金屬離子競爭結(jié)合鈣調(diào)素的電化學行為研究

崔 敏，任聚杰，李俊新

(河北科技大學理學院，河北石家莊 050018)

金屬離子競爭結(jié)合鈣調(diào)素的電化學行為研究

崔 敏，任聚杰，李俊新

(河北科技大學理學院，河北石家莊 050018)

為了探討金屬離子與Ca2+對鈣調(diào)素(CaM)的競爭結(jié)合作用，在pH值為6.5含2 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-的0.15 mol/L的NaCl溶液中，用交流阻抗法研究了金屬離子如Ca2+，Cd2+，Al3+，F(xiàn)e3+結(jié)合及競爭結(jié)合鈣調(diào)素的電化學行為。結(jié)果表明：金屬離子與CaM的結(jié)合能力可以通過溶液中[Fe(CN)6]3-/4-在鈣調(diào)素自組裝膜修飾金電極上的電化學反應電阻的變化來判斷，Ca2+，Cd2+和Al3+都能與CaM結(jié)合，F(xiàn)e3+不能與CaM結(jié)合，且Ca2+與CaM結(jié)合能力要比Al3+強；Ca2+在CaM上的結(jié)合位點與Cd2+相同，與Al3+不同。交流阻抗法為研究金屬離子與CaM的競爭結(jié)合行為提供了一個新方法。

電化學；自組裝膜；鈣調(diào)素；交流阻抗法；電化學反應電阻；構(gòu)象變化

鈣調(diào)素(CaM)是普遍存在于真核細胞中的多功能鈣依賴性調(diào)節(jié)蛋白，它由148個氨基酸組成，包括4個EF-手性區(qū)域，可以與4個Ca2+結(jié)合。鈣調(diào)素只有和Ca2+結(jié)合后才有活性，才能在生物體中發(fā)揮作用。CaM與Ca2+結(jié)合后形成Ca2+·CaM復合物，構(gòu)象發(fā)生變化，從而使CaM活化，活化的Ca2+·CaM復合物可以通過與靶酶作用方式調(diào)控代謝過程，參與很多生化反應，在生物體中發(fā)揮重要作用[1-5]。鑒于生命環(huán)境中同時存在許多金屬離子(如K+，Na+，Mg2+，Ca2+，Zn2+，Cu2+，F(xiàn)e3+)以及環(huán)境污染物(如Cd2+，Hg2+，Pb2+，Al3+等)浸入生物體，這些離子也可能會與CaM結(jié)合，與Ca2+產(chǎn)生競爭，影響CaM發(fā)揮作用。因此研究這些金屬離子與Ca2+的競爭結(jié)合作用具有重要的生物學意義。

關(guān)于離子的競爭行為在生物領(lǐng)域已有廣泛研究，但用電化學方法進行研究還鮮有報道[5-10]。由于低成本、高靈敏、易操作等優(yōu)點，電化學方法已成為環(huán)境及生物領(lǐng)域較受歡迎的分析手段之一[11-13]。通過研究生物分子如蛋白質(zhì)、酶、核糖核酸等修飾到電極上的電化學行為，可以模擬這些生物分子在生物體內(nèi)的電化學過程，從而了解它們在生物體內(nèi)的功能，揭示生物活動機理[14]。自組裝技術(shù)可以很方便地把含有—SH 基團的分子修飾在金電極表面[15-19]。CaM中存在—S—，—SH，—S—S—等鍵，可以直接鍵合到Au基底上形成自組裝修飾電極(CaM/Au)。在之前的工作中，筆者摸索了CaM在Au基底的成膜條件，討論了電極電勢、pH值對CaM/Au電化學行為的影響[20-22]。本研究利用交流阻抗方法研究了pH值為6.5的環(huán)境下，金屬離子Ca2+，Cd2+，Al3+和Fe3+與CaM 結(jié)合后的電化學行為，討論了這些離子與CaM的結(jié)合能力以及這些離子之間的競爭行為。

1 實驗部分

1.1 主要材料和儀器

CaM，由河北師范大學生命科學學院從土豆中提取、純化、脫鈣而得，分子質(zhì)量為16 670 D，質(zhì)量濃度為0.7 g/L；所有試劑均為分析純，水溶液均用二次水配制，pH值為 6.5。

圖1 擬合電路圖Fig.1 Fitting circuit diagram

本實驗采用常規(guī)的三電極體系，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，輔助電極為大面積的Pt片電極(S=1 cm2)，工作電極為CaM自組裝修飾的Au電極(CaM/Au電極，Φ=0.15 cm)或結(jié)合了金屬離子的CaM/Au電極；所有的電位均相對于SCE；電化學阻抗譜(EIS)是利用上海辰華公司生產(chǎn)的CHI 660D在開路電位下測定的，頻率范圍為0.03 Hz ～100 kHz，溶液為含2 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.15 mol/L NaCl溶液。擬合電路圖見圖1。

1.2 工作電極的制備

工作電極的制作采用滴涂法，即將0.7 g/L的CaM滴涂到處理好的Au電極上[23]，放進充滿N2氣的試管中，密封，在室溫下放置24 h，然后浸入0.15 mol/L的 NaCl溶液中8 h，制得CaM/Au電極備用。

將在含Mx+(Mx+代表Ca2+，Cd2+，Al3+和Fe3+)的溶液中浸泡足夠時間(1h)后的CaM/Au電極記作Mx+-CaM/Au電極(如Ca2+-CaM/Au，Al3+-CaM/Au等)，浸泡溶液含Mx+的濃度不同(分別為10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4mol/L)，得到的Mx+-CaM/Au電極含Mx+的量也不相同。將在含10-5mol/LCaCl2溶液浸泡1h得到的Ca2+-CaM/Au電極再在含10-5mol/LCd2+的溶液中浸泡1h，得到的電極記作Cd2+·Ca2+-CaM/Au；若再在含10-5mol/LAl3+的溶液中浸泡1h后，電極記作Al3+·Ca2+-CaM/Au。

圖2 Ca2+-CaM/Au的交流阻抗圖Fig.2 Nyquist plots for Ca2+-CaM/Au

2 結(jié)果與討論

2.1 Ca2+結(jié)合CaM/Au的電化學行為

電化學反應電阻(Rct) 可以反映電極表面的動力學性質(zhì)。圖2是在不同濃度的Ca2+溶液中浸泡得到的Ca2+-CaM/Au的交流阻抗圖，表1為[Fe(CN)6]3-/4-發(fā)生電化學反應的電阻Rct與浸泡溶液中Ca2+濃度的關(guān)系。從圖2及表1可以看出，在Ca2+-CaM/Au電極上的Rct明顯小于在CaM/Au電極上的Rct，而且隨著浸泡溶液中含Ca2+濃度的增大，Rct逐漸降低直到趨于平穩(wěn)。這是由于結(jié)合了Ca2+的CaM空間構(gòu)象會發(fā)生變化[24]，使得[Fe(CN)6]3-/4-更易接近Au基底發(fā)生氧化還原反應，從而減小了Rct。因此，通過Rct的減小可以判斷Ca2+與CaM的結(jié)合情況。剛開始在較稀溶液中浸泡時，Rct變化明顯，說明少量Ca2+結(jié)合到CaM/Au上就會使CaM空間構(gòu)象發(fā)生明顯的變化。隨著浸泡溶液中Ca2+的增加，結(jié)合的Ca2+也增加，CaM上的結(jié)合位點幾乎被Ca2+占據(jù)，達到飽和狀態(tài)，CaM空間構(gòu)象不再發(fā)生變化，致使Rct幾乎不變而趨于平穩(wěn)。

表1 CaM/Au在含不同濃度Ca2+溶液中浸泡后得到的Rct值

2.2Al3+結(jié)合CaM的電化學行為

圖3 Al3+-CaM/Au電極的交流阻抗圖 Fig.3 Nyquist plots for Al3+-CaM/Au

圖3是在含Al3+濃度不同的溶液中浸泡足夠長的時間后Al3+-CaM/Au的交流阻抗圖，表2顯示了Rct與溶液中Al3+濃度關(guān)系。從圖3、表2可以看出，與前面描述的結(jié)合Ca2+的Rct變化規(guī)律一樣，[Fe(CN)6]3-/4-在Al3+-CaM/Au電極上的Rct比在CaM/Au電極上的Rct要小，隨著浸泡溶液中Al3+的增多，在Al3+-CaM/Au電極上的Rct進一步降低并趨于平穩(wěn)。這說明CaM也能和Al3+結(jié)合，而且結(jié)合了Al3+后的CaM的空間構(gòu)象也會發(fā)生變化，致使[Fe(CN)6]3-/4-在電極上的電化學反應電阻減小。與Ca2+結(jié)合情況不同的是，在低濃度(10-9mol/L)時Rct并沒有變化，而是在10-8mol/L時才有所減小，這說明Al3+含量低(10-9mol/L)時并不能與CaM結(jié)合(此濃度時Ca2+能與CaM結(jié)合)，Al3+結(jié)合CaM的能力比Ca2+結(jié)合CaM的能力弱；且與Ca2+相比，Al3+結(jié)合了CaM后，Rct的變化也沒有那么明顯，預測這有可能是Al3+與Ca2+的結(jié)合位點不同所致。

表2 CaM/Au在含不同濃度Al3+ 溶液中浸泡后得到的Rct值

2.3 Cd2+與Fe3+結(jié)合CaM的電化學行為

同樣的方法又研究了Cd2+與Fe3+結(jié)合CaM的電化學行為。將CaM/Au電極在含不同濃度(分別為0，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4mol/L)CdCl2的0.15 mol/L NaCl溶液中浸泡足夠時間后測定交流阻抗，得到的Rct與浸泡溶液中所含的Cd2+濃度之間的關(guān)系如表3所示。

表3 CaM/Au在含不同濃度Cd2+ 溶液中浸泡后得到的Rct值

從表3可以看出，與結(jié)合Ca2+后的變化規(guī)律一樣，CaM結(jié)合Cd2+后，Rct減小，隨著結(jié)合Cd2+的增多，Cd2+-CaM/Au的Rct進一步降低并趨于平穩(wěn)。這說明CaM也能和Cd2+結(jié)合，結(jié)合后CaM的空間構(gòu)象也會發(fā)生變化，從而使[Fe(CN)6]3-/4-在電極上的電化學反應電阻減小。

將CaM/Au電極分別依次在含濃度為0，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4mol/LFeCl3的0.15mol/LNaCl溶液中浸泡足夠時間后測定交流阻抗，得到的Rct與Fe3+濃度的關(guān)系如表4 所示。

表4 CaM/Au在含不同濃度Fe3+ 溶液中浸泡后得到的Rct值

從表4可以看出，隨著Fe3+濃度的增加，[Fe(CN)6]3-/4-在修飾電極上的Rct幾乎沒有發(fā)生變化，這表明Fe3+不能引起CaM的空間構(gòu)象改變，不能與CaM 結(jié)合。

2.4 金屬離子與Ca2+競爭結(jié)合CaM的電化學行為

與Ca2+的離子半徑相近的金屬離子都有可能與CaM結(jié)合，從而與Ca2+產(chǎn)生競爭，影響CaM在生命體內(nèi)發(fā)揮作用。所以研究金屬離子與Ca2+競爭結(jié)合CaM的行為很有必要。同樣利用交流阻抗法，研究了Al3+,Cd2+與Ca2+競爭結(jié)合CaM的電化學行為。

圖4a)是Ca2+-CaM/Au和Al3+·Ca2+-CaM/Au的交流阻抗譜比較圖。其中Ca2+-CaM/Au是CaM/Au在含10-5mol/LCa2+的0.15mol/LNaCl溶液中浸泡足夠時間得到的；Al3+·Ca2+-CaM/Au是將得到的Ca2+-CaM/Au再在含10-5mol/LAl3+的0.15mol/LNaCl溶液中浸泡足夠時間得到的。從圖4a)可以看出，Al3+·Ca2+-CaM/Au的Rct比Ca2+-CaM/Au的還要小，說明有足夠多的Ca2+結(jié)合了CaM后，CaM中的Ca2+結(jié)合位點被占據(jù)，依然可以再結(jié)合Al3+。若順序反過來，CaM/Au先在含10-5mol/LAl3+的0.15mol/LNaCl溶液中浸泡足夠時間得到Al3+-CaM/Au，然后再在含10-5mol/LCa2+的0.15mol/LNaCl溶液中浸泡足夠時間得到Ca2+·Al3+-CaM/Au，比較Al3+-CaM/Au和Ca2+·Al3+-CaM/Au的交流阻抗譜，如圖4b)所示。從圖4b)可以看出，與Al3+-CaM/Au相比，Ca2+·Al3+-CaM/Au的Rct進一步減小。說明結(jié)合了足夠多的Al3+后，CaM還可以與Ca2+進一步結(jié)合。圖4 a)和圖4 b)相互印證，從而可以推斷在CaM中Al3+的結(jié)合位點與Ca2+結(jié)合位點不相同，這與生物領(lǐng)域關(guān)于CaM中的金屬離子的結(jié)合位點的研究得到的結(jié)論是一致的[5]。

圖4 交流阻抗譜比較圖Fig.4 Nyquist plots comparison diagram

同樣的方法，研究了Cd2+與Ca2+競爭結(jié)合CaM的電化學行為。圖5所示是Ca2+-CaM/Au和Cd2+·Ca2+-CaM/Au的交流阻抗譜，同樣Ca2+-CaM/Au是CaM /Au在含10-5mol/L Ca2+的0.15 mol/L NaCl溶液中浸泡足夠時間得到的；Cd2+·Ca2+-CaM/Au是將得到的Ca2+-CaM /Au再在含10-5mol/L Cd2+的0.15 mol/L NaCl溶液中浸泡足夠時間得到的。

圖5 Ca2+-CaM/Au與 Cd2+·Ca2+-CaM/Au 的交流阻抗譜比較圖Fig.5 Nyquist plots of Ca2+-CaM/Au and Cd2+·Ca2+-CaM/Au

從圖5可以看出，Cd2+·Ca2+-CaM/Au和Ca2+-CaM /Au兩者的交流阻抗譜基本重合。這說明CaM中的Ca2+結(jié)合位點被Ca2+全部占據(jù)后，就不能再結(jié)合Cd2+，從而推斷在CaM中Cd2+的結(jié)合位點與Ca2+結(jié)合位點相同，這與之前文獻中得到的結(jié)論是一致的[25-26]。

3 結(jié) 語

金屬離子與CaM結(jié)合會使CaM的空間構(gòu)象發(fā)生變化，這一點可以通過電化學交流阻抗譜中電化學反應電阻Rct的減小體現(xiàn)出來。因此可以通過Rct的變化判斷金屬離子是否能與CaM結(jié)合，Rct變小，說明能結(jié)合，否則不能結(jié)合。CaM在含相同濃度的金屬離子中浸泡足夠時間后，能使Rct減小更為明顯的金屬離子的結(jié)合能力更強。金屬離子占據(jù)了與CaM的結(jié)合位點后，再與其他離子結(jié)合，若能使Rct進一步減小，說明這2種金屬離子的結(jié)合位點不同；若不能使Rct進一步減小，說明這2種金屬離子的結(jié)合位點相同。Ca2+，Cd2+和Al3+都能與CaM結(jié)合，而Fe3+不能；Al3+與CaM的結(jié)合能力比Ca2+弱，且結(jié)合位點也不相同；Cd2+與CaM的結(jié)合位點與Ca2+相同。可見，交流阻抗法為研究離子與CaM的競爭結(jié)合行為提供了一個新方法。

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Study of the electrochemical behaviors of ion-binding to calmodulin

CUI Min, REN Jujie, LI Junxin

(School of Science, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China)

In order to research the competitive binding with CaM between metal ions and Ca2+， electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of ion (such as Ca2+，Cd2+，Al3+，F(xiàn)e3+) -loaded CaM self-assembled membrane on Au electrode in 0.15 mol/L NaCl solution containing 2 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-at pH 6.5 is investigated. The results indicate that the ion-binding property of CaM can be detected by the change of the electrochemical reaction resistance. Ca2+，Cd2+and Al3+can combine with CaM，and Fe3+can’t combine with CaM. The binding ability of Ca2+to CaM is stronger than that of Al3+. Ca2+binding site of CaM is different from that of Al3+and same as that of Cd2+. Electrochemical impedance spectroscopy provides a new method for the research of metal ions and CaM competition binding.

electrochemistry； self-assembled membrane； calmodulin； electrochemical impedance spectroscopy； electrochemical reaction resistance； conformational change

1008-1542(2017)02-0163-06

10.7535/hbkd.2017yx02010

2016-11-24；

2016-12-19；責任編輯：張士瑩

河北科技大學校立基金(XL1181157， XL201253， XL201046)

崔 敏(1971—)，女，河北石家莊人，講師，博士，主要從事電化學分析方面的研究。

E-mail:1335322868@qq.com

O657.1

A

崔 敏，任聚杰，李俊新.金屬離子競爭結(jié)合鈣調(diào)素的電化學行為研究[J].河北科技大學學報,2017,38(2):163-168.

CUI Min, REN Jujie, LI Junxin.Study of the electrochemical behaviors of ion-binding to calmodulin[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2017,38(2):163-168.