HPLC測定奧貝膽酸片含量

陸云霞，潘星燕，姚 軍,2

(1.河北科技大學化學與制藥工程學院，河北石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，河北石家莊 050018)

HPLC測定奧貝膽酸片含量

陸云霞1，潘星燕1，姚 軍1,2

(1.河北科技大學化學與制藥工程學院，河北石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，河北石家莊 050018)

為建立HPLC-UV測定奧貝膽酸片含量的方法，采用高效液相色譜法及紫外檢測器，色譜柱為Agilent HC-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(含0.02% (體積分數) 甲酸)-水(含0.02% (體積分數) 甲酸)，二者體積比為60∶40，以1.0 mL/min的流速進行洗脫，檢測波長為195 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為100 μL。結果表明：奧貝膽酸質量濃度在0.200 26～1.001 30 mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，相關系數r=0.999 9；中間精密度、穩定性、重復性試驗的RSD值不超過1.0%；平均回收率為99.64%，RSD值為0.58%(n=9)。該方法簡便、專屬性好、精密度高、耐用性良好，可用于奧貝膽酸片含量的測定。

藥物化學；色譜分析；奧貝膽酸；高效液相色譜法；紫外檢測器；含量測定

奧貝膽酸(obeticholic acid，OCA)是美國Intercept公司研發的首個用于治療膽汁淤積性肝病的藥物[1-2]，化學結構式見圖1[3]，主要用于治療原發性膽汁性肝硬化(PBC)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，對高血壓和Ⅱ型糖尿病也有一定的療效[4-5]。因其臨床效果顯著，獲得了加速審批和優先審批[2]，并于2016年5月在美國批準上市，目前中國并未有奧貝膽酸質量控制方面的研究報道。

圖1 奧貝膽酸化學結構Fig.1 Chemical structure of obeticholic acid

近年來，NAFLD和PBC發病率增高并趨向低齡化， NAFLD在中國的患病率在15%左右，已經成為危害人們健康的第二大肝病。FDA批準的藥物熊去氧膽酸(UDCA)的臨床治療效果并不理想，作為唯一可能對PBC有效的藥物，仍有30%～50%的患者對其治療反應不良[6-11]。對于NAFLD而言，目前尚未有特效的治療制劑。奧貝膽酸可以聯合UDCA治療PBC，尤其是作用于對UDCA應答不良或單獨用藥對UDCA不耐受的成年患者，可能會成為20余年來治療PBC的首選新方法[1-2]。

圖2 奧貝膽酸全波長掃描圖譜Fig.2 Full-wavelength scanning of obeticholic acid

根據對奧貝膽酸的全波長掃描發現其具有末端吸收，全波長掃描圖譜見圖2。參考《中華人民共和國藥典》2015年版二部，環磷酰胺片等劑型的檢測波長均為195 nm[12]，本文建立奧貝膽酸的HPLC-UV法也將采用195 nm作為檢測波長，考慮到實驗進行過程中產生的干擾，在方法學驗證之前進行了大量的預實驗來排除實驗中可能產生的干擾，能夠實現主峰與輔料峰的良好分離。所建立的HPLC-UV法，不僅專屬性良好、重復性高、操作簡便，方便用于奧貝膽酸片的質量控制，而且能夠在基層得到推廣應用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀，包括紫外檢測器、Empower色譜工作站；XA105U型電子天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司提供)；L400型醫用離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司提供)。

1.2 藥品與試劑

奧貝膽酸對照品(自制，批號為20151201，質量分數為99.82%)；奧貝膽酸片(自制，批號為20160501，20160502，20160503，規格為5 mg /片)；乙腈，色譜純(珠海市格特生物科技有限公司提供)；甲酸，色譜純(德國默克公司提供)；水為自制三蒸水。

2 方法與結果[13-15]

2.1 色譜條件

圖3 高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms

色譜柱：Agilent HC-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(含0.02%(體積分數)甲酸)-水(含0.02%(體積分數)甲酸)，二者體積比為60∶40；流速：1.0 mL/min；檢測波長：195 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：100 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液

取本品20片(約4 167.08 mg)，研細，精密稱取細粉適量(約相當于10 mg的奧貝膽酸)置于20 mL量瓶中，加入乙腈-水(二者體積比為70∶30)振搖，使奧貝膽酸充分溶解，搖勻，超聲，離心(4 500 r/min，5 min)，取上層清液適量，過濾后作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液

取奧貝膽酸對照品適量，精密稱定，加入乙腈-水(二者體積比為70∶30)溶解并定量稀釋成1 mL中約含0.5 mg奧貝膽酸的溶液。

2.2.3 空白樣品溶液

取處方量不含奧貝膽酸的空白樣品，按“2.2.1”項下的方法制備，即得空白樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

取“2.2”項下供試品溶液、對照品溶液、空白樣品溶液各100 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖3。由圖3可以看出，供試品溶液與對照品溶液色譜圖中主峰保留時間一致，而空白樣品溶液中無此峰，表明空白樣品溶液對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

精密稱取奧貝膽酸對照品100.13 mg，置于50 mL量瓶中，加入乙腈-水(二者體積比為70∶30)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取上述儲備液各1.0，2.0，5.0，2.0，5.0 mL，分別置于10，10，20，5，10 mL量瓶中，加入乙腈-水(二者體積比為70∶30)稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度(ρ，mg/mL)為橫坐標、峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，得到奧貝膽酸的回歸線性方程為A=5 441 128ρ+11 275(r=0.999 9)。結果表明，在0.200 26～1.001 30mg/mL范圍內，奧貝膽酸質量濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 重復性試驗

按“2.2”項下供試品溶液和對照品溶液的方法分別配制，按“2.1”項下色譜條件，將供試品溶液連續進樣6份，記錄峰面積并計算結果。結果顯示，奧貝膽酸含量的RSD值為0.68%，表明該方法的重復性良好。

2.6 中間精密度試驗

由不同人員在不同日期測定含量樣品，按“2.2”項下供試品溶液和對照品溶液的方法分別配制，按“2.1”項下色譜條件將供試品溶液連續進樣6份，記錄峰面積并計算結果。結果顯示，奧貝膽酸含量的RSD值為0.53%，表明該方法的中間精密度良好。

2.7 穩定性試驗

室溫條件下將供試品溶液分別在0，2，4，8，12，24h，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結果顯示，奧貝膽酸峰面積的RSD值為0.81%，表明供試品溶液在24h內的穩定性良好。

2.8 回收率試驗

精密稱取奧貝膽酸對照品100.74mg，置于20mL容量瓶中，加乙腈-水(二者體積比為70∶30)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取儲備液1.0mL，置于10mL容量瓶中，加入乙腈-水(二者體積比為70∶30)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。稱取處方量的空白輔料9份，精密加入一定量的奧貝膽酸儲備液，按“2.2.1”項下方法分別制備回收率為80%，100%和120%的樣品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算回收率，結果見表1。

表1 回收率實驗結果(n=9)

2.9 樣品含量測定

各取中試3批樣品適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結果見表2。

3 討 論

3.1 溶劑的選擇

表2 樣品含量測定結果(n=3)

本研究發現，奧貝膽酸在水中幾乎不溶、在乙腈中微溶、在甲醇中易溶。根據奧貝膽酸的溶解性、檢測波長以及流動相的配比，以不同比例的上述溶劑與水作為溶劑。通過比較發現：乙腈與水的體積比小于70∶30時，溶解時間逐漸增加；乙腈與水的體積比大于70∶30時樣品溶解時間短，但對樣品的出峰有影響。故采用體積比為70∶30的乙腈-水作為溶劑。

3.2 檢測波長的選擇

研究發現，奧貝膽酸對照品溶液在195 nm處有最大吸收。空白樣品溶液雖在195 nm處也有吸收，但本方法能夠實現主峰與輔料峰的良好分離，故選擇195 nm作為本研究的檢測波長。參考《中華人民共和國藥典》2015年版二部中環磷酰胺片等劑型的檢測波長均為195 nm，因此本文建立奧貝膽酸的HPLC-UV法采用195 nm作為檢測波長是合理的[12]。

3.3 流動相的選擇[13-21]

分別比較了乙腈-水、乙腈-磷酸、乙腈-磷酸氫二鉀等不同的流動相系統。例如：0.001 mol/L磷酸氫二鉀溶液(用磷酸調節pH值至2.6)-90%(體積分數)乙腈(二者體積比為45∶55)、乙腈(含0.02%(體積分數)磷酸)-水(含0.02%(體積分數)磷酸)(二者體積比為70∶30)、乙腈(含0.02%(體積分數)甲酸)-水(含0.02%(體積分數)甲酸)(二者體積比為60∶40)等作為流動相。結果發現：采用乙腈-磷酸、乙腈-磷酸氫二鉀等流動相系統時，樣品與相鄰雜質以及輔料峰之間的分離不好，且峰形不佳；而以乙腈(含0.02%(體積分數)甲酸)-水(含0.02%(體積分數)甲酸)(二者體積比為60∶40)作為流動相的分離效果較好，能得到良好的峰形，故選擇其作為本研究的流動相。

4 結 語

HPLC法廣泛用于各種藥品的檢測，是應用最為廣泛的檢測方法。本研究采用HPLC-UV法測定奧貝膽酸片的含量，解決了液質聯用(HPLC-MS)、超高液相色譜(UPLC)、蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)等檢測方法因操作繁瑣、價格偏高而導致基層難以推廣的難題[7]。采用HPLC-UV法測定奧貝膽酸含量，方法簡便、專屬性良好、重復性高，能夠為奧貝膽酸片的質量控制提供參考。

/References:

[1] 朱士超, 鄭學敏, 張玥, 等. 法尼醇X受體激動劑奧貝膽酸[J]. 現代藥物與臨床, 2016, 31(3): 396-400. ZHU Shichao, ZHENG Xuemin, ZHANG Yue, et al. A farnesoid X receptor agonist: Obeticholic acid[J]. Drugs & Clinc, 2016, 31(3): 396-400.

[2] 湯森路透. 2016年最具市場前景的藥物預測[J]. 藥學進展, 2016, 40(3): 235-240. THOMSON Reuters. Drugs to watch in 2016[J]. Progress in Pharmaceutical Sciences, 2016, 40(3): 235-240.

[3] 邱玥珩, 曹忠誠, 強曉明, 等. 奧貝膽酸及其有關物質的合成[J]. 中國醫藥工業雜志, 2016, 47(4): 376-379. QIU Yueheng, CAO Zhongcheng, QIANG Xiaoming, et al. Synthesis of obeticholic acid and its related substances[J]. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 2016，47(4): 376-379.

[4] 張柳, 牛尚梅, 馬慧娟. 膽汁酸與代謝綜合征的研究進展[J]. 醫藥綜述, 2016, 22(5): 964-967. ZHANG Liu, NIU Shangmei, MA Huijuan. The progress of bile acid and metabolic syndrome[J]. Medical Recapitulate, 2016, 22(5): 964-967.

[5] 陸倫根, 曾民德. 膽汁淤積和自身免疫性肝病[M]. 北京: 人民衛生出版社, 2014.

[6] 李艷梅, 王綺夏, 馬雄. 原發性膽汁性膽管炎的治療進展[J]. 臨床肝膽病雜志, 2016,32(8): 1491-1496. LI Yanmei, WANG Qixia, MA Xiong. Research advances in treatment of primary biliary cholangitis[J]. Journal of Clinical Hepatology, 2016, 32(8): 1491-1496.

[7] 彭燦, 呂蒙瑩, 李耕, 等. 牛黃及其代用品膽酸類物質分析方法研究進展[J]. 中草藥, 2013,44(5): 632-636. PENG Can, LYU Mengying, LI Geng, et al. Research progress in analytical methods of cholic acids in Bovis Calculus and its substitutes[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2013,44(5): 632-636.

[8] 陸妙. RP-HPLC法測定熊去氧膽酸膠囊中熊去氧膽酸的含量[J]. 中國藥房, 2008, 19(30): 2384-2385. LU Miao. RP-HPLC method for the determination of ursodeoxycholic acid in ursodeoxycholic acid capsule[J]. Chinese Pharmacy, 2008, 19(30): 2384-2385.

[9] 唐元軍, 陳育琳, 陳慶輝. HPLC-ELSD法同時測定豬膽粉中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2011, 21(6): 651-653. TANG Yuanjun, CHEN Yulin, CHEN Qinghui. Simulatneous determination of hyodeoxycholic acid and chenodeoxycholic acid in suis fellis pulvis by HPLC-ELSD[J]. Traditional Chinese Drug Research & Clinical Pharmacology, 2011, 21(6): 651-653.

[10]何姣, 李靜, 朱砂, 等. RP-HPLC法同時測定豬膽粉藥材中3種牛磺結合型膽酸的含量[J]. 藥物分析雜志, 2012, 32(2): 229-232. HE Jiao, LI Jing, ZHU Sha, et al. RP-HPLC simultaneous determination of three tauro-conjugated cholia acids in pulvis fellis suis[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2012, 32(2): 229-232.

[11]趙靜, 管璐晗, 祝連彩. HPLC-ELSD法同時測定生物轉化樣品中牛磺熊去氧膽酸等5種成分的含量[J]. 中國藥房, 2014, 25(45): 4291-4293. ZHAO Jing, GUAN Luhan, ZHU Liancai. Simultaneous content determination of 5 components as tauroursodeoxycholic acid in biotransformation samples by HPLC-ELSD[J]. Chinese Pharmacy, 2014, 25(45): 4291-4293.

[12]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社, 2015.

[13]施泰納, 維納倫德普爾森, 喬利博瓦, 等. 奧貝膽酸的制備、用途和固體形式[P]. 中國專利：201380043964.8, 2013-06-17.

[14]戎欣玉, 高倩, 陳濤, 等. 阿奇霉素納米晶體片劑的制備及其質量評價[J]. 河北科技大學學報, 2015, 36(6): 606-612. RONG Xinyu, GAO Qian, CHEN Tao, et al. Preparation and evaluation of tablets of azithromycin nanocrystals[J]. Journal of Hebei University of Science and Technology, 2015, 36(6): 606-612.

[15]哈婧, 劉曉爭. RP-HPLC法測定左旋苯甘氨酸乙基鄧鉀鹽的含量[J]. 河北工業科技, 2011, 28(5): 288-290. HA Jing, LIU Xiaozheng. Determination of content of RP-HPLCl-glycine ethyl benzene Deng sylvite[J]. Hebei Journal of Industrial Science and Techology, 2011, 28(5): 288-290.

[16]陳菲, 龍海林, 雷海民, 等. HPLC測定復方熊膽膠囊中牛磺熊去氧膽酸的含量[J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(5): 838-840. CHEN Fei, LONG Hailin, LEI Haimin, et al. Determination of tauroursodeoxycholic acid in compound bile capsule by HPLC[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2014, 39(5): 838-840.

[17]陳悅, 王靜, 陳劍鋒. HPLC同時測定豬膽汁水解產物中豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2014, 20(19): 61-63. CHEN Yue, WANG Jing, CHEN Jianfeng. Determination of contents of hyodeoxycholia acid and chenodeoxycholic acid in hydrolysate of fel suillus by HPLC[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2014, 20(19): 61-63.

[18]張曉艷, 崔蕊, 賈建靜, 等. HPLC測定牛磺熊去氧膽酸膠囊中的有關物質[J]. 華西藥學雜志, 2012, 27(5): 585-587. ZHANG Xiaoyan, CUI Rui, JIA Jianjing, et al. Determination of related substances in tauroursdeoxycholia acid capsule by HPLC[J]. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2012, 27(5): 585-587.

[19]潘星燕，陸云霞，姚軍.高效液相色譜法測定芒柄花素磺酸鈉有關物質[J].河北科技大學學報,2017,38(1):32-38. PAN Xingyan, LU Yunxia, YAO Jun.Related substance determination of formononetin by HPLC[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2017,38(1):32-38.

[20]張燕, 佟愛東. 高效液相色譜法測定熊去氧膽酸片的含量[J]. 中國藥品標準, 2012, 13(5): 359-362. ZHANG Yan, TONG Aidong. HPLC determination of content of ursodeoxycholic acid tablets[J]. Drug Standards of China, 2012, 13(5): 359-362.

[21]甘勇強, 邱明明. HPLC法測定天黃猴棗散中膽酸、去氧膽酸的含量[J]. 中國藥師, 2013, 16(7): 1000-1001. GAN Yongqiang, QIU Mingming. Determination of cholic acid and deoxycholic acid in Tianhuang Houzao powders by HPLC[J]. China Pharmacist, 2013, 16(7): 1000-1001.

Content determination of obeticholic acid tablets by HPLC

LU Yunxia1， PAN Xingyan1， YAO Jun1,2

(1.School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China; 2.State Key Laboratory Breeding Base-Key Laboratory of Molecular Chemistry for Drug of Hebei Province, Shijiazhuang， Hebei 050018, China)

In order to establish a method for the content determination of obeticholic acid tablets, HPLC-UV method is adopted. The determination is performed on Agilent HC-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm) with mobile phase acetonitrile (0.02% formic acid)-water (0.02% formic acid) = 60∶40 (V/V) at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength is 195 nm, the column temperature is 30 ℃ and the volume is 100 μL. The result shows that there is a good liner relationship between the mass concentration of obeticholic acid in the range of 0.200 26～1.001 30 mg/mL and the peak area, andr=0.999 9. The RSD of precision, stability and reproducible tests are all less than 1.0%. The average recovery rate is 99.64%, and RSD is 0.58%(n=9). The method is simple, exclusive, accurate and durable, and can be used for the content determination of obeticholic acid tablets.

medicinal chemistry； chromatography； obeticholic acid； HPLC； ultraviolet detector； content determination

1008-1542(2017)02-0158-05

10.7535/hbkd.2017yx02009

2016-11-28；

2017-01-13；責任編輯：張士瑩

河北省人力資源和社會保障廳擇優資助項目(C201400317)

陸云霞(1991—)，女，河北定州人，碩士研究生，主要從事藥物分析方面的研究。

姚 軍教授。E-mail：twobright@163.com

R944.4

A

陸云霞，潘星燕，姚 軍.HPLC測定奧貝膽酸片含量[J].河北科技大學學報,2017,38(2):158-162. LU Yunxia，PAN Xingyan，

YAO Jun.Content determination of obeticholic acid tablets by HPLC[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2017,38(2):158-162.