甘蔗基因克隆的研究進展

譚秦亮+潘成列+周全光+朱鵬錦+歐克緯+李穆

摘 要：甘蔗是我國當前主要的糖料作物，蔗糖業發展是廣西的主要經濟發展方向，對保障廣西經濟及農民生活水平具有重大的戰略意義。隨著基因工程技術的帶動，甘蔗抗旱基因克隆對選育抗旱甘蔗品種及定向改良具有重要作用。現從甘蔗抗旱功能基因和信號轉導相關基因兩個方面全面進行研究總結，以期為甘蔗抗旱育種的基因克隆研究提供參考。

關鍵詞：甘蔗 抗旱育種 基因克隆 研究進展

甘蔗（Saccharum officinarum L.）屬于禾本科甘蔗屬C4植物，主要生長在熱帶、亞熱帶地區，為一年生或多年生草本植物，如今是我國主要的糖料作物。蔗糖業發展是廣西的主要經濟發展方向，對保障廣西經濟及農民生活水平具有重大的戰略意義。然而隨著全球氣候的惡化，極端天氣的頻繁出現，缺水干旱正嚴重危害著廣西的甘蔗生產與發展。甘蔗屬于無性繁殖的多倍體植物，具有遺傳背景復雜、基因組龐大等特點，同時又缺乏優異農藝性狀的育種親本，對利用表現性狀進行傳統抗逆性遺傳育種的研究造成諸多困難，因此如何選育高產高糖抗逆性強的甘蔗新品種成為現階段甘蔗育種的關鍵轉折點。

近年來，隨著基因工程技術的發展，利用分子生物技術對甘蔗品種進行遺傳性狀改良已成為甘蔗育種的熱門研究。選育抗旱甘蔗品種對甘蔗產業的可持續發展甚為重要，而通過基因改良提高甘蔗抗旱性是目前比較熱門的研究方向。了解與分析近年來對甘蔗抗旱基因克隆的相關研究現狀，有助于為下一步研究把握方向，為進一步挖掘出更多重要抗旱基因用于甘蔗品種改良打下堅實基礎。

1 甘蔗滲透調節相關基因的研究

甘蔗是一種對水分和熱量要求比較高的植物，在甘蔗的生理代謝、營養吸收和物質轉化等過程中均少不了水分的參與，因此水分是維持甘蔗正常生長發育的重要物質。當甘蔗受到干旱脅迫時，苗期蔗苗的萌芽、中期蔗株的分蘗、伸長以及后期甘蔗糖分的積累等不同生長發育過程均會受到限制，從而使甘蔗體內發生一系列的生理生化反應，如滲透調節物質變化、活性氧增加、光合作用受抑制等，是影響甘蔗產量和品質最主要的非生物脅迫因素。大量研究發現干旱脅迫時甘蔗體內會積累大量的代謝物質，并通過自身的調節功能維持細胞內外的物質平衡和滲透壓平衡。這些滲透調節物質分為2類：一類是游離小分子有機物質，主要包括脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖、氨基酸等；另一類是外界進入植物體內的無機離子，主要有K+、CL-、Ca2+、Mg2+、Na+等。

脯氨酸是一種小分子的滲透物質，在正常生理pH范圍內不帶靜電荷，對植物無毒害作用。在細胞含水量很低時脯氨酸仍能提供足夠的自由水，從而維持細胞的正?；顒?，因此脯氨酸被認為是與抗旱性密切相關的植物滲透調節物質。在干旱脅迫時為了提高植物的抗旱性，植物細胞內會積累大量游離脯氨酸，從而增加植物對水分脅迫和滲透脅迫的抗性[1]。至今已從水稻、擬南芥、黑麥、大豆、番茄等植物中成功克隆出了多個脯氨酸合成酶或與之相關的基因，研究證明。1-吡咯琳-5-羧酸合成酶（P5CS）與脯氨酸脫氫酶（ProDH）都是脯氨酸合成的主要酶類。Molinari等[2]將脯氨酸合成酶基因（P5CS）導入甘蔗體內中，結果表明轉基因甘蔗在干旱情況下誘導脯氨酸大量積累，在干旱12 d后轉基因植株的生物量明顯提高。黃城梅[3]采用同源克隆與RT-PCR方法從甘蔗中成功克隆到Sc-P5CS基因，建立反義植物表達載體后轉入煙草，進行研究發現轉入Sc-P5CS基因的煙草植物矮小、葉片變黃，猜測這與抑制了脯氨酸的合成有很大的關系。

海藻糖能夠有效的保護植物體內細胞膜和蛋白質的結構，因此甘蔗在受到干旱脅迫時海藻糖可以有效防止細胞失水，從而使甘蔗具有更強的抗旱、抗寒能力。Li等[4]在水稻中克隆并轉基因海藻糖-6-磷酸合成酶基因OsTPS1，結果發現不僅可以使一些與干旱脅迫相關的基因上調表達，而且在誘導表達的轉基因植株中，海藻糖和脯氨酸的濃度明顯高于普通植株。Zhang[5]等將海藻糖合成酶基因轉入甘蔗，通過對轉基因甘蔗體內一系列生理指標的測量，轉基因植株能夠合成和積累海藻糖并明顯提高了甘蔗的抗旱性。

2 甘蔗抗氧化防御類相關基因的研究

當植物受到干旱脅迫時活性氧產生的速率會隨著脅迫的加大而遞增，從而導致細胞內的活性氧代謝失去平衡，而過剩的活性氧將在細胞內誘發自由基連鎖反應，然后產生H2O2、O2-、OH- 等更多的自由基和活性氧，當細胞內大量積累活性氧類物質時就會對細胞造成一定的傷害，主要表現為[6-8]：①加快細胞膜脂過氧化，從而損傷甚至瓦解維持植物細胞區域化的膜系統；②活性氧攻擊核酸堿基，破壞核酸結構，使變異產生并積累；③活性氧與色氨酸殘基或者酶蛋白的巰基發生反應使酶失活；④活性氧對DNA復制過程的傷害，導致蛋白質的合成受到破壞。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）及過氧化物酶（POD）是植物體內抗氧化酶系統的主要作用酶，在植物受到干旱脅迫時會激活這一類的氧化酶基因過量表達，然后快速提高植物清除活性氧的能力，增強相關蛋白復合體及膜結構的穩定性。

2.1 超氧化物歧化酶（SOD）

SOD是一類廣泛存在于植物細胞內的金屬酶，是膜脂過氧化防御系統的關鍵保護酶，也是抵御活性氧傷害的第一道防線。它能催化活性氧發生歧化反應生成H2O2和O2，其他酶類負責把H2O2分解為H2O，從而避免植物受到傷害[9]。由于定位與結合的金屬離子的不同，可以將SOD分為以下3種[10-11]：主要存在于葉綠體和細胞質中的Cu/Zn-SOD；主要存在于線粒體的Mn-SOD；主要存在于葉綠體的Fe-SOD。隨著人們對SOD的不斷研究與深入，已經在水稻[12]、小麥[13]、甘蔗[14]、擬南芥[15]等很多植物中對其克隆成功。

王盛等[14]在甘蔗中成功克隆得Cu/Zn-SOD，對其進行各種逆境脅迫后定量分析，結果表明該基因的表達受到干旱、低溫、高鹽及氧化脅迫的誘導表達，且主要存在于甘蔗葉片中，與該基因定位于植物地上綠色部位的推測完全一致。

Que等[11]成功克隆到甘蔗Mn-SOD基因的全長，進行黑穗病菌脅迫后發現該基因受到甘蔗黑穗病菌脅迫的強烈誘導，推測該基因具有清除多余氧自由基和抗病的功能。 Galune[16]對番茄進行干旱脅迫后分析Cu/Zn-SODs的變化，結果顯示干旱脅迫可以誘導Cu/Zn-SODs，而且是番茄對干旱脅迫的重要響應途徑。Lyudmila等[17]對抗性和感性小麥品種進行長期干旱脅迫研究，并對小麥體內的抗氧化酶進行實時定量分析，結果隨著小麥的生長正常未受脅迫的小麥中Cu/Zn-SOD和Fe-SOD的活性均明顯下降，且Fe-SOD逐漸消失，而受到干旱脅迫后的小麥Fe-SOD和Mn-SOD的活性均不斷增加，尤其是在感性品種中表現更為明顯。由此推測，不同植物中的SOD同工酶在受到干旱脅迫時活性變化與表現不盡一致。

2.2 抗壞血酸過氧化物酶（APX）

APX是植物體內防御氧化脅迫和自身活性氧代謝的重要抗氧化酶類，主要存在于細胞的葉綠體、線粒體和胞質中，是一種由卟啉與肽鏈構成的血紅蛋白。APX是抗壞血酸—谷胱甘肽循環（ASA-GSH循環）途徑的關鍵作用酶，利用其提供的電子將H2O2還原催化轉化為H2O。根據APX存在位置的不同可以有以下4種：①存在于細胞質的cAPX；②存在于類囊體的tAPX；③存在于微體膜的mAPX；④存在于葉綠體基質的sAPX。

近年來，有關APX的研究主要集中在逆境脅迫下活性的變化或轉錄水平基因克隆等方面，已有擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大麥（Hordeum vulgare）、甘蔗（Saccharum officinarum）棉花（Gossypium spp.）、水稻（Oryza sativa）、西紅柿（Lycopersicon esculentum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）等多種植物的APX基因被成功克隆和深入研究。王竹青等[18]結合電子克隆技術和RT-PCR等方法克隆到甘蔗APX基因，該基因全長1171bp編碼345個氨基酸，并對其進行ABA、PEG、NaCl等逆境脅迫，結果均呈上調表達?？寺“俸螦PX基因并將其導入擬南芥，結果發現擬南芥植株APX酶活性和耐鹽性均顯著提高[19]。有研究發現APX基因的過量表達，可明顯提高轉基因植株的抗旱抗氧化等抗逆境脅迫能力，并可以有效保護膜系統遭受活性氧的侵害，從而提高轉基因植物的抗逆性和耐受性。過表達APX的轉基因煙草在受到氧化脅迫和除草劑脅迫時tAPX活性比野生型的提高了37倍，不僅有效地提高了轉基因煙草的抗氧化脅迫能力，而且增強了轉基因煙草對除草劑誘導和氧化脅迫誘導的細胞死亡的抗性[20-21]。鹽脅迫耐受型和敏感型不同基因型的黑麥草[22]，在試驗處理4 d后耐受型植株葉片中SOD和 APX的活性明顯提高，而在敏感型的植株葉片中MDA、H2O2的含量明顯增加，APX等抗氧化酶的活性均低于對照組。同樣的情況在水稻中也有所發現[23]，高鹽脅迫水稻幼苗葉片，隨后葉片中的SOD、APX、CAT等抗氧化酶的活性不斷升高，因此在植物受到各種非生物脅迫時APX在植物抵御逆境脅迫時起到了重要的作用。

3 甘蔗ABA信號轉導相關研究

3.1 ABA生物合成途徑中的關鍵酶

近年來，許多研究表明[24-25]，C40的類胡蘿卜素間接途徑是高等植物體內ABA的主要生物合成途徑。該途徑以C40的類胡蘿卜素為前體，再由類胡蘿卜素裂解成C15的化合物黃質醛（XAN），最終通過氧化裂解轉化成ABA[25]。在此途徑中9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）是催化裂解類胡蘿卜素前體的關鍵酶，研究表明ABA合成的類胡蘿卜素前體的含量可比ABA含量高出上百倍，可稱為“類胡蘿卜素前體庫”，因此NCED被認為是ABA生物合成中最重要的限速酶。植物NCED基因是一個只在特定組織表達的多基因家族，其cDNA已在擬南芥[26-27]、甘蔗[28]、大麥[29]、花生[30]、馬鈴薯[31]等植物上被克隆到。轉基因植物中NCED基因的過量表達能引起ABA的積累和耐旱性的增加，過量表達甘蔗SoNCED、番茄LeNCED3、擬南芥AtNCED3、豆類PvNCED1均可以使轉基因植株體內ABA含量的增加，并且顯著提高了轉基因植株的耐干旱的能力[26，28，32-33]。

在擬南芥中，NCED基因是一個多基因家族共有9個成員，其中5個基因在 ABA生物合成中有功能活性[34]。在這5個基因中，AtNCED3被認為是響應干旱脅迫的，在葉片中起著主要作用[37]。研究發現在擬南芥中，AtNCED3的表達受到干旱脅迫的上調，過量表達AtNCED3的植物積累ABA，并表現出蒸騰作用減弱的現象，耐旱力增強[35]。李長寧等[28，36]運用RT-PCR及RACE-PCR技術克隆出甘蔗SoNCED基因，并擴增出SoNCED基因的開放閱讀框，大小為1827 bp，編碼608個氨基酸。在不同脅迫時進行甘蔗葉片實時熒光定量PCR分析，該基因在干旱、低溫、高鹽等條件的處理下均能誘導表達。SoNCED基因的表達量在不同脅迫處理后到達峰值時間雖有差異，但都有明顯的上調表達。同時在甘蔗葉片和根系中發現SoNCED基因表達量均能隨著活性氧產生速率的升高而顯著上升，并與ABA含量的增長呈協同關系，因此推測SoNCED基因參與了甘蔗葉片和根系內源ABA合成的調控。對玉米、柑橘等作物進行研究發現[37-39]，NCED基因的表達均可被不同逆境脅迫誘導，且表達量與ABA含量有著協同效應，過表達該基因能明顯提高轉基因植株內源ABA的含量和耐脅迫能力。

3.2 甘蔗ABA信號轉導相關基因

通過對ABA信號轉導通路的研究發現[40-45]，植物細胞在受到逆境誘導時可以合成內源ABA，ABA與其受體PYR1結合后再與PP2C結合形成三元復合體，從而抑制了PP2C的活性 ，使受PP2C抑制的SnRK2s激酶處于活性狀態，SnRK2s激酶能磷酸化ABA響應元件的結合蛋白或結合因子，然后激活ABA應答基因的表達，從而調控植物的生理反應和生長發育。SnRK2s是該途徑中關鍵的調控酶基因，它的激活在植物響應滲透逆境脅迫時發揮著重要的作用。

譚秦亮等[46]利用RT-PCR和RACE-PCR技術，克隆出編碼甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2，并對該基因進行了原核表達及蛋白純化的分析，在ABA、干旱、低溫等外源脅迫處理下發現在甘蔗葉片中該基因均上調表達，推測該基因參與調控干旱、高鹽和低溫等脅迫過程，在甘蔗抗逆境脅迫中起重要作用。小麥的TaSnRK2.3基因被克隆后轉擬南芥，結果發現轉基因擬南芥上調表達，不僅能夠改善根系生長，而且能夠顯著提升耐旱、耐鹽、和抗凍結能力[47]。

4 結語

關于甘蔗抗旱的生理生化研究已有很多，但是在基因工程方面的研究還處于初級階段。尤其與水稻、玉米等作物相比，甘蔗中基因的克隆只是局限在同源克隆和電子克隆技術上。因此，在這方面的研究應該著重于基因的功能分析，在獲得一些抗旱相關基因后對它們進行更深入的調控機制分析，進而加強多基因間的聯合轉化及研究。以后在該方面的研究可以偏向于選擇調控抗旱信號轉導通路的基因上，然后構建多個抗旱基因的表達載體，進行甘蔗轉化研究甘蔗的綜合性狀表現。希望通過對這方面的研究總結，可以為甘蔗的基因工程育種奠定理論基礎并提供技術儲備。

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