杏花中綠原酸提取工藝優(yōu)化及不同產(chǎn)地和品種杏花中綠原酸的含量比較

羅慧玉，閆偉偉，徐 鵬，曾春萍（.張家口市食品藥品檢驗中心，河北張家口 075000；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊 05007）

杏花中綠原酸提取工藝優(yōu)化及不同產(chǎn)地和品種杏花中綠原酸的含量比較

羅慧玉1，2＊，閆偉偉1，2，徐 鵬1，曾春萍1（1.張家口市食品藥品檢驗中心，河北張家口 075000；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊 050017）

目的：優(yōu)化杏花中綠原酸的提取工藝，比較不同產(chǎn)地、不同品種杏花中綠原酸的含量。方法：采用高效液相色譜法測定杏花中綠原酸含量；以提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲提取次數(shù)和超聲提取時間為因素，以綠原酸含量為指標(biāo)，設(shè)計單因素和正交試驗優(yōu)化提取工藝，并進(jìn)行驗證試驗。采用優(yōu)化后提取工藝提取并比較7個產(chǎn)地杏花和3個產(chǎn)地山杏花中綠原酸的含量。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為加12倍量的75%乙醇，超聲提取2次，每次30 min。在此條件下，杏花綠原酸含量可達(dá)77.38 mg/g（RSD＝0.58%，n＝3）；山杏花、杏花中綠原酸含量分別為77.38～83.33、63.12～70.22 mg/g。結(jié)論：建立的提取工藝合理、穩(wěn)定、可行；山杏花中綠原酸含量較杏花高，同品種、不同產(chǎn)地的杏花中綠原酸含量差異不大。

杏花；綠原酸；正交試驗；提取工藝；優(yōu)化；產(chǎn)地；品種

杏花為薔薇科植物杏（Prunus armeniaca L.）或山杏（Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.）的干燥花，其功能主治為“主補(bǔ)不足、女子傷中、寒熱痹、厥逆”[1]。杏主要分布于我國東北、華北、西北、西南及長江中下游各地；山杏主要分布于我國東北、內(nèi)蒙古及華北地區(qū)（如遼寧、河北等），俄羅斯、蒙古也有分布[2]。目前關(guān)于杏花中有效成分的文獻(xiàn)報道較少，為深入挖掘我國寶貴的中藥資源，筆者在前期試驗中對杏花的化學(xué)成分進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，從中發(fā)現(xiàn)杏花中綠原酸含量較高，可達(dá)70 mg/g。而綠原酸具有保護(hù)心血管、抗誘變、抗癌、抗菌、抗病毒、降脂降糖及免疫調(diào)節(jié)等作用[3-4]，廣范應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健和日用化工等領(lǐng)域[5]。

超聲波技術(shù)利用超聲振動使植物組織細(xì)胞壁瞬間破裂，促進(jìn)溶劑滲透入中草藥細(xì)胞使其釋放內(nèi)含物，可提高有效成分的浸出率、縮短提取時間，同時可避免高溫對提取成分的影響，具有省時、節(jié)能、快速、高效等特點，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥材有效成分的提取[6-8]。

為了提高杏花的利用率和判斷各產(chǎn)地藥材中綠原酸含量的高低，筆者采用單因素和正交試驗法，以綠原酸含量為指標(biāo)優(yōu)化杏花提取工藝，為其開發(fā)利用提供試驗依據(jù)；并根據(jù)最優(yōu)提取工藝，對7個產(chǎn)地的杏花及3個產(chǎn)地的山杏花中綠原酸進(jìn)行提取并比較其含量。

1 材料

1.1 儀器

LC 2010A HT高效液相色譜（HPLC）儀、SPD-M10A VP二極管陣列檢測器、LC Solution色譜管理系統(tǒng)（日本島津公司）；YF-103型粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；CPA225D分析天平（德國賽多利斯集團(tuán)）；AS 10200A超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，250 W，50 kHz）。

1.2 藥材、對照品與試劑

杏花來源于江蘇（2014年3月）、陜西藍(lán)田（2015年3月）、浙江（2014年3月）、陜西旬邑（2015年3月）、山西（2014年3月）、河南（2014年3月）和安徽（2014年3月）7個產(chǎn)地；山杏花來源于北京房山（2015年3月）、河北張家口市區(qū)（2015年4月）、河北張家口沽源（2015年4月）3個產(chǎn)地，均由河北省藥品檢驗研究院段吉平主任藥師鑒定為薔薇科植物杏或山杏的干燥花；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201314，純度：96.6%）；磷酸、乙腈均為色譜純，甲醇、乙醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸含量的測定

2.1.1 色譜條件確定 色譜柱：YMC-Pack ODS-A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（9∶91，V/V）；檢測波長：325 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。取“2.1.2”項和“2.1.3”項溶液（正交試驗3號）進(jìn)樣分析，結(jié)果主峰與各雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 對照品貯備液的制備 精密稱取綠原酸對照品12.94 mg，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇約10 mL，超聲溶解后加50%甲醇定容，得質(zhì)量濃度為0.500 mg/mL的綠原酸對照品貯備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 樣品提取后離心（離心半徑為11 cm，4 000 r/min）10 min，取上清液蒸去溶劑，殘渣加50%甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，即得。

2.1.4 線性關(guān)系和定量限試驗 分別吸取綠原酸對照品貯備液0.1、0.2、1、2、5、10 mL，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.005 0、0.010、0.050、0.100、0.250、0.500 mg/mL的對照品溶液，進(jìn)樣測定。以綠原酸對照品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得回歸方程為y＝2.92×107x－1.85×104（r＝0.999 9），結(jié)果表明綠原酸在0.005 0～0.500 mg/mL范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系。將對照品溶液用50%甲醇不斷進(jìn)行稀釋后進(jìn)樣分析，得到綠原酸定量限為0.01 μg/mL（信噪比為10）。

2.1.5 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度試驗 按相關(guān)方法進(jìn)行操作。結(jié)果，精密度試驗中綠原酸峰面積的RSD為0.30%（n＝5）；穩(wěn)定性試驗中峰面積的RSD為0.49%（48 h，n＝8）；重復(fù)性試驗中綠原酸平均含量為77.38 mg/g（RSD＝0.58%，n＝5）；準(zhǔn)確度試驗中低、中、高3個水平樣品的平均回收率為98.47%（RSD＝1.4%，n＝3）。2.1.6 測定法 精密吸取供試品溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣測定，計算含量。

2.2 單因素試驗篩選綠原酸提取工藝

在超聲提取工藝中影響綠原酸提取量的主要因素有超聲提取時間、溶劑濃度和用量[9]；另外，在節(jié)約資源基礎(chǔ)上應(yīng)盡可能完全地提取藥材中的主成分，故還應(yīng)考慮提取次數(shù)的影響。故本研究設(shè)計單因素試驗考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲提取次數(shù)及提取時間對綠原酸含量的影響。

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 準(zhǔn)確稱取藥材粉末1.0 g，在超聲提取時間（功率：250 W，頻率：50 kHz，下同）為20 min、料液比為1∶10的條件下，分別設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%、65%、75%、85%、95%，超聲提取1次，結(jié)果見圖2A。

圖2 各因素對綠原酸含量的影響Fig 2 Effects of each factor on the content of chlorogenic acid

由圖2A可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在較低水平時，隨體積分?jǐn)?shù)的增大，綠原酸含量逐步增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時，綠原酸含量達(dá)到最大值；但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于75%后，綠原酸含量逐漸下降。因此，選擇65%、75%、85%乙醇進(jìn)行正交試驗考察。

2.2.2 料液比 精密稱取藥材粉末1.0 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%、超聲提取時間為20 min的條件下，料液比分別選擇1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，超聲提取1次，結(jié)果見圖2B。

由圖2B可見，當(dāng)料液比由1∶6增大到1∶10時，綠原酸含量快速增加；當(dāng)料液比超過1∶10后，綠原酸含量的變化不大，且基本達(dá)到最大值。因此，選擇料液比為1∶8、1∶10、1∶12進(jìn)行正交試驗考察。

2.2.3 超聲提取次數(shù) 精密稱取藥材粉末1.0 g，在料液比為1∶10、乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%、超聲提取時間為20 min的條件下逐次提取，結(jié)果見圖2C。

由圖2C可見，提取3次后已提取總綠原酸96%的量，故選擇提取次數(shù)為1、2、3次進(jìn)行正交試驗考察。

2.2.4 超聲提取時間 精密稱取藥材粉末1.0 g，在料液比為1∶10、乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%的條件下，分別超聲提取10、20、30、40、50 min，結(jié)果見圖2D。

由圖2D可見，隨著超聲提取時間延長，綠原酸含量呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢；提取30 min后，綠原酸含量不再增加。因此，選擇超聲提取時間為20、30、40 min進(jìn)行正交試驗考察。

2.3 正交試驗優(yōu)化綠原酸提取工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以綠原酸含量為指標(biāo)，對乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲提取次數(shù)（C）、超聲提取時間（D）4個因素進(jìn)行考察，各因素均確定3個水平。因素與水平見表1；L9（34）正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis results

由表2可知，影響因素主次順序為C＞A＞B＞D。由表3可知，對杏花中綠原酸的提取，提取次數(shù)影響極顯著（P＜0.01），乙醇體積分?jǐn)?shù)影響顯著（P＜0.05），料液比及超聲提取時間無顯著影響。對因素C，雖然C3大于C2，但其差值較小，故從工業(yè)生產(chǎn)的角度考慮選擇C2。綜合考慮極差分析和方差分析結(jié)果，優(yōu)化出超聲波輔助乙醇提取綠原酸的工藝為A2B3C2D2，即用12倍量75%乙醇，超聲提取2次，每次30 min。

按上述最優(yōu)工藝，精密稱取同一產(chǎn)地的藥材粉末3份，每份100 g，加1 200 mL 75%乙醇，超聲提取2次，每次30 min。結(jié)果，3次試驗中綠原酸含量平均值為77.38 mg/g（RSD＝0.58%，n＝3）。此結(jié)果優(yōu)于正交試驗中各方案結(jié)果，提示該綠原酸提取工藝合理、可行。

2.4 不同產(chǎn)地杏花、山杏花中綠原酸含量的測定

分別取10個不同產(chǎn)地及品種藥材粉末各1.0 g，精密稱定，按照最優(yōu)提取工藝提取后測定提取液中綠原酸的含量，結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地杏花、山杏花提取液中綠原酸含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 4 Determination results of chlorogenic acid content in extracts of P.armeniaca flos and A.sibirica flos from different origins（n＝3）

由表3可知，來自沽源、張家口市區(qū)、房山的山杏花中綠原酸含量為77.38～83.33 mg/g，其他產(chǎn)地的杏花中綠原酸含量為63.12～70.22 mg/g。山杏花中的綠原酸含量較杏花更高，同一品種不同產(chǎn)地杏花中綠原酸含量差異不大。

3 討論

筆者在預(yù)試驗中考察了藥材粉碎粒度對提取工藝的影響，結(jié)果顯示藥材粉碎成中粉時所得綠原酸含量最大。另外還在預(yù)試驗中進(jìn)行了檢測波長和流動相系統(tǒng)及比例的篩選，最后確定檢測波長為325 nm、流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（9∶91）時綠原酸峰形較好且保留時間較適中。

正交試驗結(jié)果顯示，提取2次后綠原酸的含量約為提取1次的1.6倍。方差分析表明，提取次數(shù)（因素C）的F為475.06，大于99.00，表明C因素有顯著影響。表2雖顯示C3結(jié)果高于C2，但增加量僅約占C2的0.7%，即2次提取后已將綠原酸基本提取完全，而多提取1次需要消耗更多的溶劑及能源，因此，從節(jié)約能源、環(huán)保等角度考慮，提取次數(shù)選擇2次。

綠原酸是金銀花主要有效成分之一，其在金銀花中的含量為2.227%～2.931%，而在山銀花中的含量為3.309%～5.657%[10]；另外，綠原酸在杜仲葉中含量也較高，據(jù)報道，在年周期中，7月份藥材含量最高（可達(dá)3.1%），11月份藥材最低（1.4%）[11]，表明其在不同生長時期含量也不同。本文建立的提取工藝，所得山杏花中綠原酸含量為7.738%～8.333%，杏花中含量為6.312%～7.022%，含量均較上述文獻(xiàn)報道的藥材高，故二者可為綠原酸提取的藥材資源。另外，本試驗優(yōu)化的提取工藝高效便捷、快速環(huán)保、合理可行、結(jié)果穩(wěn)定，且所需設(shè)備簡單、操作性強(qiáng)，檢測手段也較為常用，適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，可為今后充分利用杏花資源提供理論依據(jù)。

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Optimization of the Extraction Technology of Chlorogenic Acid in Prunus armeniaca Flos and Comparison of Its Contents from Different Origins and Varieties

LUO Huiyu1，2，YAN Weiwei1，2，XU Peng1，ZENG Chunping1（1.Zhangjiakou Food and Drug Inspection Center，Hebei Zhangjiakou 075000，China；2.School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of chlorogenic acid in Prunus armeniaca flos，and compare the contents in P.armeniaca flos from different origins and varieties.METHODS：HPLC was conducted to determine the content of chlorogenic acid in P.armeniaca flos；using the volume fraction of ethanol，the ratio of material to liquid，ultrasonic extraction times and time as factor，the content of chlorogenic acid as index，single factor and orthogonal test were designed to optimize the extraction technology，and verification tests were carried out.The optimized extraction technology was used to extract and compare the contents of chlorogenic acid in Armeniaca sibirica from 7 origins of P.armeniaca flos and 3 origins of Armeniaca sibirica flos. RESULTS：The optimized extraction technology was extracting twice with 12-fold 75%ethanol，30 min each time.Under the conditions，the content of chlorogenic acid can reach 77.38 mg/g（RSD＝0.58%，n＝3）；the contents of chlorogenic acid in A.sibirica flos and P.armeniaca flos were 77.38-83.33 mg/g and 63.12-70.22 mg/g，respectively.CONCLUSIONS：The established extraction technology is reasonable，stable and feasible.The contents of chlorogenic acid in A.sibirica are higher than that in P.armeniaca flos；the contents have no obvious differences in the same variety of A.sibirica from different origins.

Prunus armeniaca flos；Chlorogenic acid；Orthogonal test；Extraction technology；Optimization；Origin；Variety

R284.2

A

1001-0408（2017）07-0975-04

2016-06-19

2016-07-24）（編輯：劉 萍）

＊主管藥師。研究方向：中藥材有效成分的提取與測定。電話：0313-4061038-815。E-mail：904266340@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.32