巴西甘蔗DNA導入甘蔗03—75品系的SRAP分子驗證

呂平+檀小輝+張繼+韋麗君+黃秋偉+金剛+黃顯雅

摘 要：利用SDS方法提取純化供體巴西甘蔗B8總DNA，通過懸浮共培養方法將巴西甘蔗DNA轉入到桂熱甘蔗03-75品系中，篩選獲得轉化的甘蔗植株。對轉化植株、供體和受體進行SRAP分子驗證。結果表明，用瓊脂糖凝膠電泳從112對引物組合中篩選出13對擴增多態性好、條帶清晰、穩定好的引物組合，再通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步篩選出4對較好引物組合，選擇引物M5E8組合對巴西甘蔗、轉化植株和桂熱甘蔗03-75品系進行SRAP檢測，轉化植株檢出帶有供體差異條帶，證明巴西甘蔗DNA導入了桂熱甘蔗03-75品系，引起了甘蔗基因組的變化，說明通過懸浮共培養方法進行甘蔗總DNA導入是可行的。

關鍵詞：甘蔗 懸浮共培養 SRAP

甘蔗是我國重要的糖料作物和能源作物。中國蔗區主要分布在廣西、云南、廣東等12個省（自治區）[1-5]。廣西是全國最大的蔗糖生產基地，但廣西甘蔗栽培品種單一化嚴重，長時間推廣新臺糖22號品種，導致品種種性退化、產量下降等嚴重問題[6-9]。高產、高效甘蔗新種質的創新顯得迫在眉睫。長期以來，甘蔗育種采用常規雜交育種，需要耗費大量人力、物力和財力，且育種周期長、篩選困難。還有另一個重要原因是許多野生甘蔗種質（或親緣關系較遠）與栽培甘蔗之間出現了雜交不親和現象。通過常規雜交方法將優良的性狀轉入到甘蔗品種（品系）中難度大。此外，由于廣西氣候因素原因，種植在廣西區域的甘蔗開花十分困難，經過人工技術調節開花難度大，且開花后花粉活力很弱，雜交育種非常困難，目前廣西甘蔗雜交育種主要在海南南繁育種基地進行，給本地的育種帶來許多不便，育種受到一定的障礙。隨著現代分子育種技術的快速發展，為遠緣種質的創新利用開辟了新的途徑。在1974年，周光宇等人[10，11]在調查了植物遠緣雜交廣泛實踐的基礎上，提出了植物遠緣雜交存在著染色體水平以下的DNA片段雜交假說，在此基礎上進行了外源總DNA導入農作物技術研究，達到種質創新和改良品種的目的，外源總DNA導入技術已在水稻、大豆、玉米、小麥、花生和煙草等作物品種改良中得到了應用[12-17]。同時對外源DNA導入后獲得的轉化植株進行了分子驗證。倪建福等人通過花粉管通道法將高粱DNA導入普通小麥后，RAPD鑒定表明高粱基因組部分片段整合到小麥染色體中[18]。

研究選擇以巴西甘蔗為供體，桂熱甘蔗03-75品系為受體， 通過懸浮共培養的方法將供體總DNA直接導入受體技術， 獲得在株型、株高等性狀有差異的類型，利用SRAP技術對其進行遺傳轉化分析，試圖通過生物技術手段將巴西甘蔗總DNA導入桂熱甘蔗03-75品系創新種質，探索甘蔗新的遺傳轉化方法的可行性，進一步為高產、高效等甘蔗育種生產提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供體：巴西甘蔗B8品種；受體： 桂熱甘蔗03-75品系。實驗所用到甘蔗品種/品系均來自廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所/廣西農墾甘蔗研究所種質資源圃。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法

采用王關林的SDS提取方法[19]提取新鮮甘蔗葉片的總DNA，瓊脂糖凝膠電泳法與紫外分光光度計法檢測DNA分子的濃度和純度。

1.2.2 懸浮共培養導入法

采用體細胞胚與供體巴西甘蔗B8總DNA懸浮共培養導入方法，具體步驟為：選取長至10～20 cm桂熱甘蔗03-75品系頂芽，消毒滅菌后接種到誘導培養基MS+2，4-D3.5 mg/L + NAA0.1 mg/L上誘導愈傷組織，愈傷組織培養在MS+2，4-D3.0 mg/L+NAA0.1 mg/L上增殖，挑選結構疏松、顏色淡黃的胚性愈傷組織（結合顯微鏡挑選），搖床震蕩培養，用孔徑50目細胞篩濾去較大孔徑的組織，再用孔徑80～150目的細胞篩濾，得到直徑0.1～0.2 mm的較分散的微小細胞粒。轉移至MS+2，4-D1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L培養基上，加入B8總DNA（濃度為200 g/mL），在搖床120 rpm的轉速進行懸浮共培養，后轉至MS+ 6-BA 2.0 mg/NAA0.1 mg/L培養基上分化不定芽，生根移栽，獲得甘蔗轉化植株。

1.2.3 SRAP引物、PCR體系與程序及PCR產物電泳

1.2.3.1 引物與PCR反應程序、體系

本實驗所用的SRAP引物參考朱弦弦、Li和Quiros等[20，21]，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成見表1，PCR反應程序與反應體系見表2、表3。

1.2.3.2 PCR產物電泳

瓊脂糖凝膠電泳檢測

取5 μl PCR產物，加入2 μl 6×Loading Buffer混勻后點樣，進行電泳分離，電泳的參數為120 v恒壓，EB染色法。

聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用6 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠，電泳的參數為180 v恒壓，銀染染色法。

2 結果與分析

2.1 供體巴西甘蔗B8總DNA提取與純度情況

用紫外分光光度計測定甘蔗總DNA A260/230、A260/280，瓊脂糖凝膠電泳鑒定相對分子量，其純度、濃度鑒定結果為：純度：A260/230=2.56>2，A260/280=1.95>1.8；濃度：ds =1250 μg/ml。從電泳圖1可以看出 ，DNA沉淀均為白色，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA片段、帶型均一，沒有拖尾現象，說明蛋白雜質與酚類物質含量少，DNA的純度較高。上述檢測結果表明，純化后的總DNA溶液純度、濃度符合導入條件，以MS溶液配成相應的DNA濃度，低溫保存備用。

2.2 轉化甘蔗試管苗的形態表現

轉化的植株經過培養后與CK相比，其形態特征有明顯的差異，結果見圖2。從圖2中可以看出，轉化后的植株從葉片、莖粗等特征差異較大，轉化的植株葉片濃綠，植株較粗壯，長勢較好。另外，實驗中也發現有些轉化植株的長勢比對照差。說明通過懸浮共培養法將巴西甘蔗B8 DNA導入受體桂熱甘蔗03-75品系后，受體甘蔗發生了不同程度的變化，這可能是巴西甘蔗的某些基因片段在桂熱甘蔗03-75品系進行了重組整合而發生了變化。

2.3 SRAP分析

2.3.1 適合SRAP實驗要求的DNA純度

甘蔗基因組DNA質量的好壞直接影響后續的分子生物學實驗的成敗。采用SDS法提取甘蔗DNA后用核酸測定儀測定所有供試的DNA樣品。本實驗提取的21份甘蔗樣品DNA的濃度介于200 ng/μl到1300 ng/μl之間，21份樣品A260/280的比值均在1.8～2.0之間、A260/230的比值均大于2.0，說明本次實驗提取的甘蔗DNA的質量較好，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，蛋白質等雜質少，純度較純（見圖3），可以滿足后續SRAP等分子生物學的實驗要求。

2.3.2 SRAP引物的篩選

上下游引物搭配組成112對引物組合，先用瓊脂糖凝膠電泳從中篩選出13對擴增多態性好、條帶清晰、穩定好的引物組合（見圖4）。再用6 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對13對引物組合進行進一步篩選，從中篩選出4對較好引物組合，分別為M4E8、M5E1、M5E8、M6E2。

2.3.3 SRAP圖譜分析

從圖5可以看出（圖示僅標注了差異明顯的條帶），甘蔗03-75品系轉化植株的SRAP分子標記多態性比較豐富，多態性有差異條帶的主要集中在50 bp～150 bp范圍間。甘蔗03-75轉化植株在①②位置出現了供體巴西甘蔗B8品種特有的而受體甘蔗03-75品系未有條帶。在①位置，編號5、7、12轉化植株的條帶強弱與供體巴西甘蔗B8品種一致；在②位置，編號8、9、12、13轉化植株的條帶出現比供體巴西甘蔗B8品種條帶更強的條帶；在③位置轉化植株出現了供體巴西B8甘蔗品種、受體甘蔗03-75品系都沒有的新條帶；在④位置轉化植株出現了條帶顏色更深的加強條帶；在⑤位置受體甘蔗03-75品系有弱條帶而轉化植株沒有，出現了缺失條帶。SRAP標記結果表明：通過懸浮共培養方法將巴西甘蔗總DNA導入甘蔗03-75品系后，獲得的甘蔗轉化植株可能為巴西甘蔗基因部分片段插入受體甘蔗03-75品系，或缺失了受體甘蔗的基因片段，或出現了供受體未有的新片段，說明巴西甘蔗的DNA導入受體甘蔗后使其基因組發生了不同程度的重組。

3 討論

植物外源總DNA導入技術是在20世紀80年代發展起來的，并被許多科研工作者發展應用，在水稻、玉米、小麥和煙草等作物取得成功，培育出的許多優良品種（系）在生產上已推廣應用，取得了良好的經濟和社會效益。本實驗通過懸浮共培養法將遠源（或近源）植物的DNA導入作物技術，該技術在馬鈴薯上有研究報道，洪亞輝等人[22]利用這一技術將人參總DNA導入馬鈴薯單細胞，獲得的馬鈴薯后代塊莖中含有人參皂苷RB1，且氨基酸、蛋白質含量大幅度提高，而其他性狀并沒有因為塊莖蛋白質含量和質量的提高而變化，但這一技術在其他植物還尚未應用。本課題組將自選育的優良甘蔗03-75品系的胚性愈傷組織直接在巴西甘蔗B8的總DNA進行懸浮培養，其目的是加強某些特殊性狀，特別是加強巴西甘蔗B8的固氮能力，據楊榮仲等人[23]利用15N同位素稀釋法測定在溫室盆栽條件下巴西甘蔗B8的生物固氮能力，結果顯示B8平均固氮百分率為26.91 %，而對照種桂糖11號不具固氮能力，對照種ROC16的固氮能力弱，僅為3.51 %。如何能將巴西甘蔗B8的這些優良特性導入到甘蔗03-75品系中，篩選優良的轉化植株，對甘蔗種質材料進行創新，從而為更進一步選育新品種做準備。通過本試驗有力的證實了將巴西甘蔗B8的總DNA通過該方法導入甘蔗03-75品系是可行的，轉化的植株不僅在形態上有差異，還在DNA水平上的SRAP（相關序列擴增多態性）有遺傳多態性。SRAP是一種基于PCR技術的新型的分子標記，由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros博士[21]于2001年提出的，具有簡便、穩定、中等產率和容易得到選擇條帶序列的特點，在構建分子遺傳圖譜、遺傳多樣性研究及種質資源的鑒定、作物起源與進化關系研究以及作物目標性狀連鎖標記研究上都有廣泛的應用。SRAP結果表明，甘蔗03-75品系的轉化植株不同引物的DNA擴增產物，顯示出受體對照甘蔗具有的DNA條帶在轉化甘蔗中大部分出現，總體表現為轉化后的甘蔗與受體對照甘蔗03-75品系具有大部分的相似性，說明轉化后甘蔗與受體對照的同源性很高，轉化后的甘蔗遺傳了受體對照甘蔗的大部分基因。另外，在轉化的甘蔗還出現了新的條帶，轉化甘蔗比受體對照甘蔗缺失了條帶或插入了新的條帶，兩者的基因組上存在分子水平遺傳差異。此外轉化后的甘蔗與巴西甘蔗B8擴增出一些相同大小的DNA片段，而相應的受體對照甘蔗03-75品系沒有擴增出此片段，這從分子角度進一步證實了巴西甘蔗B8的某些DNA片段在轉化甘蔗03-75品系基因組里有部分的重組或整合，或是轉化甘蔗已轉入部分供體的性狀。

現階段，甘蔗優良的種質材料非常稀缺，遠不能滿足當前生產的需要。為了拓寬優良基礎材料、豐富甘蔗種質資源，通過外源DNA 導入的方法引入遠緣（近緣）物種有益性狀的基因，克服遠緣雜交不親和、雜種不育等問題，為創新甘蔗種質資源提供了一種非常有效、可行的途徑，這在普通的常規雜交育種上是很難實現的。這不僅為以后選育優良的甘蔗新品種（品系）提供良好的育種材料，同時進一步為甘蔗分子育種奠定基礎并提供參考價值。

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