獨活腸吸收液對大鼠離體胸主動脈張力的影響?

黃 穎，吳宏偉，王燕平

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700; 3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700)

獨活腸吸收液對大鼠離體胸主動脈張力的影響?

黃 穎1，吳宏偉2，王燕平3△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700; 3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700)

目的:觀察獨活腸吸收液對大鼠離體胸主動脈環(huán)的舒張作用及其舒張機制。方法:應(yīng)用外翻腸囊法制備獨活含藥腸吸收液，采用離體血管環(huán)技術(shù)制備大鼠胸主動脈環(huán)，使用累積加藥法分別檢測獨活腸吸收液對PE、KCl刺激的內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮胸主動脈環(huán)張力的影響，并探討其Ca2+調(diào)節(jié)機制。結(jié)果:獨活腸吸收液能夠濃度依賴性地舒張PE、KCl引起的內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管環(huán)收縮，內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組最大舒張率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對PE或KCL預(yù)收縮的血管，獨活腸吸收液均能抑制CaCl2所致最大收縮效應(yīng)。結(jié)論:獨活腸吸收液對PE、KCl引起的血管收縮均具有較好的舒張作用并呈劑量依賴性，其作用機制與抑制細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流密切相關(guān)。

獨活;腸吸收液;血管舒張;機制

中藥獨活為傘形科植物當(dāng)歸屬重齒毛當(dāng)歸(Angelica pubescens Maxim.f.shanet Yucm)的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，其味辛、苦、微溫，歸腎、膀胱經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛的功效，是傳統(tǒng)臨床治療風(fēng)濕痹痛的要藥。現(xiàn)代藥理研究表明，獨活具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠的作用，能治療胃潰瘍、抗血管生成、抑菌、抗氧化［1－4］。在心腦血管方面有降壓和抗心律抗心律失常作用，能抗血小板聚集和抑制血栓形成［5－6］。

本課題組在以往對傘形科辛味中藥研究中發(fā)現(xiàn)，獨活主要活性成分蛇床子素、歐前胡素等均對離體血管具有舒張作用［7］。因此本研究采用“外翻腸囊－體外活性”的方法制作獨活腸吸收液，考察獨活被生物體吸收的有效成分對離體血管作用，明確獨活的藥理作用，為進一步擴大獨活的臨床應(yīng)用范圍提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(合格證號SCXK(京)2012－0001)。

1.2 試劑

Krebs－Henseleit(K－H)液配方:NaCl 118.96 mmol/L，KCl 4.73 mmol/L，KH2P041.17 mmol/L，MgSO41.17 mmol/L，NaHCO325.0 mmol/L，CaCl22.54 mmol/L;葡萄糖11.1 mmol/L，以上試劑為分析純，均購自Alfa Aesar公司。苯腎上腺素、乙酰膽堿購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 儀器

Biopac MP150多導(dǎo)生理記錄儀，美國BIOPAC公司生產(chǎn);Radnoti離體組織灌流系統(tǒng)，美國Radnoti公司生產(chǎn)。

1.4 藥物

獨活藥材購自北京同仁堂藥店，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所何希榮主管藥師鑒定為傘形科當(dāng)歸屬植物重齒毛當(dāng)歸的干燥根。

2 方法

2.1 獨活腸吸收液的制備

將獨活用清水洗凈置于70℃烘箱中烘干。將烘干的獨活打成粗粉，稱取粉末100 g，加5倍量95%乙醇500 ml浸泡1 h回流2次，每次提取1 h，趁熱過濾，合并濾液，40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，減壓干燥得獨活提取物。使用前用臺氏液將獨活提取物超聲溶解、過濾，制成質(zhì)量濃度為1.28 g生藥· mL－1的供試液。

將實驗前禁食12 h的大鼠稱重后，斷頸椎處死，沿腹中線和腹白線分別剪開皮膚與肌肉，迅速取出小腸，自胃幽門以下10 cm開始向下量取14 cm為腸段一，間隔10 cm量取14 cm為腸段二，再間隔10 cm量取14 cm為腸段三，從回盲瓣以上5 cm開始向上取14 cm為腸段四。將剪下的腸管放入0℃臺氏液中沖洗至無腸內(nèi)容物為止。將自制硅膠套管軟端插入腸管用絲線結(jié)扎，小心將腸道翻轉(zhuǎn)。用0℃臺氏液沖洗內(nèi)表面，將另一端用絲線結(jié)扎成囊狀。麥?zhǔn)显」苤蓄A(yù)先加入上述獨活供試液25 mL，通入混合氣體(95%O2，5%CO2)，保持37℃恒溫。在腸管中注入臺氏液2 mL放入麥?zhǔn)显」苤校?0 min取樣400 μL，同時補充等體積的37℃臺氏液。樣品放入干凈的離心管中，合并后于－80℃密封直立保存。

2.2 大鼠胸主動脈環(huán)制備

2.2.1 內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)制備方法 大鼠頸部脫臼，剪開胸腔迅速取出胸主動脈條，放置于4℃ K－H液中，小心剝?nèi)ジ皆谛刂鲃用}上的脂肪及結(jié)締組織，橫切成2～3 mm長的血管環(huán)。將血管環(huán)懸掛于預(yù)置5 mlK－H液的浴槽中，溫度(37.0± 0.2)℃恒定，持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體。標(biāo)本的一端固定，另一端經(jīng)張力換能器連接Radnoti離體組織灌流系統(tǒng)，記錄實驗過程中張力的變化。穩(wěn)定過程先以0 g張力開始，維持30 min后調(diào)節(jié)其基礎(chǔ)張力至1 g，平衡1 h，期間每隔15 min更換1次K－H液。主動脈環(huán)穩(wěn)定后用KCl(60 mM)刺激，以激發(fā)最大收縮，待收縮幅度穩(wěn)定后用K－H液洗脫。

2.2.2 去內(nèi)皮胸主動脈環(huán)制備方法 采用機械去內(nèi)皮方法去除血管內(nèi)皮，并檢測內(nèi)皮完整性。用終濃度1 μM的苯腎上腺素(PE)收縮血管環(huán)達(dá)到峰值，加入依濃度梯度10－9～10－5乙酰膽堿，給藥時間間隔為3 min。至加入10－5乙酰膽堿后，血管舒張達(dá)到70%以上為內(nèi)皮完整。舒張率＜10%的認(rèn)定為內(nèi)皮去除。

2.3 獨活腸吸收液對大鼠離體胸主動脈環(huán)張力的測定

2.3.1 對PE引起的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)張力的影響 血管環(huán)用K－H液清洗數(shù)次，使其保持基礎(chǔ)張力。以PE(1 μM)誘發(fā)最大收縮幅度為100%，主動脈環(huán)穩(wěn)定后，采用累積加樣法在浴槽中加入腸吸收液，累計依次加樣至 25 μl、50 μl、100 μl、200 μl，每10 min加入1次。以加入受試藥物后的血管張力變化幅度與KCl誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率作血管舒張反應(yīng)的量－效曲線;藥物引起的收縮幅度均以第2次KCl(60 mM)引起的最大收縮幅度為相對標(biāo)準(zhǔn)值，用百分比表示。

2.3.2 對KCl引起的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)張力的影響 實驗方法同上，以KCl(60mM)誘發(fā)最大收縮幅度。

2.4 獨活腸吸收液舒張血管作用的Ca2+介導(dǎo)機制

2.4.1 抑制PE引起的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)收縮的Ca2+介導(dǎo)機制 將內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮的血管環(huán)置于無Ca2+的K－H液中平衡1 h，其間每隔20 min換液1次。以獨活腸吸收液孵育血管環(huán)10 min，再以1 μM的PE使收縮達(dá)最大峰值后，每隔5 min依濃度梯度加入CaCl2(1×10－7～1×10－4mol·L－1)，觀察血管收縮反應(yīng)。對照組為同一大鼠未經(jīng)獨活腸吸收液孵育的主動脈環(huán)。

2.4.2 抑制KCl引起的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)收縮的 Ca2+介導(dǎo)機制 實驗方法同上，以60mM的KCL使收縮達(dá)最大峰值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)采用Student’st test進行統(tǒng)計，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對PE引起的內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管環(huán)張力的影響

表1圖1、2顯示，獨活腸吸收液能夠濃度依賴性舒張PE引起的內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管環(huán)收縮，內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組最大舒張率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 對PE引起內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張作用

圖1 獨活腸吸收液對PE引起的內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張作用

圖2 獨活腸吸收液對PE引起的內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張實驗過程圖

3.2 對KCl引起的內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管環(huán)張力的影響

表2圖3、4顯示，獨活腸吸收液能夠濃度依賴性舒張KCl引起的內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管環(huán)收縮，內(nèi)皮完整組與去內(nèi)皮組最大舒張率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 對KCl引起的內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張作用

圖3 獨活腸吸收液對KCl引起的內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張作用

3.3 抑制PE引起的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)收縮的Ca2+介導(dǎo)機制

表3圖5、6顯示，在無Ca2+的K－H液中，預(yù)先以60mM的KCL或1μM的PE收縮血管產(chǎn)生微弱持續(xù)的收縮，由 CaCl2(1×10－7～1×10－4mo1· L－1)刺激后收縮力顯著升高，呈劑量依賴性。經(jīng)獨活腸吸收液孵育后，CaCl2所致最大收縮效應(yīng)顯著減弱(P＜0.01)。

圖4 獨活腸吸收液對KCl引起的內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮血管環(huán)舒張實驗過程圖

表3 對PE引起的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)最大收縮力影響

3.4 抑制KCl引起的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)收縮的Ca2+介導(dǎo)機制

表4圖7、8顯示，在無Ca2+的K－H液中，預(yù)先以60mM的KCL或1μM的PE收縮血管產(chǎn)生微弱持續(xù)的收縮，由 CaCl2(1×10－7～1×10－4mo1· L－1)刺激后收縮力顯著升高，呈劑量依賴性。經(jīng)獨活腸吸收液孵育后，CaCl2所致最大收縮效應(yīng)顯著減弱(P＜0.01)。

表4 對KCl引起的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)最大收縮力影響

4 討論

口服給藥是最常用的臨床給藥途徑之一。小腸是藥物吸收的主要部位，藥物口服吸收的程度與速度主要取決于腸內(nèi)酶及其細(xì)胞對藥物的代謝和屏障作用。外翻腸囊法又稱腸外翻法，它是由Wilson和Wiseman于1954年創(chuàng)建，最早用于研究葡萄糖和氨基酸在腸道的代謝和轉(zhuǎn)運［8］。這種模型已成功地應(yīng)用于藥物在腸道的吸收、轉(zhuǎn)運、代謝等方面，是一種能夠快速反應(yīng)藥物吸收行為的體外方法。本研究采用獨活腸吸收液方法與臨床用藥吸收途徑更為相符，能夠反映獨活被生物體吸收的有效成分的作用及機制。

血管平滑肌舒張主要有兩種方式，一種是內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)(endothelium－dependent dilatation，EDD)，指血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)在藥物或生理性刺激的作用下釋放內(nèi)皮舒張因子，誘導(dǎo)血管產(chǎn)生舒張作用，它依賴于結(jié)構(gòu)完整和功能正常的血管內(nèi)皮，VEC主要分泌的血管舒張因子是由前列環(huán)素(PGI2)、一氧化氮(NO)及內(nèi)皮依賴性超極化因子(DEHF)共同作用完成;另一種非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)(endothelium－independent dilatation，EID)，是不依賴于血管內(nèi)皮而直接作用于血管平滑肌導(dǎo)致血管舒張。血管平滑肌上的電壓依賴性鈣通道和受體操縱性鈣通道均對平滑肌活動起重要影響［9］。

圖5 對PE引起的內(nèi)皮完整(左)和去內(nèi)皮(右)血管環(huán)最大收縮力影響

圖6 獨活腸吸收液對CaCl2收縮內(nèi)皮完整(左)和去內(nèi)皮(右)血管環(huán)的實驗過程圖

圖7 對KCl引起的內(nèi)皮完整(左)和去內(nèi)皮(右)血管環(huán)最大收縮力影響

圖8 獨活腸吸收液對CaCl2收縮內(nèi)皮完整(左)和去內(nèi)皮(右)血管環(huán)的實驗過程圖

本研究結(jié)果顯示，獨活腸吸收液對kcl、PE引起的血管收縮具有較好的舒張作用并呈劑量依賴性，提示獨活腸吸收液對血管舒張作用主要通過非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)實現(xiàn)，其直接作用于血管平滑肌而導(dǎo)致血管舒張。

血管是由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度是血管收縮過程中的重要因素。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高至一定水平，Ca2+與鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合，激活肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)，肌球蛋白輕鏈磷酸化，肌球蛋白與肌動蛋白結(jié)合，使血管收縮。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低至一定水平，Ca2+與CaM分離，MLCK失活，血管松弛。而血管平滑肌細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流是引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高的主要原因之一。細(xì)胞外高kcl可以激活電壓依賴性鈣通道，導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流而引起動脈環(huán)收縮。PE誘導(dǎo)的血管收縮，一方面通過作用于α1腎上腺素受體，激活磷脂酶C，產(chǎn)生三磷酸肌醇，刺激平滑肌細(xì)胞內(nèi)貯鈣的釋放;另一方面，通過激活細(xì)胞膜上的受體操縱性鈣通道和磷酸化電壓依賴性鈣通道使細(xì)胞外鈣內(nèi)流，因此PE通過細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的增加而使血管收縮［10］。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮完整及去內(nèi)皮的血管環(huán)經(jīng)獨活腸吸收液孵育后，都能明顯抑制CaCl2引起的收縮，提示獨活腸吸收液能通過抑制細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，產(chǎn)生舒張血管效應(yīng)。

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Effect of Intestinal Absorption Solution of Angelica Pubescens on the Tension of Rat Thoracic Aortic

HUANG ying1，WU hong－wei2，WANG yan－ping3△
(1．Experimental Research center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2．Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;
3．Institute of Basic Research in Clinical Medicine，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Objective:To observe the vasodilatation effect of intestinal absorption solution of Angelica Pubescens on thoracic aorta and its related mechanism.Methods:Intestinal absorption solution of Angelica Pubescens was prepared by everted gut sac method in vitro.To investigate the influence and the calcium－related mechanisms of intestinal absorption solution of Angelica Pubescens on endothelium intact or endothelium denuded with PE and KCl.Results:Intestinal absorption solution of Angelica Pubescens could produce relaxation of thoracic aortic rings pre－contracted by PE and KCl with endothelium intact or denuded in a dose dependent manner.There was no significant difference between the endothelium intact group and the endothelium denuded group.Intestinal absorption solution of Angelica Pubescens inhibit CaCl2－induced maximum contraction effect.Conclusion:Intestinal absorption solution of Angelica Pubescens shows vasodilator effects on a dose－dependent manner.The vasodilatation effect is mediated by inhibition of extracellular Ca2+influx.

Angelica Pubescens;Intestinal Absorption Solution;Vasodilation;Mechanism

R285.5

B

1006－3250(2017)02－0187－04

2016－07－13

國家自然科學(xué)基金資助項目(81273901)－傘形科常用辛味中藥的成分組合與活血功效關(guān)聯(lián)性研究

黃 穎(1978－)，女，甘肅人，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥及復(fù)方作用機理研究。

△通訊作者:王燕平(1963－)，男，研究員，醫(yī)學(xué)本科，從事中醫(yī)管理與科學(xué)研究、中醫(yī)養(yǎng)生保健理論與方法及傳染病中醫(yī)藥防治研究。