阿苯達唑納米脂質體凍干粉的制備及性質考察Δ

陳 蓓，陳春燕，高惠靜，王建華，趙 軍（新疆醫科大學第一附屬醫院藥學部，烏魯木齊 830011）

阿苯達唑納米脂質體凍干粉的制備及性質考察Δ

陳 蓓＊，陳春燕，高惠靜，王建華，趙 軍#（新疆醫科大學第一附屬醫院藥學部，烏魯木齊 830011）

目的：制備阿苯達唑納米脂質體凍干粉并對其性質進行考察。方法：利用冷凍干燥法制備阿苯達唑納米脂質體凍干粉，以粒徑、包封率聯合外觀、再分散性為指標，采用單因素試驗聯合正交試驗篩選凍干處方工藝。考察凍干前、后脂質體的形態學變化、粒徑、Zeta電位、水分含量、4℃下12個月的穩定性。結果：采用外加凍干保護劑的總量為10%，其中葡萄糖-海藻糖-甘露醇配比為1.0∶1.0∶3.0，以速凍的方式，于－35℃冰箱預凍18 h，冷凍干燥48 h獲得凍干粉。與凍干前比較，凍干后脂質體形態未發生明顯變化，可見清晰的磷脂雙分子層膜結構；凍干前、后脂質體的粒徑分別為（208.63±1.04）、（223.04±2.02）nm，Zeta電位分別為 （－15.6±0.04）、（－19.4±0.06）mV，包封率分別為（94.62±0.49）%、（91.10±0.46）%（n＝3）；與脂質體比較，脂質體凍干粉在4℃下12個月較穩定。結論：成功制得阿苯達唑納米脂質體凍干粉，其穩定性優于阿苯達唑納米脂質體，凍干工藝可行。

阿苯達唑；納米脂質體；凍干粉；粒徑；包封率；穩定性；正交試驗

包蟲病是一種嚴重危害人畜健康的寄生蟲病，新疆是包蟲病高發區。阿苯達唑（Albendazole，ABZ）是世界衛生組織（WHO）推薦抗包蟲的主要藥物之一，但是因其水溶性差、腸道吸收不好、生物利用度不高，嚴重影響了其療效[1]。ABZ納米脂質體（NL-ABZ）是針對上述問題而研究的一種新型給藥系統。NL-ABZ的處方包含0.5%～1.0%阿苯達唑、1.0%～3.0%卵磷脂、0～0.3%苯甲酸鈉、0～0.02%抗氧劑和0.7%～0.9%氯化鈉溶液，平均粒徑為200 nm，制備工藝為微射流高壓均質工藝。大鼠預實驗結果表明，與普通ABZ脂質體（L-ABZ）相比，NL-ABZ的生物利用度顯著提高。然而液態的納米脂質體混懸液的物理化學穩定性差，磷脂也易水解氧化，并且藥物也容易泄漏，且粒子的聚集導致粒徑變大[2]，是其應用于臨床的主要局限。真空冷凍干燥技術制備凍干脂質體是目前解決液態脂質體不能長期儲存、提高脂質體穩定性的最佳方法。凍干制劑特有的疏松多孔結構，可以使藥物易于重新復溶而恢復活性；而且凍干制劑含水量低，易長期穩定保存，可以有效避免脂質體以水溶液方式貯存導致的易氧化、水解、聚集、分層、滲漏等問題[3-5]。本研究擬制備NL-ABZ凍干粉，優化凍干處方工藝，并考察凍干制劑的理化性質和穩定性。

1 材料

1.1 儀器

FDU-1100冷凍干燥機（東京理化器械株式會社）；ZEN3690激光粒度分布儀（英國馬爾文公司）；JSM-1230透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；HS153梅特勒水分測定儀（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

ABZ原料藥（廣西桂林南藥股份有限公司，批號：M-D60605，純度：99%）；大豆磷脂Epikuron 200（德國Lucas Meyer Gmbh公司）；0.9%氯化鈉注射液（國藥集團新疆制藥有限公司，批號：20130122）；葡萄糖（天津市盛奧化學試劑有限公司，批號：20120618）；麥芽糖（上海藍季科技發展有限公司，批號：20120812）；海藻糖（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20120702）；蔗糖、乳糖（天津市天新精細化工開發中心，批號：20120710、20120909）；甘露醇（天津永晟精細化工有限公司，批號：20121001）；木糖醇、山梨醇（天津市光復精細化工研究所，批號：20121113、20120309）；以上試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 凍干粉評價指標

2.1.1 粒徑 測定復溶后的納米脂質體凍干粉粒徑，與凍干前納米脂質體粒徑變化不大者為佳。

2.1.2 包封率 測定復溶后的納米脂質體凍干粉包封率[6]，比凍干前納米脂質體包封率降低較少者為佳。

2.1.3 外觀 以保持原體積、飽滿、不皺縮、不塌陷、可整塊脫落但不散碎為佳。以“+++”表示松散、光滑、平整飽滿；“++”表示輕度皺縮、塌陷；“+”表示嚴重皺縮、塌陷；“-”表示不能成型。

2.1.4 再分散性 取納米脂質體凍干粉，加入與凍干前同體積的0.9%氯化鈉注射液，振搖分散。振搖后能很快分散、無不溶顆?；驁F塊，得到均勻的納米脂質體混懸液者為佳。以“+++”表示振搖1 min內能復溶成均勻混懸液，無不溶顆?；驁F塊；“++”表示振搖1～3 min內能復溶成較均勻混懸液，肉眼可見少量不溶顆粒；“+”表示振搖5 min仍不能復溶成較均勻混懸液，黏壁，肉眼可見部分不溶顆粒或團塊。

2.2 統計學方法

2.3 NL-ABZ的制備

取處方量的ABZ原料藥、大豆磷脂，按質量比1∶2混合，加入至適量冰醋酸中溶解，快速攪拌下快速加入氫氧化鈉溶液中和，調pH至6～7。置于透析袋內以0.9%氯化鈉注射液透析，冰水浴超聲40 min，4 000 r/min（離心半徑：6 cm）離心15 min。棄上清，加苯甲酸鈉和0.9%氯化鈉注射液制得脂質體初品，再以微射流高壓均質處理得到NL-ABZ，規格為10 g/L。

2.4 NL-ABZ凍干工藝的考察

凍干工藝一般分為預凍、升華干燥、解析干燥3步[7]。本試驗以10%甘露醇為凍干保護劑，以粒徑和包封率為主要評價指標，以凍干樣品外觀和再分散性為輔助參考指標，分別對預凍方式、預凍溫度、預凍時間及干燥時間進行單因素考察。

2.4.1 預凍方式 預凍方式分為慢凍和速凍2種。本試驗分別考察了速凍（直接于－35℃放置18 h）、慢凍（4℃放置1 h，－18℃放置12 h，－35℃放置5 h）條件對凍干產品的影響。結果顯示，速凍優于慢凍。

2.4.2 預凍溫度 根據文獻[8]報道，預凍的最低溫度至少要低于樣品共熔點以下10℃。本試驗考察了預凍溫度分別為－18、－35、－80℃時對凍干產品的影響。結果顯示，最適預凍溫度為－35℃。

2.4.3 預凍時間 如果預凍時間過短，在干燥階段易導致噴瓶，影響包封率及外觀；預凍時間過長又會增加不必要的能耗[9]。本試驗考察了預凍時間分別為12、18、24 h時對凍干產品的影響。結果顯示，最適預凍時間為18 h。

2.4.4 干燥時間 干燥時間決定了樣品中的含水量，干燥時間不夠，樣品中含有較高的水分，外觀塌陷，復溶時極易黏壁，造成產品外觀和再分散性都不理想。本試驗考察了總干燥時間分別為24、36、48 h時對凍干產品的影響。結果顯示，最適干燥時間為48 h。

2.5 凍干保護劑的篩選

以粒徑和包封率為主要評價指標，以凍干樣品外觀和再分散性為輔助參考指標，對凍干保護劑進行篩選。2.5.1 加入方式 凍干保護劑的加入方式分為外加和內加2種。本試驗以10%甘露醇為凍干保護劑，考察了內加、外加對凍干產品的影響。結果顯示，內加、外加方式制得的NL-ABZ凍干粉復溶后的粒徑分別為（255.30±3.32）、（251.71±2.61）nm，包封率分別為（75.90±1.18）%、（76.53±0.61）%，外觀分別為“++”“++”，再分散性分別為“++”“++”。這表明凍干保護劑的加入方式對該凍干制劑的上述指標無明顯影響（P＞0.05），但外加凍干保護劑的用量較少，便于清洗高壓均質機，故確定采用外加方式。

2.5.2 單一凍干保護劑的篩選 固定凍干保護劑總量為10%，以不加任何凍干保護劑所制得的NL-ABZ凍干粉作為陰性對照，考察不同單一凍干保護劑（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇）對凍干產品的影響，結果見表1。

由表1可知，各種凍干保護劑單獨使用均不能達到凍干制劑的要求。綜合考察，以甘露醇、葡萄糖、海藻糖三者合用作為凍干保護劑，以期達到滿意的效果。

2.5.3 正交試驗優選凍干保護劑 以葡萄糖（A）、海藻糖（B）、甘露醇（C）3種凍干保護劑的質量比為因素，每個因素設3個水平，以綜合評分[（最小粒徑/平均粒徑）× 50%+（平均包封率/最大包封率）×50%]為指標，按L9（34）表設計正交試驗。因素與水平見表2，正交試驗設計與結果見表3，方差分析結果見表4。

由表3可知，對綜合評分的影響大小先后順序為A＞C＞B；由表4可知，A和C對綜合評分均有顯著影響（P＜0.05）。綜合考慮，確定最優凍干保護劑處方為A1B1C1，即葡萄糖-海藻糖-甘露醇（1.0∶1.0∶3.0）。為驗證上述結果的重現性，保證納米脂質體凍干粉制備工藝的穩定可行，按上述條件制備3批凍干粉進行驗證試驗。結果顯示，3批凍干粉復溶后粒徑為（223.04± 2.02）nm，包封率為（91.10±0.46）%。

2.5.4 凍干保護劑總量的考察 固定葡萄糖-海藻糖-甘露醇質量比為1.0∶1.0∶3.0，考察凍干保護劑總量分別為4%、8%、12%、16%、20%時對凍干產品的影響，結果見表5。

表1 不同單一凍干保護劑對凍干粉的影響（n＝3）Tab 1 Effects of different single freeze-dried protective agents on freeze-dried powder（n＝3）

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗設計與結果Tab 3 Design and results of orthogonal test

表4 方差分析結果Tab 4 Result of variance analysis

表5 不同總量凍干保護劑對凍干粉的影響（n＝3）Tab 5 Effects of freeze-dried protective agents with different contents on freeze-dried powder（n＝3）

由表5可知，當凍干保護劑總量為10%、12%時，凍干產品粒徑、包封率、外觀和再分散性等指標均為最佳?？紤]到制備成本，最后確定凍干保護劑總量為10%。

綜上所述，取NL-ABZ，外加10%凍干保護劑[葡萄糖-海藻糖-甘露醇（1.0∶1.0∶3.0）]，－35℃預凍18 h，干燥48 h，制得NL-ABZ凍干粉。

2.6 NL-ABZ凍干粉的性質考察

2.6.1 形態學 取適量NL-ABZ及NL-ABZ凍干粉，加入0.9%氯化鈉注射液稀釋。用1%醋酸雙氧鈾負染法制樣，干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察形態，結果見圖1。

圖1 NL-ABZ和NL-ABZ凍干粉的電鏡圖（×7 000）Fig 1 Electron microscopy of NL-ABZ and NL-ABZ freeze-dried power（×7 000）

由圖1可見，NL-ABZ外觀圓整、大小均一，可清晰觀察到磷脂雙分子層結構。NL-ABZ凍干粉復溶后脂質體形態未發生明顯改變，有清晰的磷脂雙分子層膜結構。

2.6.2 粒徑和Zeta電位 取適量NL-ABZ及NL-ABZ凍干粉，加入0.9%氯化鈉注射液稀釋，混勻后采用激光粒度分布儀測定粒徑和Zeta電位。結果顯示，NL-ABZ（凍干前）的平均粒徑為（208.63±1.04）nm，Zeta電位為（－15.60±0.04）mV；NL-ABZ凍干粉（凍干后）復溶后的平均粒徑為（223.04±2.02）nm，Zeta電位為（－19.40±0.06）mV，表明凍干前后粒徑及Zeta電位無顯著變化。NL-ABZ凍干前、后的粒徑分布見圖2，Zeta電位見圖3。

2.6.3 水分含量 采用梅特勒水分測定儀測定NL-ABZ凍干粉的含水量為3.12%（＜5%），說明處方工藝可行。

2.6.4 穩定性 以粒徑、包封率、磷脂氧化指數、ABZ含量為指標，分別考察4℃條件下NL-ABZ（凍干前）和NL-ABZ凍干粉（凍干后）12個月內的穩定性，結果見表6。

圖2 NL-ABZ凍干前、后的粒徑分布Fig 2 Particle size distributions of NL-ABZ before and after freeze-drying

圖3 NL-ABZ凍干前、后的Zeta電位Fig 3 Zeta potentials of NL-ABZ before and after freeze-drying

表6 4℃下12個月內的穩定性試驗結果（n＝3）Tab 6 Results of stability test within 12 months at 4℃（n＝3）

由表6可知，NL-ABZ在4℃下貯存，隨放置時間的延長，其外觀逐漸變黃，粒徑增大的幅度較大；6個月時磷脂氧化指數略超過0.2，磷脂被氧化；9個月時包封率已下降至70%以下；12個月時ABZ含量與0個月時比較顯著下降（P＜0.05）。NL-ABZ凍干粉于4℃下貯存，放置12個月的外觀、粒徑、包封率、磷脂氧化指數及ABZ含量與0個月時比較均無明顯變化（P＞0.05）。由此可見，凍干工藝能明顯延長NL-ABZ在4℃下的穩定性。

3 討論

糖類凍干保護劑能夠有效防止脂質體在冷凍干燥過程中的破壞，目前主要認為有兩大機制：玻璃化和水取代機制[10]。預凍過程中，糖類溶液作為保護劑能誘導玻璃態的生成，使磷脂膜免受冰晶的機械破壞，減小冰晶嵌入脂質體雙分子層膜的概率，防止膜破裂；同時可以作為間隔基質，阻礙脂質體粒子之間的相互融合和聚集，但本身屬于無定形保護劑，在凍干時不會有良好的外觀[11]。另一個保護機制是水取代機制。糖類作為凍干保護劑可與脂質體中磷脂的頭部基團形成氫鍵，脫水后代替水分作為脂質體的保護劑，保持脂質體雙分子膜的完整性，避免包封藥物的泄漏[12]。

醇類凍干保護劑甘露醇由于自身結晶的支撐能力，容易獲得飽滿的外觀，但是結晶的形成又會對脂質體膜造成機械破壞，導致脂質體的包封率下降和粒徑的增大。

然而一個合格的脂質體凍干粉制劑應同時滿足兩個條件：（1）需要有玻璃態（無定形）存在，能保護脂質體膜不受到冰晶的機械破壞作用；（2）外觀飽滿、平整、致密，有一定硬度，在升華干燥階段不會塌陷。這是兩個相互制約的方面。而本文考察的各種保護劑單獨使用也均不能同時滿足上述兩個條件，因此對所有納入的凍干保護劑進行了兩兩搭配。結果表明，將糖類與醇類聯用時，不僅能獲得良好的外觀和再分散性，復溶后的脂質體粒徑和包封率較凍干前也無明顯變化（P＞0.05），能夠獲得滿意的凍干保護效果。

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Preparation and Properties Study of Albendazole Nanoliposomes Freeze-dried Powder

CHEN Bei，CHEN Chunyan，GAO Huijing，WANG Jianhua，ZHAO Jun（Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China）

OBJECTIVE：To prepare the Albendazole nanoliposomes freeze-dried power and study its properties.METHODS：Freeze-drying method was conducted to prepare Albendazole nanoliposomes freeze-dried power，using the particle size，encapsulation efficiency，appearance，redispersibility as indexes，single factor test was combined with orthogonal test to screen freeze-drying preparation technology.The morphological changes，particle size，Zeta potential，moisture content，12 months stability at 4℃before and after freeze-drying were detected.RESULTS：Plus a total content of freeze-dried protective agent was 10%，the ratio of glucose-trehalose-mannitol was 1.0∶1.0∶3.0，using quick-freeze，pre-freezing 18 h in－35℃refrigerator，dry-freezing 48 h to obtain freeze-dried powder.Compared with before freeze-drying，the freeze-dried liposomal morphology had no obvious changes，showing clear phospholipid bilayer membrane structure；the particle sizes before and after freeze-drying were（208.63±1.04）nm and（223.04±2.02）nm，Zeta potentials were（－15.6±0.04）mV and（－19.4±0.06）mV，encapsulation efficiencies were（94.62±0.49）%and（91.10±0.46）%（n＝3），respectively.Compared with liposomes，liposomes freeze-dried power had good stability in 12 months at 4℃.CONCLUSIONS：Albendazole nanoliposomes freeze-dried power is prepared successfully，its stability is superior to albendazole nanoliposomes，and the freeze-drying technology is feasible.

Albendazole；Nanoliposomes；Freeze-dried powder；Particle size；Encapsulation efficiency；Stability；Orthogonal test

R943

A

1001-0408（2017）07-0967-04

2016-07-29

2016-09-15）

（編輯：鄒麗娟）

新疆重大疾病醫學重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地開放項目（No.SKLIB-XJMDR-2014-10）

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥物新制劑。電話：0991-4363438。E-mail：chenbei_lisa@163.com

#通信作者：主任藥師，碩士。研究方向：新藥研發。電話：0991-4363438。E-mail：1184888385@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.30