藏藥復方多血康膠囊對脂多糖誘導急性肺損傷小鼠的保護作用Δ

胡曉鑫，羅 強，杜蕾蕾，張 藝，降擁四郎（成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，成都 611137）

·民族醫(yī)藥·

藏藥復方多血康膠囊對脂多糖誘導急性肺損傷小鼠的保護作用Δ

胡曉鑫＊，羅 強，杜蕾蕾，張 藝，降擁四郎#（成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，成都 611137）

目的：考察藏藥復方多血康膠囊對脂多糖誘導急性肺損傷小鼠的保護作用。方法：將60只KM小鼠隨機分為空白組、模型組、地塞米松組（陽性對照，1 mg/kg）和復方多血康膠囊高、中、低劑量組（3.6、1.8、0.9 g/kg，以生藥計），每組10只。ig給藥，空白組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次。連續(xù)給藥7 d后，除空白組外，其余各組小鼠均ip脂多糖誘導急性肺損傷。造模6 h后，觀察小鼠肺組織病理改變，測量肺組織含水量，檢測肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）水平以及血清中白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。結果：與空白組比較，模型組小鼠肺組織發(fā)生充血水腫、炎癥細胞浸潤、肺泡間隔及肺泡壁明顯增寬等病理變化，肺組織含水量和肺組織中MDA水平以及血清中IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01），肺組織中SOD、GSH-Px水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織損傷程度均不同程度降低；除復方多血康膠囊低劑量組大鼠肺組織含水量、肺組織中MDA水平以及血清中TNF-α水平變化不明顯外，其余各給藥組小鼠上述指標均顯著改善（P＜0.05或P＜0.01）。結論：藏藥復方多血康膠囊可明顯減輕小鼠氧化應激和炎癥反應，對脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠有一定保護作用。

藏藥；復方多血康膠囊；急性肺損傷；炎癥；氧化應激；小鼠

藏藥復方多血康膠囊由紅景天、沙棘、余甘子、干姜4味藥材組成，為藏醫(yī)大師措如·才郎的臨床經(jīng)驗方，常用于治療紅細胞增多癥。方中紅景天養(yǎng)肺清熱[1]；沙棘除肺病，治培根病；余甘子治培根病、赤巴病、血病；干姜引肺膿、生胃火[2]。現(xiàn)代研究表明，紅景天對高原肺動脈高壓和大鼠急性肺損傷均有保護作用[3-4]。武冬梅等[5]研究發(fā)現(xiàn)，沙棘提取物異鼠李素對脂多糖（LPS）誘導小鼠肺損傷有明顯的抑制炎癥反應的作用。本課題組前期已對復方多血康膠囊治療紅細胞增多癥展開了相關藥效學及機制研究[6-7]，但關于其對急性肺損傷的藥理作用研究未見報道。本研究采用LPS復制小鼠急性肺損傷模型，探究復方多血康膠囊對急性肺損傷小鼠的保護作用，為后期治療肺部疾病的新藥開發(fā)提供藥效學基礎。

1 材料

1.1 儀器

550型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；UV-1800型紫外-可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；TDZ5-WS型離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；CT15RT型臺式高速冷凍離心機（上海天美生化儀器設備工程有限公司）；cx41型光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

復方多血康膠囊（成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院自制，批號：20160515，規(guī)格：每1 g膠囊內(nèi)容物相當于2.5 g原藥材）；醋酸地塞米松片（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：150527205，規(guī)格：0.75 mg/片）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒和白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（聯(lián)科生物技術有限公司，批號：6219116、220660242、228260425）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20160504、20160518、20160517）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級KM小鼠，60只，♂，6～8周齡，體質(zhì)量為（20±2）g，由成都達碩生物科技有限公司提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-24]。

2 方法

2.1 分組與造模

將60只小鼠適應性喂養(yǎng)7 d，然后隨機分為空白組、模型組、地塞米松組（陽性對照，1 mg/kg）[8]和復方多血康膠囊高、中、低劑量組（3.6、1.8、0.9 g/kg，以生藥計，根據(jù)成人臨床劑量的20、10、5倍劑量換算而得），每組10只。將復方多血康膠囊溶于生理鹽水中，制備成按生藥計質(zhì)量濃度分別為0.36、0.18、0.09 g/mL的藥液。各給藥組小鼠ig相應藥液（10 mL/kg），空白組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥1 h后，空白組小鼠ip等體積生理鹽水（10 mL/kg），其余各組小鼠均ip LPS（10 mg/kg）誘導急性肺損傷模型[9]，注射完后動物自由攝食及飲水。

2.2 取材與指標檢測

造模6 h后，各組小鼠摘眼球采血[10]，1 500×g離心10 min，取血清，置于－80℃超低溫冰箱中凍存，按照試劑盒說明書操作測定血清中TNF-α、IL-6水平。將小鼠處死后打開胸腔，暴露肺組織，以磷酸鹽緩沖液（PBS）灌注右心室直至流出液體清澈，分離小鼠完整肺組織。用預冷的PBS沖洗肺組織3次清除殘血，然后用濾紙吸干，再將肺組織分為左、右兩葉，肉眼觀察肺組織形態(tài)學變化。然后將左側(cè)肺組織放于扁形稱量瓶中稱濕質(zhì)量，測定肺組織含水量。右側(cè)肺組織上葉用10%中性甲醛固定，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察肺組織形態(tài)學變化；剩余右肺組織制作為10%肺組織勻漿，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）＝1∶9的比例將肺組織移至冰冷PBS中，剪碎，電動勻漿機勻漿，4℃下2 000×g離心10 min，取上清液，－80℃超低溫冰箱凍存，按照試劑盒說明書操作測定肺組織中SOD、MDA、GSH-Px水平。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 血清中IL-6、TNF-α水平及肺組織含水量測定結果

與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平明顯升高，肺組織含水量明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，除復方多血康膠囊低劑量組小鼠血清中TNF-α及肺組織含水量變化不明顯外，其余各給藥組小鼠上述指標水平均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平及肺組織含水量測定結果（±s，n＝10）Tab 1 Determination results of the levels of IL-6，TNF-α in serum and water content in lung tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表1 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平及肺組織含水量測定結果（±s，n＝10）Tab 1 Determination results of the levels of IL-6，TNF-α in serum and water content in lung tissue of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別IL-6，ng/mL TNF-α，pg/mL含水量，% 78.63±0.98 80.48±0.17＊＊78.66±1.14##79.24±1.23##79.55±0.66#79.75±1.50空白組模型組地塞米松組復方多血康膠囊高劑量組復方多血康膠囊中劑量組復方多血康膠囊低劑量組4.78±0.11 5.50±0.16＊＊5.17±0.31##5.21±0.17##5.27±0.21#5.24±0.24##279.48±105.90 489.71±118.99＊＊299.38±124.14##357.18±100.22##334.85±79.42##479.69±102.72

3.2 肺組織形態(tài)學觀察結果

3.2.1 肉眼觀察結果 空白組小鼠雙肺飽滿，呈粉紅色，表面光滑，未見淤血，肺切面未見溢出粉紅色液體。與空白組比較，模型組小鼠肺體積增大，被膜光亮、濕潤，表面呈紅褐色或暗紫色，可見點狀或片狀出血，部分剪斷氣管時有粉紅色泡沫樣液體流出。與模型組比較，地塞米松組小鼠肺體積減小，出血點減少；復方多血康膠囊各劑量組小鼠病變均不同程度減輕，其中復方多血康膠囊高、中劑量組小鼠肺組織體積正常，表面紅潤，肺表面未見明顯出血斑，剪斷氣管時無液體流出；復方多血康膠囊低劑量組小鼠肺組織改善效果不及高、中劑量組明顯，結果見圖1。

3.2.2 HE染色結果 空白組小鼠肺組織結構正常，肺泡腔清晰，各級支氣管壁及肺泡間隔無水腫或炎癥細胞浸潤。模型組小鼠肺組織變化明顯，肺組織正常結構消失，出現(xiàn)彌漫性肺水腫，肺泡間隔及肺泡壁明顯增寬，肺泡和間質(zhì)充血且有大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔出現(xiàn)滲出液。與模型組比較，地塞米松組小鼠肺泡結構完整，肺間隔未見明顯增厚；復方多血康膠囊高劑量組小鼠肺間隔增厚較輕、炎癥細胞較少、出血現(xiàn)象較輕，中、低組小鼠肺組織的病理變化改善不及高劑量組，結果見圖2。

圖1 肉眼觀察肺組織形態(tài)學改變Fig 1 Morphological changes of lung tissue by visual observation

圖2 光鏡下觀察小鼠肺組織的病理學變化（HE染色，× 10）Fig 2 Histopathological changes of lung tissue observed under light microscopy（HE staining，×10）

3.3 肺組織中MDA、SOD和GSH-Px水平測定結果

與空白組比較，模型組小鼠肺組織中MDA水平明顯升高（P＜0.01），SOD、GSH-Px水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，除復方多血康膠囊低劑量組小鼠肺組織中MDA水平降低不明顯外，其余各給藥組小鼠上述指標均明顯改善（P＜0.05或P＜0.01），結果見表2。

4 討論

急性肺損傷的發(fā)病機制主要是炎癥反應所導致的各種急性、進行性缺氧性呼吸衰竭。如何減輕這種組織損傷、降低炎癥反應對機體的危害是目前研究的熱點[11]。LPS是革蘭氏陰性菌感染時細菌崩解所釋放的一種物質(zhì)，又叫內(nèi)毒素，可作為抗原激活機體的免疫應答，誘使TNF-α、IL-6等炎癥細胞因子的釋放[12]，近年來成為研究急性肺損傷的理想致傷劑[9-10，12]。LPS的給藥途徑有通過氣道內(nèi)滴入、腹腔注射、霧化吸入、靜脈注射等[13]。前2種給藥途徑在急性肺損傷小鼠模型中使用較多，但是氣道內(nèi)滴入LPS較腹腔注射操作復雜，故本研究最終選擇腹腔注射LPS的給藥方式進行造模。結果顯示，給予LPS后小鼠肺組織形態(tài)學、病理學、含水量變化均符合肺損傷模型特征，提示造模成功。此外，已有研究表明在急性肺損傷發(fā)生早期給予中、低劑量地塞米松可以減輕肺組織損傷[8]，故本實驗采用地塞米松作為陽性對照藥物。

表2 各組小鼠肺組織中MDA、SOD和GSH-Px水平測定結果（±s，n＝10）Tab 2 Determination results of MDA，SOD and GSHPx levels in lung tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表2 各組小鼠肺組織中MDA、SOD和GSH-Px水平測定結果（±s，n＝10）Tab 2 Determination results of MDA，SOD and GSHPx levels in lung tissue of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

GSH-Px，μmol/mg prot36.00±1.9225.99±2.81＊＊30.88±3.19##31.20±2.91##31.34±4.09##28.96±3.97#組別空白組模型組地塞米松組復方多血康膠囊高劑量組復方多血康膠囊中劑量組復方多血康膠囊低劑量組MDA，nmol/mg prot1.22±0.212.06±0.36＊＊1.53±0.31##1.59±0.29##1.67±0.33#1.89±0.67SOD U/mg prot6.01±0.614.50±0.40＊＊5.13±0.49##5.67±0.57##5.62±1.04##5.35±0.52##

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶。當肺損傷時，SOD的生成及活性受到炎癥因子的抑制，在清除氧自由基時消耗劇烈，從而降低了SOD的含量及活性。MDA是脂質(zhì)過氧化物的主要產(chǎn)物，與機體內(nèi)氧自由基的生成量及其活性成正比，故當發(fā)生急性肺損傷時，MDA的含量增加[14]。GSH-Px是一種在機體內(nèi)廣泛存在的過氧化物分解酶，能催化谷胱甘肽（GSH）變?yōu)镚SH-Px，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害[15]。在本研究中，筆者評估了復方多血康膠囊對LPS誘導小鼠肺氧化應激的作用。結果表明，模型組小鼠肺組織中MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低，提示機體氧化與抗氧化平衡失調(diào)；復方多血康膠囊各劑量組肺組織中MDA水平均降低，SOD、GSH-Px水平均升高，表明復方多血康膠囊可以降低LPS誘導的氧化應激反應，發(fā)揮肺保護作用。

LPS刺激并活化單核-巨噬細胞，致使相關炎癥細胞合成并分泌大量的炎癥介質(zhì)，對組織產(chǎn)生廣泛的損害效應。TNF-α被認為是感染性急性肺損傷發(fā)病中較為重要的細胞因子。LPS誘導單核細胞、巨噬細胞活化分泌TNF-α，可進一步作為主要的促炎性細胞因子誘導IL-6的生成[12]。本研究中，模型組小鼠血清中TNF-α和IL-6的分泌量較基礎水平均有所升高，提示在LPS致肺組織損害的過程中發(fā)生了炎癥反應。而復方多血康膠囊各劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平明顯降低，提示復方多血康膠囊對急性肺損傷過程中炎癥因子有抑制作用。

綜上所述，藏藥多血康膠囊可改善由LPS引起的小鼠急性肺損傷的癥狀，減輕肺損傷程度，增加肺組織中抗氧化酶產(chǎn)生，減少血液中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和滲出，對LPS誘導的急性肺損傷小鼠具有一定的保護作用。筆者推測其保護作用機制可能與其保護肺部血管內(nèi)皮細胞功能、減少大分子物質(zhì)滲出相關，但有待進—步的研究證實。

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Protective Effect of Tibetan Medicine Compound Duoxuekang Capsules on Acute Lung Injury in Mice Induced by Lipopolysaccharide

HU Xiaoxin，LUO Qiang，DU Leilei，ZHANG Yi，JIANGYONG Silang（College of Ethnic Medicine，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China）

OBJECTIVE：To investigate the protective effect of Tibetan medicine Compound Duoxuekang capsules on the acute lung injury in mice induced by lipopolysaccharide.METHODS：60 KM mice were randomly divided into blank group，model group，dexamethasone group（positive control，1 mg/kg）and Compound Duoxuekang high-dose，medium-dose，low-dose groups（3.6，1.8，0.9 g/kg，calculated by crude drug），10 in each group.Intragastrically administrated，mice in blank group and model group intragastrically administrated equal volume of normal saline，once a day.After 7 d of administration，except for blank group，mice in other groups intraperitoneally injected lipopolysaccharide to induce acute lung injury.After 6 h modeling，pathological changes in the lung tissue was observed，lung tissue water content was measured，superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px），malondialdehyde（MDA）levels in lung tissue and IL-6，TNF-α levels in serum were detected.RESULTS：Compared with blank group，mice in model group showed pathological changes in congestion and edema，inflammatory cell infiltration，obvious widened alveolar septum and alveolar wall；water content in lung tissue and IL-6，TNF-α levels in serum were significantly increased（P＜0.01）；SOD，GSH-Px levels in lung tissue were significantly decreased（P＜0.01）.Compared with model group，injury degree of lung tissue reduced to varying degrees in each treatment group，except for the water content，MDA level in lung tissue and TNF-α level in serum in Compound Duoxuekang capsules low-dose group；the above-mentioned indexes in other groups were significantly improved（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Compound Duoxuekang capsules can obviously reduce mice’s oxidative stress and inflammatory response，and has certain protective effect on acute lung injury in mice.

Tibetan medicine；Compound Duoxuekang capsules；Acute lung injury；Inflammation；Oxidative stress；Mice

R965

A

1001-0408（2017）07-0926-04

2016-10-02

2016-12-23）

（編輯：林 靜）

國家自然基金青年項目（No.8150141651）；成都中醫(yī)藥大學科技發(fā)展基金資助項目（No.030018002，CGPY1503）；醫(yī)藥行業(yè)科研專項（No.201507002）

＊碩士研究生。研究方向：民族醫(yī)學。電話：028-31800400。E-mail：Hxxsunny520@163.com

#通信作者：藏醫(yī)主任醫(yī)師，教授，碩士生導師。研究方向：南派藏醫(yī)藥。電話：028-61800400。E-mail：dwyx110520@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.18