羥基紅花黃素A對腦缺血再灌注后缺血半暗帶自噬活性的調節作用*

龔 哲， 張曉旎， 李紅紅， 黎祥噴， 彭 英， 潘經銳

(中山大學孫逸仙紀念醫院神經科，廣東 廣州 510120)

羥基紅花黃素A對腦缺血再灌注后缺血半暗帶自噬活性的調節作用*

龔 哲， 張曉旎， 李紅紅， 黎祥噴， 彭 英， 潘經銳△

(中山大學孫逸仙紀念醫院神經科，廣東 廣州 510120)

目的： 探討腦缺血再灌注后羥基紅花黃素A(hydroxysafflor yellow A，HYSA)對缺血半暗帶自噬活性的調控機制。方法：構建雄性SD大鼠腦缺血90 min再灌注模型，分為假手術組、腦缺血再灌注(cerebral ischmia/reperfusion，I/R)組、I/R+HSYA組和假手術+HSYA組，分別在再灌注后6 h、1 d、3 d和7 d對大鼠進行改良神經功能缺損評分(modified neurological severity score，mNSS)，同時檢測缺血半暗帶的自噬活性、凋亡及干擾素β(IFN-β)表達。結果：與假手術組比較，I/R組缺血半暗帶在6 h～7 d內可見LC3-Ⅱ蛋白表達增高及SQSTM1/P62蛋白降解，提示自噬激活；與I/R組比較，I/R+HSYA組的自噬活性在1 d和3 d時明顯升高(P<0.05)，7 d時則明顯降低(P<0.05)。同時，I/R組的IFN-β表達較假手術組在6 h時升高(P<0.05)，1 d和3 d時降低(P<0.05)，7 d時恢復正常；而I/R+HSYA組的IFN-β表達在1 d和3 d時明顯高于假手術組和I/R組(P<0.05)，并且3 d時的細胞凋亡少于I/R組，mNSS評分自4 d起明顯低于I/R組(P<0.05)。結論：HSYA可動態調節缺血半暗帶的自噬活性和IFN-β表達，從而改善腦缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注損傷； 羥基紅花黃素A； 自噬； 干擾素β。

腦卒中已經成為目前世界上最主要的致殘和致死原因[1-2]，其中缺血性腦卒中約占87%[1]。對于急性腦梗死，發病4.5 h內的靜脈溶栓[3]和6 h內的機械取栓術[4]是臨床上唯一證實有效的治療方法，然而都會導致腦缺血再灌注(ischmia/reperfusion，I/R)損傷[5]。羥基紅花黃素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)是從傳統中藥紅花中提取的一種活性單體，近來被發現可有效改善腦缺血再灌注損傷[6-7]，但機制尚未完全闡明。自噬是病理情況下細胞自我保護的一個重要途徑，有文獻報道HSYA可激活腦缺血再灌注后72 h的腦組織自噬活性[8]。然而，自噬也是一把“雙刃劍”，腦缺血不同時期的自噬對神經細胞的轉歸有截然不同的作用[9]。因此，本研究旨在闡明HSYA對腦缺血再灌注后缺血腦組織自噬活性的調控作用，以闡明HSYA的神經保護機制。

材 料 和 方 法

1 動物和分組

取健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠88只，SPF級，體重280～320 g(由中山大學實驗動物中心提供，動物合格證為No. 44002100004928)。動物隨機分成4組(每組22只)：假手術組(sham組)、腦缺血/再灌注組(I/R組)、I/R+HSYA組以及sham+HSYA組。觀察時點為再灌注后6 h、1 d、3 d、7 d和14 d。

2 主要試劑

羥基紅花黃素A由山西華輝凱德制藥有限公司提供；LC3A/B單克隆Ⅰ抗、SQSTM1/P62單克隆I抗及β-actin單克隆Ⅰ抗購自Cell Signaling Technology；TRIzol和PrimeScript RT Reagent Kit購自TaKaRa；All-in-One qPCR Mix Kit購自GeneCopoeia；qPCR引物購自Thermo。

3 主要方法

3.1 大鼠腦缺血再灌注模型的建立及給藥方案 參照Longa的線栓法稍加改良[10]，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，術中從右側頸外動脈插入栓線(購自北京西濃科技有限公司)18～20 mm、經頸內動脈至大腦中動脈起始部，構建右側大腦中動脈閉塞模型，腦缺血90 min時拔出栓線實現再灌注。假手術組不插入栓線，其余步驟同上。大鼠清醒后出現左上肢癱瘓、轉圈、追尾征等，取腦后未見肉眼出血為成功模型。假手術組無上述表現。

HSYA用前以無菌生理鹽水稀釋至3 g/L。對于藥物治療組，HSYA以6 mg/kg的劑量在大鼠腦缺血再灌注30 min時通過腹腔注射給藥1次，此后每日重復給藥1次至觀察時點當天，給藥時間為1～7 d。對于sham組和I/R組則以等量無菌生理鹽水代替HSYA。

3.2 神經功能評分 以改良大鼠神經功能缺損評分(modified neurological severity score，mNSS)對大鼠腦缺血再灌注損傷的程度進行量化評分。mNSS評分從術后24 h開始，以避免麻醉對評分的影響。對所有大鼠每日評分1次，前7 d均在給藥前30 min完成，撤藥后、術后第14天重復評分1次。每組10只大鼠。mNSS評分包括運動試驗、感覺試驗、反射試驗等，正常為0分，最嚴重為18分[11]。評分由不參與實驗分組的第三方實驗人員進行。

3.3 TUNEL染色檢測半暗帶區的細胞凋亡 再灌注3 d時，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，心臟灌注后迅速斷頭、取腦，以4%多聚甲醛固定腦組織，然后脫水、石蠟包埋和切片。按照DeadEndTMColorimetric TUNEL System (Promega)的說明書對腦切片進行TUNEL染色。最后在光學顯微鏡(OLYMPUS)下對切片的半暗帶區域進行觀察、拍照。

3.4 缺血半暗帶組織分離方法 在各個觀察時點當天，以頸椎脫臼法處死大鼠，迅速取腦，從額極向枕極方向將前、后各3 mm厚度的腦組織冠狀切除，留下中間部分；以雙側大腦半球之間的中縫線作為參考，在缺血半球側沿中縫線旁開2 mm處作一平行、垂直切口，再在中縫線旁“2點鐘”方向再作一平行切口，所分離出的皮層組織主要為 “缺血半暗帶”所在區域[12](圖1)，-80 ℃保存。將分離到的組織的一半用于自噬活性檢測，其余一半用于炎癥因子表達檢測。

Figure 1.Isolation of ischemic penumbra in the rat brain.

3.5 Western blot檢測自噬活性 以Western blot法檢測缺血半暗帶組織的自噬指標LC3-Ⅱ和SQSTM1/P62的蛋白水平，內參照為β-actin。方法簡述如下：將RIPA蛋白提取液(RIPA∶PMSF=100∶1)對皮層組織進行總蛋白提取，BCA法測蛋白濃度。以12% SDS-PAGE分離蛋白，再以濕法轉膜將蛋白轉至PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉后，分別以抗LC3A/B抗體(1∶1 000)、抗SQSTM1/P62抗體(1∶1 000)和抗β-actin抗體(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜；TBST沖洗3次，Ⅱ抗室溫孵育1 h；TBST沖洗3次，以ECL化學發光法顯影。以Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics)軟件對Western blot結果進行灰度分析。

3.6 透射電鏡檢測缺血半暗帶的自噬相關超微結構 再灌注6 h時，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，心臟灌注后迅速斷頭、取腦，按上法分離缺血半暗帶組織，以2.5%戊二醛、4 ℃條件下固定過夜，然后送中山大學北校區電鏡中心行電鏡標本處理和透射電鏡(Tecnai G2Spirit TWIN, FEI)檢測。對于自噬體和自噬溶酶體的判斷標準參考相關指南[13]：自噬體為雙層膜結構(至少可見部分雙膜結構)，內含結構完整的細胞器；自噬溶酶體為單膜結構，內含不同消化階段的細胞器或胞質成分。

3.7 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測炎癥因子的mRNA表達 按TRIzol操作說明書提取缺血半暗帶區組織的總RNA并鑒定，再以PrimeScript RT Reagent Kit將RNA逆轉錄成cDNA。最后以All-in-One qPCR Mix Kit在羅氏熒光定量PCR儀(LightCycler 480Ⅱ, Roche)上對cDNA進行qPCR檢測炎癥因子的mRNA表達。IFN-β的上游引物序列為5’-TGCCCTCTCCATCGACTACA-3’，下游引物序列為5’-GCTGAGGTTGAGCCTTCCAT-3’；IL-1β的上游引物序列為5’-TGTGCAAGTGTCTGAAGCAG-3’,下游引物序列為5’-AGTCAAGGGCTTGGAAGCAA-3’；β-actin的上游引物序列為5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，下游引物序列為5’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’。

4 統計學處理

以SPSS 19.0對結果進行統計分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示。以Student’st檢驗對I/R和I/R+HSYA組的mNSS評分進行分析，以雙因素方差分析(two-way ANOVA)法對4組的灰度分析和qPCR結果進行比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HSYA改善大鼠腦缺血再灌注后的神經功能缺損

觀察時點內，sham組和sham+HSYA組大鼠均未見明顯神經功能缺損。I/R組大鼠再灌注24 h的mNSS評分為6.45±1.18，隨后逐日緩慢下降，至14 d時為3.50±0.60；而I/R+HSYA組大鼠再灌注24 h的mNSS評分為7.45±1.02，與I/R組比較差異無統計學顯著性；但從4 d起，I/R+HSYA組的mNSS評分明顯低于I/R組，至14 d時下降為1.20±0.33，與I/R組比較差異仍有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The changes of the modified neurological severity score (mNSS) in the rats with different treatments. Hydroxy-safflor yellow A (HSYA) was intraperitoneally injected at a dose of 6 mg/kg per day for the first 7 d. mNSS was performed once a day on the first 7 conse-cutive days and repeated on the 14th day, started 24 h after surgery. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs I/R.

2 HSYA抑制缺血半暗帶內的細胞凋亡

再灌注后第3天，sham組和sham+HSYA組的半暗帶區的細胞形態正常，未見細胞凋亡；而I/R組可見細胞體積縮小以及大量TUNEL陽性細胞散在分布，提示凋亡形成；I/R+HSYA組的細胞形態基本正常，可見少量TUNEL陽性細胞，提示凋亡過程被抑制，見圖3。

Figure 3.Apoptotic cells were stained by TUNEL on day 3. Brown staining indicated TUNEL-positive cells, while blue staining indicated nuclei.

3 HSYA動態調節缺血半暗帶組織的自噬活性

從6 h～7 d時段里，I/R組缺血半暗帶組織的LC3-Ⅱ蛋白表達均明顯高于sham組，同時伴隨SQSTM1/P62蛋白水平明顯低于sham組(P<0.05)，提示自噬激活(圖4)。透射電鏡結果也顯示，6 h時I/R組缺血半暗帶區的胞漿內可見自噬體和自噬溶酶體均增多，證實自噬被激活(圖5)。

I/R+HSYA組6 h時，可見LC3-Ⅱ蛋白表達較假手術組升高，但未見SQSTM1/P62蛋白降解；透射電鏡也顯示該時點半暗帶區的胞漿內可見少量自噬體形成，但未見自噬溶酶體(圖5)，提示自噬被激活后又中斷。而在1 d和3 d時，I/R+HSYA組的LC3-Ⅱ蛋白表達均明顯高于sham組，同時SQSTM1/P62蛋白水平降低甚至低于I/R組(P<0.05)，提示自噬激活并且激活強度高于I/R組。在7 d時，I/R+HSYA組可見LC3-Ⅱ蛋白水平低于I/R組，同時SQSTM1/P62蛋白水平高于I/R組，提示自噬活性受到抑制(圖4)。

HSYA組在6 h時可見LC3-Ⅱ蛋白表達升高，但未見SQSTM1/P62蛋白降解，提示自噬過程中斷；而在7 d時可見SQSTM1/P62蛋白降解，但無LC-Ⅱ蛋白表達升高，提示僅溶酶體降解過程被激活。

Figure 4.The dynamic changes of autophagic activation in the ischemic penumbras of the rats determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs I/R.

4 HSYA動態調節缺血半暗帶內炎癥因子的表達

I/R組缺血半暗帶內的IL-1β表達在6 h～3 d時段內逐漸下降，但均明顯高于sham組(P<0.05)，至7 d時恢復正常水平；而IFN-β在6 h時表達明顯升高，隨后在1 d和3 d時表達受抑制(P<0.05)，至7 d時恢復正常水平。

而I/R+HSYA組的IL-1β在6 h時表達高于sham組，但低于I/R組，而在1 d和3 d時IL-1β表達均明顯低于I/R組(P<0.05)，7 d時恢復正常水平。IFN-β在1 d和3 d時表達明顯升高，高于sham和I/R組(P<0.01)，其余時點與sham組比較無明顯變化，見圖6。

Figure 5.Autophagy detected by electron microscope in the penumbras of 4 groups at 6 h after reperfusion. Black arrows denote the representative presumed autophagosomes and autolysosomes. The scale bar=0.5 μm.

Figure 6.The mRNA expression of IL-1β and IFN-β in the penumbras of the rats detected by qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs I/R.

討 論

HSYA是從傳統中藥紅花中提純得到的一個活性單體，既往的臨床試驗[14]和動物實驗[6-7]均已證實HSYA可有效減輕腦缺血再灌注損傷，但其神經保護機制目前尚未完全闡明。

自噬在缺血性腦卒中病程中起“雙刃劍”作用，既可保護神經細胞免于缺血損傷，也可導致細胞出現“自噬性死亡”[15]。如有學者報道自噬在腦缺血早期的激活起神經保護作用，而在后期的激活則起破壞作用[9]。這與我們的結果相符。我們的實驗顯示，HSYA在腦缺血再灌注后1 d和3 d時可明顯增強I/R誘導的自噬活性，同時我們觀察到3 d時I/R+HSYA組缺血半暗帶區的細胞凋亡被明顯抑制，隨后自4 d起該組大鼠的神經功能缺損明顯改善，這說明HSYA在前3 d所誘導的自噬是神經保護性的；由于腦缺血再灌注損傷后神經網絡的重建需要一段時間，這可能是大鼠mNSS評分改善延遲出現的原因之一。而7 d時I/R+HSYA組的自噬活性被抑制，但伴隨著神經功能的持續改善，這提示7 d時I/R誘導的自噬可能是破壞性的，而HSYA通過抑制該過程而持續發揮神經保護作用，因此在HSYA撤藥后的14 d，I/R+ HSYA組的神經功能恢復程度仍然明顯優于I/R組。當然，這需要將來進一步的實驗證實。

腦缺血再灌注損傷的本質是炎癥反應[16]。近年來的研究發現，病理情況下自噬和炎癥信號途徑的激活是互為因果的，如抗炎因子Ⅰ型干擾素(包括IFN-α、IFN-β和IFN-ω)已被證實在炎癥發生時可通過激活自噬而保護宿主細胞[17]；另一方面，自噬可通過降解IL-1β前體、抑制IL-1β生成從而發揮抗炎作用[18]。我們的結果和這些發現也是相符的。我們發現，I/R組在6 h時即出現IFN-β表達升高，同時出現自噬的激活，而I/R+HSYA組則未見上述表現；隨后在1 d和3 d時，I/R+HSYA組的IFN-β表達明顯升高，同時伴隨著自噬活性的強化和IL-1β表達的下降；至7 d時，I/R+HSYA組的IFN-β表達恢復基礎水平，而自噬活性也被同時抑制。因此，HSYA可能是通過調節IFN-β的表達從而實現對自噬活性的調控，但這需要進一步的實驗來證實。然而，IFN-β并非腦缺血再灌注損傷過程中自噬激活的唯一誘導因素，因為I/R組的IFN-β表達在1 d～7 d時段里是被抑制的，但仍可見明顯的自噬激活。因為自噬是細胞內能量耗竭時、促使能量再生的一個重要旁路[13]，因此缺血本身即可誘導神經細胞發生自噬。

此外，HSYA組也可見輕微的自噬標記物表達改變，如6 h時僅LC3-Ⅱ蛋白表達升高，而7 d時僅SQSTM1/P62蛋白降解，這說明HSYA本身并不改變正常神經細胞的自噬活性，也間接提示HSYA不影響正常細胞的代謝功能。

綜上所述，HSYA可通過動態調控腦缺血半暗帶內的自噬活性和IFN-β表達從而誘導神經保護作用、減輕腦缺血再灌注損傷。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Modulation of autophagy in ischemic penumbra by hydroxysafflor yellow A after cerebral ischemia/reperfusion injury

GONG Zhe, ZHANG Xiao-ni, LI Hong-hong, LI Xiang-pen, PENG Ying, PAN Jing-rui

(DepartmentofNeurology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:panjingrui06@163.com)

AIM: To clarify the modulation of autophagy in ischemic penumbra by hydroxysafflor yellow A (HSYA) after cerebral ischemia/reperfusion (I/R) injury. METHODS: Male SD rats subjected to transient middle cerebral artery occlusion for 90 min were randomly divided into 4 groups: sham-operation (sham) group, cerebral I/R (I/R) group, I/R+HSYA group and sham+HSYA group. Modified neurological severity score (mNSS) was used to evaluate the neurological deficits of the rats at 6 h, 1 d, 3 d and 7 d after reperfusion, accompanied by the detection of autophagy, apoptosis and mRNA expression of IFN-β in ischemic penumbra. RESULTS: Compared with sham group, upregulation of LC3-Ⅱand degradation of SQSTM1/P62 were observed in I/R group, indicating the activation of autophagy after I/R. The activation of autophagy in I/R+HSYA group was significantly enhanced by HSYA on day 1 and day 3, and inhibited on day 7, as compared with I/R group (P<0.05). Besides, the mRNA expression of IFN-β in I/R group was significantly upregulated at 6 h, then downregulated on day 1 and day 3, and returned to basal level on day 7, as compared with sham group (P<0.05). In I/R+HSYA group, the mRNA expression of IFN-β was significantly upregulated on day 1 and day 3, accompanied by the inhibition of apoptosis on day 3 and the significantly decreased mNSS from day 4, as compared with I/R group (P<0.05). CONCLUSION: HSYA alleviates cerebral I/R injury by dynamically modulating the activation of autophagy and the expression of IFN-β in ischemic penumbra.

Cerebral ischemia/reperufuion injury; Hydroxysafflor yellow A; Autophagy; Interferon β

1000- 4718(2017)03- 0449- 06

2016- 09- 19

2016- 11- 26

廣東省醫學科研基金項目(No. A2016121)；民生科技研究項目2015(No. 201508020058)

△通訊作者 Tel: 020-34070569； E-mail: panjingrui06@163.com

R363.2; R743.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.011