The neuropathic pain was induced by ligation of left L5 spinal nerves of the animals. The paw withdrawal threshold was detected 1 d before surgery, and 0 d, 1 d, 3 d, 10 d and 21 d after surgery. The changes of GDF10 in the dorsal horn of L5 spinal cord were detected by immunofluorescence staining and Western blot. RESULTS: The paw withdrawal threshold of the rats with spinal nerve ligation was decreased from 1 d after surgery until 3 d with obvious difference compared with the na?ve rats (P<0.05), continuously decreased until 10 d, and then stabilized at 21 d. The GDF10 was located in the cytoplasm of the neurons in the dorsal horn of L5 spinal cord detected by immunofluorescence staining. The expression of GDF10 in L5 dorsal horn detected by immunofluorescence staining was reduced after surgery, significantly decreased from 10 d (P<0.05) until more than 21 d after surgery in spinal nerve ligation group compared with na?ve group. GDF10 in L5 spinal cord detected at 10 d after surgery by Western blot was significantly down-regulated in spinal nerve ligation group compared with na?ve group (P<0.05). CONCLUSION: Spinal nerve ligation induces the decrease in GDF10 expression in spinal dorsal horn. The down-regulation of GDF10 may contribute to the regulation of hyperpathia caused by mechanical stimulation after the injury of spinal nerve.

Neuropathic pain; Spinal dorsal horn; Growth and differentiation factor 10; Paw withdrawal threshold

1000- 4718(2017)03- 0444- 05

2016- 10- 27

2016- 12- 09

國家自然科學基金資助項目(No. 30772299)；軍隊特需藥品保密專項(No. 2009ZXJ09014-0096)

△通訊作者 Tel: 023-68757430； E-mail： hxkai123@sina.com

R363； R745.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.010