廣西不同產地三葉青中總黃酮含量分析

黎穎菁+付金娥+韋樹根+潘麗梅

摘 要：【目的】 研究三葉青不同產地、不同生長年限和部位總黃酮含量，為廣西三葉青的生產提供科學依據。【方法】采用紫外分光光度計法測定總黃酮含量。【結果】不同產地三葉青薯塊中總黃酮含量存在著較大差異；三葉青薯塊總黃酮含量隨著生長年限的增長而不斷上升；不同部位之間總黃酮含量差異顯著，以薯塊的總黃酮含量最高。【結論】評價出廣西三葉青生產的最佳產地及采收方法與部位。

關鍵詞：三葉青 總黃酮

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum），為葡萄科崖爬藤屬植物，其塊根稱為蛇附子。異名：有角烏蘞莓、石老鼠、石猴子、石抱子、搜夾風、三葉扁藤、絲線吊金鐘、金絲吊葫蘆、金線吊馬鈴薯等[1]。三葉青主要分布在長江以南地區，生于陰濕山坡、山溝或溪谷旁林下，以塊根或全草入藥，為民間常用的中草藥，具有抗癌抗腫瘤[2-3]、抗炎、鎮痛與解熱[4]、保肝[5-6]等作用，且毒副作用小，是西藥無法代替的“植物抗生素”。臨床上已廣泛用于抗癌及抗艾滋病毒、抗腫瘤等疾病。近年來，我國有多個中藥廠都在使用三葉青作原料生產中成藥，如三葉青膠囊、三葉青沖劑、三葉青茶等并且其需求量呈大幅度增長趨勢，市場的需求引起人們對三葉青研究的日益重視。本研究以來源于廣西樂業縣、田林縣、西林縣等的9份種質資源為試驗材料，研究了三葉青不同產地及不同生長年限和部位總黃酮含量，研究結果將為三葉青的生產提供科學依據。【前人研究進展】目前對三葉青的研究主要集中在化學成分、藥理、臨床等方面，而在資源、栽培等方面的研究則相對較少。韋樹根等對廣西三葉青的資源狀況進行了調查研究，發現廣西三葉青的野生資源已瀕臨滅絕[7]；程良綏介紹了三葉青的生物學特性，并從選地與整地、育苗、種植、林地管理、病蟲害防治、采收等方面總結三葉青林下栽培技術[8]；吉慶勇等觀察了三葉青形態特征和生長發育特性[9]；錢麗華等以三葉青葉片誘導的愈傷組織為試材，接種繼代增殖，進行不同溫度和光周期培養試驗[10]；總黃酮含量測定研究方面，吉慶勇等采用紫外可見分光光度法測定了人工種植和野生三葉青中黃酮的含量，分析結果表明，兩者含量沒有顯著差異[11]；范世明等也是采用紫外分光光度法對福建不同產地三葉青的總黃酮含量進行了測定[12]。【本研究切入點】廣西是三葉青的主要產區之一， 但目前為止未見有對廣西不同產地、不同生長年限及不同部位總黃酮含量比較的研究。因此本研究主要對廣西主產區的三葉青種質資源進行總黃酮含量比較研究，同時測定三葉青不同生長年限和不同部位的總黃酮含量，旨在為廣西三葉青資源的開發提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以采集于廣西西林、田林、隆林、樂業、凌云、宜州、環江、羅城、馬山等縣的9份三葉青（Tetrastigma hemsleyanum）的種質資源試驗材料。

1.2 儀器與試劑

Cary 50型可見-紫外分光光度計，美國Varian公司；MARS-5型高壓微波消解儀，美國 CEM公司；CP224S型電子天平，德國Sartorius公司；CP225D型電子天平，德國Sartorius公司；蘆丁，中國藥品生物制品檢定所，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇均為分析純，國藥集團化學制劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品的制備

精密稱取不同產地、不同年份、不同部位的供試品0.5 g（精確至0.001 g）于100 mL三角瓶中，分別加入60 %乙醇溶液25 mL，在85 ℃恒溫水浴鍋上加熱回流提取2 h，取出冷卻，過濾，用60 %酒精反復清洗殘渣，濾液轉移到50 mL容量瓶中，加60 %乙醇稀釋至刻度，搖勻即得。

1.3.2 標準溶液的制備

精密稱取蘆丁標準品5 mg（精確至0.0001 g），放入燒杯中，加入乙醇適量，置于水浴鍋上微熱使其溶解，放冷，轉移至25 mL容量瓶，用60 %乙醇定容至刻度，搖勻，其得到的蘆丁標準溶液的濃度為0.2 mg/mL。

1.3.3 測定波長的選擇

取一定量1.2.2和1.2.3項下制備的供試液和標準品溶液，置于25 mL容量瓶中，各加50 %乙醇溶液至6 mL，加5 %亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min，加入10 %硝酸鋁1 mL，搖勻，靜放6 min，再加10 %氫氧化鈉10 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min于200～800 nm波長區間掃描吸收曲線，供試品溶液在500 nm處有最大吸收，與蘆丁標準品溶液吸收曲線相似，故選用500 nm為測定波長。

1.3.4 標準溶液的制備

精密量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL蘆丁標準溶液，分別置于25 mL容量瓶中，按‘1.3.3中方法操作制備，于500 nm處測定其吸光度（X）， 以試劑空白調零。以吸光度（X）為橫坐標，質量濃度（Y）為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.5 方法精密度

取0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按‘1.3.3中方法操作制備，于500 nm處連續測定其吸光度7次，計算7次吸光度的平均值和相對標準偏差。

1.3.6 重復性實驗

將田林產三葉青（塊根）供試品分成等量的7份，進行平行實驗。按照“1.3.3”中方法制備樣品，測定其吸光度，利用回歸方程計算7份三葉青樣品中游離氨基酸含量，并計算7次游離氨基酸的平均值和相對標準偏差。

1.3.7 穩定性實驗

精密量取田林產三葉青供試液2.0 mL置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.3”中方法制備樣品，每隔20、40、60、80、100、120 min測定其吸光值。

1.3.8 樣品的測定

精密量取適量的供試液（三葉青莖、葉提取液各5 mL，塊根提取液各2 mL），分別置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.3”中方法制備樣品，于500 nm處測定其吸光度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及線性關系

由圖1，蘆丁在8～48 μg/mL與吸光度呈良好的線性關系。回歸方程為Y=0.0668X-0.0003，R2=0.9999。

2.2 方法精密度

從表1可知，7次蘆丁標準溶液的吸光度的變化幅度不大，其RSD為0.36 %，說明該方法的精密度良好。

2.3 方法的重復性

從表2可知，7次測定田林產三葉青中總黃酮的含量變化不大，其RSD為0.76 %，說明實驗方法的重復性良好。

2.4 供試液的穩定性

從表3可知，樣品溶液在1.5 h內的吸光度變化不大，其RSD為0.68 %，說明供試樣品溶液在1.5 h內穩定。

2.5 不同產地總黃酮含量比較

2010年10月，把收集到的種質資源種植于種質圃內，進行統一管理。2013年2月每一種質采挖10株，每株采挖3個薯塊，混合曬干后測定各種質總黃酮含量。各種質的總黃酮含量見表4。從表4可以看出，不同產地三葉青的總黃酮含量存在著較大差異。百色地區其中總黃酮含量較高，最高是來源于田林縣，其含量為4.79 %；含量最低的來源于環江縣為2.89 %，最高含量是最低含量的1.66倍。

2.6 不同生長年限

以來源于廣西樂業縣的種質為材料，在植株生長的不同時期采其薯塊測定總黃酮的含量，總黃酮的含量的動態變化如圖2。根據圖2可以看出，三葉青塊莖總黃酮含量隨著生長年限的增長而不斷上升，總黃酮累積速度最快的是第1年、第2年，第3年以后總黃酮累積速度開始變慢，四年生薯塊總黃酮含量分別是一年生、二年生、三年生的2.32、1.35、1.08倍。

2.7 不同部位總黃酮含量

以廣西樂業縣3年生三葉青為研究材料，采收同一單株上的葉片、藤莖、塊莖曬干至恒重，分別測定其總黃酮含量，結果見表5。從表5可以看出，同一植株上不同的部位其總黃酮含量差異顯著。以塊莖的總黃酮含量最高，藤莖次之，葉片的最低。塊莖總黃酮的含量分別是藤莖和葉片的8.38和5.65倍。

3 討論

研究結果表明，在9份三葉青種質資源中，不同種質之間薯塊的總黃酮含量有較大的差異，來源于百色地區的田林縣、樂業縣、凌云縣的種質資源總黃酮含量總體上比來源于河池地區的宜州市、環江縣、羅城縣的總黃酮含量高。其中總黃酮含量最高是來源于田林縣，其總黃酮含量為4.79 %；含量最低的來源于環江縣，其總黃酮含量為2.89 %，最高含量是最低含量的1.66倍。范世明等對福建不同產地三葉青的總黃酮含量進行了測定，但其測定主要是福建和浙江地區的樣品，其研究結果表明各個產地的三葉青根總黃酮含量存在明顯差異，與本研究結果一致[7]。說明三葉青總黃酮的變異幅度較大，在遺傳育種上有較大的潛力，通過種質資源的評價及優良品種的選育可選育出適合于生產的優良品種。三葉青塊莖總黃酮含量隨著生長年限的增長而不斷上升，但第3年至第4年的增長幅度較小，因此在生產上如產量達到要求，三年生的三葉青即可采收。此外，本文還對三葉青的不同部位進行了研究，發現藤莖和葉片總黃酮含量也較高，但塊莖的總黃酮含量顯著高于藤莖和葉片。不同生長年限和不同部位的總黃酮含量的研究，可為三葉青的采收提供科學的依據。

參考文獻

[1] 國家中藥管理局《中華本草》編委會.中華本草，第l3卷[M].上海：上海科學技術出版社，1999：296-298.

[2] 鐘良瑞，魏克民. 三葉青黃酮對肺癌A549細胞生長抑制與MAPKs通路關系的研究[J].中國藥理學通報，2014，30（1）：101-104.

[3] 李華美，浦錦寶，鄭軍獻，等. 三葉青乙酸乙酯提取物對小鼠Lewis肺癌移植性腫瘤的抑制作用及免疫功能的影響[J].中國中醫藥科技，2012，19（3）：229-230.

[4] 黃真，毛慶秋，魏佳平.三葉青提取物抗炎、鎮痛及解熱作用的實驗研究[J]. 中國新藥雜志，2005，14（7）：861-864.

[5] 楊雄志，巫軍. 三葉青提取物抗乙肝病毒活性的研究[J]. 南京中醫藥大學學報，2009，25（4）：294-296.

[6] 楊雄志. 三葉青對小鼠免疫性肝損傷保護作用的研究[J]. 實用中西醫結合臨床，2008，8（2）：88-89.

[7] 韋樹根，董青松，韋瑩，等. 廣西瀕危珍稀中藥材三葉青資源調查研究[J]. 北方園藝，2011， 21：162-164.

[8] 程良綏.藥用植物三葉青的生物學特性及林下栽培技術[J]. 現代農業科技，2014（14）：187- 188.

[9] 吉慶勇，程文亮，吳華芬，等. 三葉青生物學特性研究[J]. 時珍國醫國藥，2014，25（1）：219- 221.

[10] 錢麗華，毛碧增.光溫條件對三葉青愈傷生長及黃酮積累的影響[J].浙江農業科學，2013（9）：1098-1100.

[11] 吉慶勇，華金渭 ，程文亮，等. 人工種植和野生三葉青中總黃酮含量的比較[J]. 浙江農業科學，2012（1）：37-38.

[12] 范世明，林 婧，許文，等. 不同產地三葉青中總黃酮含量的比較[J]. 福建中醫藥大學學報，2013，23（3）：44-45.