曲尼司特對兔增生性瘢痕組織的抑制作用及其機制研究

李宗枝，閆豐華，張永臻（1.日照市皮膚病防治所醫學美容科，山東日照 76800；.日照市中醫醫院眼科，山東日照 76800；.日照市人民醫院心血管外科，山東日照 76800）

曲尼司特對兔增生性瘢痕組織的抑制作用及其機制研究

李宗枝1＊，閆豐華2，張永臻3（1.日照市皮膚病防治所醫學美容科，山東日照 276800；2.日照市中醫醫院眼科，山東日照 276800；3.日照市人民醫院心血管外科，山東日照 276800）

目的：研究曲尼司特對兔增生性瘢痕組織的抑制作用及其機制。方法：取兔建立增生性瘢痕模型，將建模成功的兔隨機分為模型對照組（生理鹽水）和曲尼司特低、中、高劑量組（0.3、0.5、0.7 mg/kg），每組6只，局部sc相應藥物。各組兔分別于注射前1 h和注射后第1、3、5周測量瘢痕厚度，觀察注射后第5周瘢痕病理學變化，并檢測瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表達。結果：與注射前1 h比較，除模型對照組外，其余各組兔注射后各時間點瘢痕厚度均減小（P＜0.05）。注射后第5周，與模型對照組比較，其余各組兔注射后第5周的瘢痕厚度均減小，病理學變化均好轉，瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表達均降低（P＜0.05），且與曲尼司特劑量呈正相關。結論：曲尼司特能夠抑制增生性瘢痕的形成，其作用機制可能與抑制瘢痕組織中TGF-β1、α-SMAmRNA和蛋白的表達有關。

曲尼司特；增生性瘢痕；轉化生長因子β1；α-平滑肌肌動蛋白；兔

增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）是成纖維細胞產生的膠原蛋白等在組織中沉積后，難以被吸收或重塑而表現出的一種病理狀態[1]。張羽飛等[2]研究發現，HS表現出持續性炎性反應和纖維異常增生，從而影響患者的形象和健康，并加重患者心理負擔。曲尼司特屬于新型糖皮質激素，對纖維化和瘙癢具有明顯的抑制作用。本文研究了曲尼司特對兔瘢痕組織中轉化生長因子β1（TGF-β1）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達的影響，探討曲尼司特對增生性瘢痕的抑制作用及其可能的作用機制，旨在為其臨床治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

YS100普通光學顯微鏡（日本尼康公司）；RT-6000全自動酶標儀（雷杜生命科學股份有限公司）；凝膠成像系統及圖像分析軟件（美國Bio-Rad公司）；9700聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI公司）。

1.2 藥品與試劑

曲尼司特膠囊（中國藥科大學制藥有限公司，批號：150716，規格：0.1 g/粒）；速眠新Ⅱ注射液（靜松靈、氟哌啶醇、雙氫埃托啡復合制劑，山東省農科院畜牧獸醫研究所，批號：150401，規格：1.5 mL/支）；免疫組化試劑盒（上海拜力生物科技有限公司）；兔源TGF-β1、α-SMA單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）；Trizol試劑盒、反轉錄試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司）。

1.3 動物

35只日本大耳白兔，♂，體質量為2.1～2.6 kg，購自山東省日照市人民醫院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（魯）2016-005。所有兔均混合分籠人工飼養，環境溫度為20～22℃、相對濕度為50%，飼養1周后進行實驗。本實驗按動物實驗倫理學要求操作。

2 方法

2.1 造模

將兔固定于手術臺上，臀部im速眠新Ⅱ注射液0.2 mL/kg，待麻醉顯效后，將雙側兔耳腹側毛發修剪，分別于雙耳尖端2、5、7、10 cm處打4個直徑約1 cm的圓孔（打孔時注意用力適度，如有軟骨，則將軟骨切開）。打孔完畢后將兔放置籠中喂養，自由進食、飲水。造模1周內觀察兔雙耳，待創面結痂后，乙醇消毒后將痂皮揭除，再用手術刀將表皮及過度生長的肉芽刮去，再待創面自然愈合。若術后發現創面感染，局部給予碘伏消毒。

2.2 分組與給藥

所有兔創面于2～3周內完全上皮化，對兔雙耳進行檢查，剔除4只創面增生不均勻的兔，從剩余31只兔中選擇24只，隨機分為模型對照組（生理鹽水）和曲尼司特低、中、高劑量組（0.3、0.5、0.7 mg/kg），每組6只兔、12只耳朵、48個創面。根據預實驗結果確定給藥劑量，以生理鹽水制備質量濃度為1 mg/mL的相應藥液，各組兔sc相應藥物。

2.3 瘢痕厚度測量

分別于注射前1 h和注射后第1、3、5周采用游標卡尺對兔耳瘢痕厚度進行測量。于注射后第5周切除瘢痕全層及軟骨，均勻分成兩部分，一部分液氮冷凍保存，制成冰凍切片；另外一部分用10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋。

2.4 瘢痕組織病理學檢查

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法檢測兔耳部瘢痕病理學變化。取注射后第5周的兔耳瘢痕組織的石蠟切片，脫蠟至水，二甲苯、乙醇梯度洗脫，蒸餾水沖洗，HE染色，自來水沖洗，甩干后透明、封固，顯微鏡下觀察病理學變化。

2.5 瘢痕組織中TGF-β1、α-SMAmRNA檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測瘢痕組織中TGF-β1、α-SMAmRNA表達。采用Trizol試劑盒按說明書操作提取瘢痕組織總RNA，將總RNA反轉錄成cDNA，再將cDNA進行實時熒光定量PCR檢測。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司設計合成，TGF-β1上游引物為5′-TTGACCGGTAAATGTCAACGTAAT-3′，下游引物為5′-TGAGACTGGCACTGAGAGTGGTTG-3′，擴增長度為226 bp；α-SMA上游引物為5′-GGGTCAAAGATCACGTGCACAG-3′，下 游 引 物 為 5′-TTGTCAAAGCAGACGGAGGTC-3′，擴增長度為304 bp；GAPDH上游引物為 5′-GGTGAACGTGCGTCTCAAGC-3′，下游引物為5′-GTCGGTGGTGGAAGATCGTC-3′，擴增長度為117 bp。PCR反應體系：ddH2O 13 μL，緩沖液2.5 μL，dNTP 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 3 μL、Taq酶0.5 μL，總反應體系21 μL；反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min，40個循環后72℃延伸5 min。以GAPDH為內參，采用2－ΔΔct法分析目的基因的相對表達量，Δct＝ ct目的基因－ct內參。

2.6 瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA蛋白檢測

采用Western blot法檢測瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達。將瘢痕組織剪碎后充分研磨，加入RIPA裂解液，冰水浴上靜置30 min，充分裂解后于4℃下12 000 r/min（離心半徑：8 cm）離心10 min，提取總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度。取50 μg總蛋白，100℃水浴下變性5 min，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白，轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，37℃下加入5%脫脂奶粉封閉1.5～2 h，再分別加入1∶1 000稀釋的兔源TGF-β1單克隆抗體、1∶500稀釋的兔源α-SMA單克隆抗體、1∶5 000稀釋的鼠源GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，待洗膜后再加入1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG二抗，37℃振搖孵育1 h，PBS沖洗3次。采用增強化學發光（ECL）試劑顯影、曝光，凝膠成像系統對條帶進行分析，半定量分析灰度條帶，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值之比作為目的蛋白的相對表對量。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 各組兔不同時段瘢痕厚度比較

與注射前1 h比較，除模型對照組外，其余各組兔注射后各時間點瘢痕厚度均減小（P＜0.05）。與注射后第1周比較，除模型對照組外，其余各組兔注射后第3、4周瘢痕厚度均減小（P＜0.05）。注射后第5周，與模型對照組比較，其余各組兔耳瘢痕厚度均明顯減小（P＜0.05）。這表明曲尼司特能夠減小瘢痕的厚度，且呈劑量依賴性。各組兔不同時段瘢痕厚度測定結果見表1。

表1 各組兔不同時段瘢痕厚度測定結果（±s，n＝48，mm）Tab 1 Determination results of scar thickness of rabbits in each group in different periods（±s，n＝48，mm）

表1 各組兔不同時段瘢痕厚度測定結果（±s，n＝48，mm）Tab 1 Determination results of scar thickness of rabbits in each group in different periods（±s，n＝48，mm）

注：與注射前1 h比較，＊P＜0.05；與注射后第1周比較，#P＜0.05；與模型對照組比較，▲P＜0.05Note：vs.1 h befor injection，＊P＜0.05；vs.1 week after injection，#P＜0.05；vs.model control group，▲P＜0.05

注射后第5周2.097±0.1141.881±0.091＊#▲1.672±0.089＊#▲1.583±0.071＊#▲組別模型對照組曲尼司特低劑量組曲尼司特中劑量組曲尼司特高劑量組注射前1 h 2.268±0.109 2.275±0.106 2.271±0.096 2.274±0.104注射后第1周2.209±0.447 2.169±0.453＊2.043±0.331＊▲2.098±0.371＊▲注射后第3周2.281±0.381 2.100±0.381＊#1.921±0.259＊#▲1.847±0.237＊#▲

3.2 各組兔耳瘢痕組織病理學變化

注射后第5周，模型對照組兔耳瘢痕組織較厚，膠原纖維無序；曲尼司特低劑量組兔耳瘢痕組織膠原纖維略有序，表皮層變薄，真皮結構仍紊亂無序；曲尼司特中劑量組兔耳瘢痕組織較薄，且真皮結構較為整齊；曲尼司特高劑量組兔耳瘢痕組織表皮厚度較曲尼司特中劑量組更薄，且真皮結構排列更為整齊。各組兔注射后第5周的瘢痕組織病理學變化見圖1。

圖1 各組兔注射后第5周的瘢痕組織病理學變化（HE，×100）Fig 1 Pathological changes of scar tissue of rabbits in each group in the fifth week after injection（HE，×100）

3.3 各組兔耳瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA mRNA表達

注射后第5周，與模型對照組比較，其余各組兔耳瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA mRNA表達均明顯降低（P＜0.05）；與曲尼司特低劑量組比較，曲尼司特中、高劑量組兔耳瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA mRNA表達明顯降低（P＜0.05）。這表明曲尼司特能夠抑制瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA mRNA表達，且呈劑量依賴性。各組兔注射后第5周瘢痕組織中TGF-β1、α-SMAmRNA表達的測定結果見圖2。

圖2 各組兔注射后第5周瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA mRNA表達的測定結果Fig 2 Determination results of TGF-β1，α-SMA mRNA expression in scar tissue of rabbits in each group in the fifth week after injection

3.4 各組兔耳瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達

注射后第5周，與模型對照組比較，其余各組兔耳瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）；與曲尼司特低劑量組比較，曲尼司特中、高劑量組兔耳瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。這表明曲尼司特能夠抑制瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA蛋白的表達，且呈劑量依賴性。各組兔注射后第5周瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達的測定結果圖3。

圖3 各組兔注射后第5周瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA蛋白表達的測定結果Fig 3 Determination results of TGF-β1，α-SMA protein expression in scar tissue of rabbits in each group in the fifth week after injection

4 討論

在創面的愈合過程中，局部炎癥反應會誘導間質細胞分化，促進成纖維細胞增殖[3-4]。成纖維細胞能夠分泌纖維連接蛋白和膠原蛋白，當肉芽組織成熟后，大量膠原蛋白沉積于細胞外基質，最終形成增生性瘢痕[5-6]。國外有研究顯示，曲尼司特能夠抑制單核細胞趨化因子、轉化生長因子等炎癥因子，達到延緩和抑制臟器纖維化的作用[7]。趙建華等[8]也研究證實，曲尼司特能夠抑制血管內皮細胞的活性，亦能降低動脈粥樣硬化發生的風險。在治療瘢痕方面，王建霞等[9]對肉芽腫大鼠持續局部給予曲尼司特，結果顯示曲尼司特高劑量組肉芽腫增生程度明顯減輕，且肉芽腫組織羥脯氨酸含量顯著降低，提示曲尼司特能夠通過抑制羥脯氨酸的表達從而改善肉芽腫的增生。本研究顯示，曲尼司特高、中、低劑量組兔耳瘢痕厚度明顯減小，說明曲尼司特能夠有效控制增生性瘢痕的過度生長。

TGF-β1是瘢痕形成的關鍵因子之一，當創傷開始愈合時，TGF-β1大量分泌，導致膠原蛋白在細胞外基質過度沉積，這亦是增生性瘢痕形成的病理基礎[10]。Honardoust D等[11]也研究證實，機體發生創傷時，創面TGF-β1/ Smad3信號通路被激活，TGF-β1分泌增加，導致Ⅰ型膠原合成增加，Ⅱ、Ⅲ型膠原合成降低，最終誘導瘢痕增生。α-SMA是細胞內收縮系統主要蛋白，通過帶動膠原纖維位置變化，導致瘢痕發生攣縮[12]。據劉華等[13]報道，在瘢痕生長后期，組織中α-SMA表達上調，且α-SMA表達水平與攣縮程度有關。本研究對各組兔瘢痕組織TGF-β1、α-SMA mRNA表達進行檢測，結果顯示高、中、低劑量曲尼司特組兔耳瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA mRNA表達顯著低于同時段模型對照組；Western blot法檢測顯示，TGF-β1、α-SMA蛋白表達也表現出相似的趨勢，提示曲尼司特可能是通過降低TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表達，達到抑制瘢痕增生的作用。

本研究的局限性：（1）由于兔的個體差異、瘢痕的位置、增生的時間點等因素存在差異，導致本研究中各組兔的生物學特性可能存在一定差異。（2）有報道稱曲尼司特依然存在導致肝功能異常、神經系統癥狀等不良發應等風險[14]。而在本研究中，僅單純觀察了曲尼司特的有效性，需要進一步觀察其急、慢性毒性。（3）在研究中發現，TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表達趨勢均表現出良好的一致性，兩種指標之間是否有相同的信號通路調節值得深入研究。

綜上所述，曲尼司特能夠抑制HS的形成，其作用機制可能與抑制瘢痕組織中TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表達有關。

[1] Soykan EA，Butzelaar L，de Kroon TL，et al.Minimal extracorporeal circulation（MECC）does not result in less hypertrophic scar formation as compared to conventional extracorporeal circulation（CECC）with dexamethasone [J].Perfusion，2014，29（3）：249-259.

[2] 張羽飛，李厚忠，王學勇，等.增生性瘢痕形態學觀察及血管內皮生長因子和轉化生長因子β激活性激酶1表達的檢測與意義[J].中國醫學科學院學報，2015，37（4）：446-450.

[3] Simon F，Bergeron D，Larochelle S，et al.Enhanced secretion of TIMP-1 by human hypertrophic scar keratinocytes could contribute to fibrosis[J].Burns，2012，38（3）：421-427.

[4] Varkey M，Ding J，Tredget EE.Differential collagen-glycosaminoglycan matrix remodeling by superficial and deep dermal fibroblasts：potential therapeutic targets for hypertrophic scar[J].Biomaterials，2011，32（30）：7581-7591.

[5] Abdou AG，Maraee AH，Saif HF.Immunohistochemical evaluation of cox-1 and cox-2 expression in keloid and hypertrophic scar[J].Am J Dermatopathol，2014，36（4）：311-317.

[6] 方芳，張虹，趙雁，等.光動力法聯合復方倍他米松注射在增生性瘢痕治療中的應用[J].中華整形外科雜志，2015，31（5）：343-346.

[7] E Y，Qipa Z，Hengshu Z.The expression of DNMT1 in pathologic scar fibroblasts and the effect of 5-aza-2-deoxycytidine on cytokines of pathologic scar fibroblasts[J]. Wounds，2014，26（5）：139-146.

[8] 趙建華，喬少華，耿文軍，等.左西替利嗪、曲尼司特聯合卡介苗素治療慢性蕁麻疹的臨床觀察[J].中國皮膚性病學雜志，2010，24（7）：683-684.

[9] 王建霞，符麗娟.曲尼司特對高糖培養心肌成纖維細胞增殖及表型轉化的影響[J].中國藥理學與毒理學雜志，2016，30（3）：203-208.

[10] 韓方璇，肖云彬，林慧，等.銀杏葉提取物對糖尿病模型大鼠腎臟ET-1、TGF-β1的影響[J].中國藥房，2008，19（27）：2101-2103.

[11] Honardoust D，Varkey M，Marcoux Y，et al.Reduced decorin，fibromodulin，and transforming growth factorβ3 in deep dermis leads to hypertrophic scarring[J].J Burn Care Res，2012，33（2）：218-227.

[12] Shi J，Wan Y，Shi S，et al.Expression，purification，and characterization of scar tissue neovasculature endothelial cell-targeted rhIL10 in escherichia coli[J].Appl Biochem Biotechnol，2015，175（1）：625-634.

[13] 劉華，楊華蓮，周淑芳，等.丹參酮ⅡA磺酸鈉對瘢痕成纖維細胞增殖及轉化生長因子β1和α平滑肌肌動蛋白mRNA及蛋白表達的影響[J].中華燒傷雜志，2013，29（3）：294-299.

[14] 張宏峰，武斌.曲尼司特治療燒傷患者增生性瘢痕40例臨床評價[J].中國藥業，2015，24（20）：60-61.

（編輯：鄒麗娟）

Inhibition Effects of Tranilast on Hypertrophic Scar Tissue of Rabbits and Its Mechanism Study

LI Zongzhi1，YAN Fenghua2，ZHANG Yongzhen3（1.Dept.of Medical Cosmetology，Rizhao Prevention&Cure Institute of Skin Disease，Shandong Rizhao 276800，China；2.Dept.of Ophthalmology，Rizhao Chinese Medicine Hospital，Shandong Rizhao 276800，China；3.Dept.of Cardiovascular Surgery，Rizhao People’sHospital，Shandong Rizhao 276800，China）

OBJECTIVE：To study the inhibition effects of tranilast on hypertrophic scar tissue of rabbits and its mechanism. METHODS：Rabbits were selected to induce hypertrophic scar（HS）model，the HS model rats were randomly divided into model control group（normal saline），tranilast low-dose，medium-dose，high-dose groups（0.3，0.5，0.7 mg/kg），6 rabbits in each group，local intradermaly injected corresponding drugs.Scar thickness 1 h before injection and the first，third，fifth week after injection in each group were measured，pathological changes of scar（fifth week after injection）were observed，transforming growth factor β1（TGF-β1），α-smooth muscle actin（α-SMA）mRNA and protein expression were detected.RESULTS：Compared with 1 h before injection，scar thickness of rabbits in other groups were decreased after injection except for model control group.In fifth week after injection，compared with model control group，scar thickness of rabbits in other groups were decreased，pathological changes were improved；TGF-β1，α-SMA mRNA and protein expression were decreased（P＜0.05），showing positive correlation with tranilast dose.CONCLUSIONS：Tranilast can inhibit the formation of hypertrophic scar，and the mechanism may be related to inhibiting the TGF-β1，α-SMA mRNA and protein expression.

Tranilast；Hypertrophic scar；Transforming growth factor-β1；α-smooth muscle actin；Rabbit

R965

A

1001-0408（2017）07-0919-04

2016-06-20

2016-08-29）

＊主治醫師，碩士。研究方向：整形美容外科。電話：0633-8266669。E-mail：13963330656@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.16