枳殼發(fā)酵炮制前后的成分變化及工藝優(yōu)化

張棟健，李 薇，梁之桃，簡宏良，黃傳奇，何鈞恒[.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州 50405；.香港浸會大學中醫(yī)藥學院，香港中國；.余仁生（香港）有限公司，香港中國]

枳殼發(fā)酵炮制前后的成分變化及工藝優(yōu)化

張棟健1＊，李 薇1#，梁之桃2，簡宏良1，黃傳奇1，何鈞恒3[1.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州 510405；2.香港浸會大學中醫(yī)藥學院，香港中國；3.余仁生（香港）有限公司，香港中國]

目的：比較枳殼發(fā)酵炮制前后的成分變化并優(yōu)化其發(fā)酵炮制工藝。方法：采用超高效液相色譜法對同一批枳殼藥材及其發(fā)酵炮制品進行比較，確定枳殼發(fā)酵炮制后的色譜特征峰；以4個色譜特征峰的峰面積和樣品霉變性狀為指標，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵濕度、發(fā)酵時間為因素，設(shè)計L9（34）正交試驗優(yōu)化枳殼發(fā)酵炮制工藝并進行驗證。結(jié)果：枳殼經(jīng)發(fā)酵炮制后明顯產(chǎn)生2個單糖苷新成分；優(yōu)化的枳殼發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵濕度70%、發(fā)酵時間7 d；驗證試驗結(jié)果顯示，3次試驗各指標的RSD均小于2.0%（n＝3）。結(jié)論：發(fā)酵炮制可致枳殼發(fā)生明顯的化學成分變化，優(yōu)化的發(fā)酵炮制工藝可增加枳殼特征峰成分含量。

枳殼；發(fā)酵炮制；正交試驗；超高效液相色譜法；色譜特征峰；霉變性狀；工藝優(yōu)化

枳殼是中醫(yī)臨床常用的一種藥材。2015年版《中國藥典》（一部）收載的枳殼為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）及其栽培變種的干燥未成熟果實，經(jīng)洗凈、潤透后切薄片作飲片用，具有行氣寬中、消食化痰之功效，可用于胸腹?jié)M悶脹痛、食積不化、痰飲、胃下垂、脫肛、子宮脫垂等的治療[1]。

粵港地區(qū)的傳統(tǒng)枳殼飲片炮制沿襲于文獻[2]中記載的枳殼蒸切炮制方法，并收載于1984年版《廣東省中藥炮制規(guī)范》[3]中，即取原藥材，去核及瓤，加水浸透，待發(fā)酵后蒸至紫褐色，切片即可。這種發(fā)酵后使用的枳殼飲片經(jīng)實踐證明療效較好，故被臨床醫(yī)師延用至今。該發(fā)酵飲片有別于歷版《中國藥典》收載的炮制方法，是一種地方特色飲片。

目前對枳殼發(fā)酵炮制研究較少，雖然已有研究不同發(fā)酵時間對樟幫枳殼飲片質(zhì)量影響的報道[4]，并指出飲片色度差與柚皮苷、新橙皮苷有效成分存在顯著相關(guān)性，但對枳殼發(fā)酵炮制前后的成分變化目前尚未見文獻報道。發(fā)酵是微生物對有機物的一種分解過程，可產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，應(yīng)用于中藥炮制有多方面的優(yōu)勢，如降低毒性、增強療效、產(chǎn)生新的活性成分和提高有效成分萃取率及含量等[5-7]。因此，研究枳殼發(fā)酵炮制前后成分變化及優(yōu)化其發(fā)酵炮制工藝具有較大的意義。本研究利用超高效液相色譜法（UPLC）[8]對同一批枳殼藥材及其炮制品進行研究，探討枳殼發(fā)酵炮制前后成分變化；并采用正交試驗[9]，以枳殼發(fā)酵炮制飲片的色譜特征峰和霉變性狀為指標，優(yōu)化枳殼發(fā)酵炮制工藝。本研究旨在為推進此項炮制工藝的規(guī)范化、飲片品質(zhì)的穩(wěn)定性提供參考，也為繼承和發(fā)展此項具有地方特色的枳殼飲片炮制方法提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC儀（美國Waters公司）；MT5電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；100B恒溫恒濕培養(yǎng)箱（金壇市城西崢嶸實驗儀器廠）。

1.2 藥材、對照品與試劑

枳殼（四川新荷花中藥飲片廠，批號：D1301099，產(chǎn)地：四川，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學李薇教授鑒定為蕓香科植物酸橙的干燥未成熟果實）；柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110722-200610、110721-201115、111857-201102，純度分別為：98%、95.3%、99.6%）；甲醇、乙腈為色譜醇，乙醇、磷酸為分析純，水為去離子蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 枳殼原藥材 取枳殼藥材100 g磨粉，過20目篩。2.1.2 粵港枳殼飲片 取同批枳殼藥材1 000 g，洗凈，加水1 L浸透，裝入麻袋，自然室溫（溫度約18～30℃，濕度約70%～90%）發(fā)酵至長滿菌絲（約5 d），取出洗凈，蒸3 h，悶12 h，至內(nèi)部呈紫褐色時取出，切片，置于烘箱50℃干燥。取100 g磨粉過20目篩。

2.1.3 枳殼飲片對照品 取同批枳殼藥材1 000 g，洗凈，加水1 L浸透，從“蒸3 h”起，其余操作同“粵港枳殼飲片”。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品柚皮苷4.0 mg、橙皮苷2.4 mg、新橙皮苷3.0 mg，分別用甲醇溶解并定容，分別得0.4、0.24、0.3 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取樣品粉末0.20 g，置于50 mL離心管中，加入50%乙醇20 mL，超聲（240 W）30 min，離心5 min（3 000 r/min，離心半徑為16 cm），用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 UPLC色譜條件

色譜柱：Water Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85，V/V）；流速：0.7 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：0.5 μL；檢測波長：224 nm。

2.5 精密度試驗

分別取“2.2”項下3種對照品溶液，連續(xù)進樣5次，計算峰面積及保留時間的RSD。結(jié)果，峰面積的RSD均小于5.0%（n＝5），保留時間的RSD均小于2.0%（n＝5）。

2.6 重復性試驗

按“2.3”項下方法制備5份粵港枳殼飲片的供試品溶液，進樣、記錄色譜圖。以“2.7”項中圖1B的1、2、3、4號峰為考察對象，計算峰面積及保留時間的RSD。結(jié)果，4個峰峰面積的RSD均小于5.0%（n＝5），保留時間的RSD均小于2.0%（n＝5）。

2.7 樣品分析

取“2.1”項下3種樣品制備的供試品溶液和“2.2”項下3種對照品溶液，進樣、記錄色譜圖。以3種對照品為對照，對枳殼發(fā)酵炮制前后的成分進行比較，得到UPLC圖譜見圖1。

從圖1可知，橙皮苷在枳殼色譜圖中的峰很小，即含量較低。因此本研究采用圖中的1、2、3、4號峰的峰面積為考察對象，比較枳殼發(fā)酵炮制前后成分的變化。結(jié)果顯示，經(jīng)過發(fā)酵后的炮制飲片（圖1B），明顯出現(xiàn)3、4號峰。

2.8 粵港枳殼飲片UPLC特征峰圖譜建立

參考《香港中藥材標準》附錄Ⅻ指紋圖譜的建立方法[10]，根據(jù)參照峰的保留時間，標定各特征峰的相對保留時間。選定指標成分即柚皮苷（1號）峰為參照峰（峰面積最大），則各特征成分峰的保留時間除以參照峰保留時間，即得粵港枳殼飲片4個特征峰1、2、3、4號峰的相對保留時間平均值分別為1.00、1.65±0.01、0.84± 0.01、1.39±0.01（n＝5）。

2.9 枳殼發(fā)酵炮制工藝優(yōu)化

2.9.1 因素與水平的確定 粵港枳殼飲片發(fā)酵炮制常受自然環(huán)境溫度、濕度和發(fā)酵時間的影響，通常發(fā)酵時間是3～7 d。在上述試驗的基礎(chǔ)上，以粵港枳殼飲片UPLC圖譜中4個特征峰的峰面積、霉變性狀為評價指標，以發(fā)酵溫度（A，℃）、發(fā)酵濕度（B，%）、發(fā)酵時間（C，d）為因素，對枳殼傳統(tǒng)發(fā)酵炮制工藝進行L9（34）正交試驗。因素與水平見表1。

2.9.2 樣品霉變性狀評分標準的確定 粵港枳殼飲片傳統(tǒng)發(fā)酵程度一般是通過直接觀察樣品霉變性狀進行判斷，以樣品全部布滿白色菌絲為最高分，再按霉變程度設(shè)定分值，具體評分標準見表2。

2.9.3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果 取枳殼1 000 g，洗凈，加水1 L浸透，裝入麻袋，依正交設(shè)計的因素、水平分別在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中對樣品進行發(fā)酵處理后，取出洗凈，蒸3 h，其余同“2.1”項下“粵港枳殼飲片”方法處理。再按“2.3”項下方法將飲片制備成供試品溶液，進樣，記錄色譜峰面積，結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果見表4。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 樣品霉變性狀評分標準Tab 2 Scoring criteria of samples’mildew characteristics

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 3 Design and results of orthogonal test

綜合5個指標，從趨勢及因素主次可見A因素對1、2、3號峰峰面積和霉變性狀評分影響均最大，C因素對4號峰峰面積影響最大；A3在5個指標均最大，故A取A3。C3在1、2、3、4號峰峰面積4個指標中最大，雖在霉變性狀分值中不是最大，但與最好的C2接近，故C確定為C3。B1在1、2、4號峰的峰面積中最大，雖在3號峰上不是最大，但與最好的B2接近，故B確定為B1。由此得出最優(yōu)工藝條件為A3B1C3，即發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵濕度70%、發(fā)酵時間7 d。

2.9.4 驗證試驗 對上述A3B1C3工藝進行3次驗證試驗，結(jié)果見表5。

由表5可見，4個峰的峰面積值均較大，提示特征峰成分的含量較高；同時，霉變性狀分值較高；且5個指標的RSD均小于2.0%（n＝3），表明優(yōu)化的工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

通過對同一批次的枳殼藥材及其炮制飲片的UPLC圖譜進行比較，發(fā)現(xiàn)未發(fā)酵的枳殼飲片對照品未見3、4號峰，而經(jīng)發(fā)酵后的粵港枳殼飲片明顯產(chǎn)生了新成分3、4號峰，證明3、4號峰是枳殼經(jīng)微生物發(fā)酵后產(chǎn)生的新成分，由此可提示粵港枳殼飲片的炮制方法是有物質(zhì)基礎(chǔ)的，可為其炮制機制的研究提供科學依據(jù)。

鑒于發(fā)酵炮制可使枳殼產(chǎn)生明顯的化學成分變化，因此，優(yōu)化枳殼發(fā)酵炮制工藝、提升其炮制質(zhì)量，對此特色飲片的生產(chǎn)和臨床使用有重要意義。故筆者利用恒溫恒濕培養(yǎng)箱來控制發(fā)酵的溫度和濕度，對發(fā)酵的炮制工藝進行了優(yōu)化，最終認為發(fā)酵溫度和時間對結(jié)果影響較大，而發(fā)酵濕度對結(jié)果影響不大。故在枳殼發(fā)酵炮制過程中要重點考慮發(fā)酵溫度，其次考慮發(fā)酵時間。

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Variance analysis results

表5 驗證試驗結(jié)果Tab 5 Results of verification test

為進一步探討粵港枳殼飲片的發(fā)酵炮制機制，筆者以采用最優(yōu)發(fā)酵炮制工藝的炮制樣品為基礎(chǔ)，另采用UPLC附超高解析質(zhì)量精確度四極桿飛行時間質(zhì)譜儀分析比較其炮制前后成分的變化[11]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枳殼經(jīng)發(fā)酵炮制后，產(chǎn)生圣草酚-7-O-葡糖苷（單糖苷）、橙皮素-7-O-葡萄糖苷（單糖苷）、5-去甲基川陳皮素等3個新生成分，并可顯著增加柚皮素（苷元）和橙皮素（苷元）成分，以及明顯增加檸檬苦素、Sudachinoid A、黃柏酮酸、諾米林酸等檸檬苦素類衍生物成分的生成。推測本試驗中的3、4號峰分別可能是圣草酚-7-O-葡萄糖苷和橙皮素-7-O-葡萄糖苷成分。

圣草酚-7-O-葡萄糖苷是新北美圣草苷脫去1個鼠李糖的單糖苷，橙皮素-7-O-葡萄糖苷是橙皮苷或新橙皮苷脫去1個鼠李糖的單糖苷。由于黃酮類糖苷在小腸中需要通過脫糖基化作用才能被吸收[12]，故此發(fā)酵作用可將新北美圣草苷、橙皮苷和新橙皮苷這類黃酮類糖苷脫去糖基轉(zhuǎn)化為單糖苷或苷元，可使其極性減小、脂溶性增加，利于通過小腸吸收進入血液循環(huán)，較快達到所需血藥濃度并發(fā)揮其藥效作用[13]。還有研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷經(jīng)橙皮苷酶水解后產(chǎn)生的單糖苷和苷元可以改善橙皮苷的生物利用度[14]。綜上，粵港枳殼飲片經(jīng)發(fā)酵炮制后可能通過增加活性成分的生物利用度而增強了其臨床療效。

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（編輯：劉 萍）

Composition Changes of Aurantii Fructus before and after Fermentation Processing and Its Technology Optimization

ZHANG Dongjian1，LI Wei1，LIANG Zhitao2，JIAN Hongliang1，HUANG Chuanqi1，HE Junheng3[1.School of Pharmacy，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；2.School of Chinese Medicine，Hong Kong Baptist University，Hong Kong，China；3.Eu Yan Sang（Hong Kong）Ltd.，Hong Kong，China]

OBJECTIVE：To compare the composition changes of Aurantii fructus before and after fermentation processing and optimize its fermentation processing technology.METHODS：UPLC was conducted to compare the raw and fermentation processed products of same batch of Aurantii fructus，and ensure the chromatographic peaks after fermentation processing.Using peak areas of 4 chromatographic peaks and mildew characteristics of samples as index，fermentation temperature，humidity and time as factor，L9（34）orthogonal test was designed to optimize the fermentation processing technology，and verified it.RESULTS：After fermentation processing，Aurantii fructus obviously showed 2 new monosaccharide glycosides components；the optimized fermentation technology was as follows as fermentation temperature of 30℃，humidity of 70%and time of 7 d；verification test results showed RSD of each indicator of decoction pieces prepared by optimized fermentation technology in 3 tests were lower than 2.0%（n＝3）. CONCLUSIONS：Fermentation processing may lead obvious chemical composition changes in Aurantii fructus；the optimized fermentation processing technology can increase the contents of characteristic peaks.

Aurantii fructus；Fermentation processing；Orthogonal test；UPLC；Characteristic peak；Mildew characteristic；Technology optimization

R283

A

1001-0408（2017）07-0971-04

2016-06-26

2016-08-27）

＊博士研究生。研究方向：中藥品種鑒定、中藥飲片質(zhì)量控制。電話：00852-96557640。E-mail：tkcheungtony@gmail.com

#通信作者：教授，博士生導師，博士。研究方向：中藥鑒定及品質(zhì)評價。E-mail：liwei-li@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.31