氣相色譜-串聯質譜法測定大米及其灌溉水中嘧菌環胺的殘留量

劉芯成，黃 亮，朱萌萌，陳盧濤，周 強，王川丕

(1.綠城農科檢測技術有限公司，浙江 杭州 310000; 2.安徽農業大學 茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036)

氣相色譜-串聯質譜法測定大米及其灌溉水中嘧菌環胺的殘留量

劉芯成1，黃 亮1，朱萌萌1，陳盧濤1，周 強2，王川丕1

(1.綠城農科檢測技術有限公司，浙江 杭州 310000; 2.安徽農業大學 茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036)

建立了大米及灌溉水中嘧菌環胺殘留量的氣相色譜- 串聯質譜(GC- MS/MS)檢測方法，并模擬實際生產環境，對嘧菌環胺的穩定性進行研究。大米樣品經乙腈提取，氨基固相萃取柱(NH2- SPE)凈化；大米灌溉水經二氯甲烷提取，在GC- MS/MS上進行檢測分析，采用外標法定量。結果表明，嘧菌環胺在0.01～0.50 mg·L-1內相關系數可達0.999以上，具有良好的線性關系；共選擇3個離子對，其中1組用于定量m/z224.10/208.10，另外2組用于定性確證m/z224.10/197.10、224.10/131.10。樣品中添加0.01、0.1、1.0 mg·kg-1的標準品，其回收率為85%～102%，相對標準偏差小于5%。研究表明，該方法提取效果好，具有良好的靈敏度、回收率和重復性；嘧菌環胺在灌溉水中半衰期為3.12 d，在室溫、正常光照條件下，1 d內穩定，2 d后降解速度加快，4 d后降解速度減慢并趨于穩定，為實際生產中如何施藥提供了一定的參考依據。

嘧菌環胺； GC- MS/MS； 穩定性

嘧菌環胺屬于嘧啶胺類化合物，20世紀90年代由瑞士先正達作物保護有限公司開發成功，主要用于防治灰霉病、白粉病、黑星病、網斑病、穎枯病和小麥眼紋病等[1]，其作用機理是通過抑制蛋氨酸的生物合成和水解酶的生物活性而導致病菌死亡[2]。而紋枯病、灰霉病和稻瘟病等真菌性病害是限制水稻穩產、高產的主要限制因子之一。嘧菌環胺具有較廣的殺菌活性。艾爽等[3]研究嘧菌環胺對水稻紋枯病具有一定的抑制效果；徐桂芳等[4]研究表明，30%嘧菌環胺懸浮劑對稻瘟病防治效果明顯，可有效抑制葉稻瘟病和穗頸瘟的流行。

目前我國尚未制定嘧菌環胺在大米中最大殘留限量，但規定其在小麥和杏仁中的限量分別為0.5和0.02 mg·kg-1。2014年日本修訂嘧菌環胺在多種食品中的殘留限量。大麥由3.0 mg·kg-1調整為2.0 mg·kg-1，洋蔥由0.6 mg·kg-1調整為0.05 mg·kg-1。歐盟對嘧菌環胺在大米中最大殘留限量規定為0.02 mg·kg-1[5]。目前，對嘧菌環胺的檢測主要集中在氣相色譜、液相色譜及液相色譜質譜聯用上。Otero等[6]采用SPME- GC- MS對白葡萄酒中的嘧菌環胺進行檢測，LOD和LOQ分別為0.1和0.2 μg·L-1。Luis等[7]采用高效液相色譜結合二極管陣列檢測器對葡萄中的嘧菌環胺進行檢測，回收率達到97%左右。而三重四級桿串聯質譜通過對適當的母離子進行二次質譜分析，能有效去除基質離子的干擾，定性更加準確，并具有較高的靈敏度[8]。本研究建立了大米及其灌溉水中嘧菌環胺的氣相色譜- 串聯質譜測定方法，并對該藥在水中的穩定性進行了探討，為指導該藥在水稻種植中的合理使用提供了一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氣相色譜- 串聯質譜儀(GC- 2010 plus氣相色譜儀配TQ8040質譜儀，ZB- 5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，日本Shimadzu公司)；ST- 16R離心機(美國Thermo Fisher公司)；BSA2202S電子天平(德國Sartorius公司)；漩渦混合器(美國Henry Troemner公司)；旋轉蒸發儀(瑞士Buchi 公司)；NH2- SPE氨丙基固相萃取柱(500 mg，6 mL天津博納艾杰爾科技有限公司)；KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MTN- 5800氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

嘧菌環胺標準品(純度98.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈、丙酮(HPLC級，美國J.T.Baker公司)；其他試劑為分析純，實驗室所用水均為去離子水；微孔有機濾膜(0.22 μm)。

1.2 供試樣品

大米及其灌溉水樣品由藍城農業科技有限公司提供。大米樣品經粉碎機粉碎，過40目篩，混勻，于常溫下保存。

1.3 試驗步驟

1.3.1 大米樣品

稱取10 g(精確至0.01 g)于100 mL燒杯中，加入5 mL水浸泡0.5 h，加入50 mL乙腈，用均質器在15 000 r·min-1勻漿提取1 min，抽濾并轉移提取液至100 mL具塞量筒中(內加5～7 g氯化鈉)，劇烈振搖2 min，靜置30 min，取上清液10 mL待凈化；用5 mL乙腈預淋洗NH2柱，將NH2柱放置在固定架上，下接雞心瓶，移入上述10 mL待凈化液，用15 mL乙腈+甲苯(3+1)分3次洗滌小柱，收集所有流出物，旋轉濃縮至近干，用2 mL正己烷定容，渦旋溶解，用0.22 μm有機濾膜過濾，收集濾液待測定。

1.3.2 灌溉水

量取10 mL于125 mL分液漏斗中，加入20 mL二氯甲烷，劇烈振搖1 min，取二氯甲烷層于雞心瓶中；殘渣分別用10 mL二氯甲烷重復提取2次，合并3次提取液，旋轉蒸發濃縮至凈干，用10 mL正己烷定容，渦旋溶解，用0.22 μm有機濾膜過濾，收集濾液待測定。

1.3.3 嘧菌環胺在灌溉水中穩定性試驗

取灌溉水10.0 mL于50 mL離心管中，加入濃度為1.00 mg·L-1的嘧菌環胺標準溶液1.00 mL，混勻后加蓋密閉，共配制待測樣品24個，置于恒溫(25±1)℃、光照與黑暗時間為15 h∶9 h的培養箱中，分別于0，1，2，3，4，5，6，7 d后依次取出3個樣品進行檢測，檢測方法同1.3.2節。

1.3.4 標準溶液的配制

稱取嘧菌環胺0.009 6 g，用色譜純丙酮定容至25.0 mL，得到約378 mg·L-1嘧菌環胺標準儲備溶液，用正己烷稀釋為40.0 mg·L-1的嘧菌環胺標準工作溶液，于0～4 ℃保存。

1.3.5 基質工作液的配制

試驗中根據需要，取1.3.1節所述提取的樣品液對標準儲備液進行稀釋，現配現用。

1.4 試驗條件

1.4.1 色譜條件

進樣口溫度250 ℃，載氣為高純氦氣，碰撞氣為高純氬氣，純度≥99.999%，柱流量為1.6 mL·min-1；不分流進樣，1.0 min后開閥；進樣量1 μL；定量方法外標法。

1.4.2 質譜條件

色譜- 質譜接口溫度280 ℃，電離方式EI，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，檢測器電壓0.99 kV (+0.4 kV)，測定方式為MRM多重反應監測模式。定性、定量離子、碰撞能量等參數見表1。

表1 嘧菌環胺質譜檢測參數

注：*表示定量離子。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜- 質譜條件的優化

在電子轟擊離子源(EI)檢測模式下對嘧菌環胺進行一級質譜分析(Q3 Scan)，在質譜圖中選擇分子量較高，離子強度較大的離子為前體離子。設定3～45 eV(每3 eV為1個間隔)的碰撞能量，對得到的前體離子峰進行二級質譜分析(產物離子掃描)，根據二級質譜圖，選擇離子強度最大的為定量離子(224.10>208.10)，離子強度次之的為定性離子(224.10>197.10，224.10>131.10)。圖1為使用優化后的氣相色譜質譜條件對嘧菌環胺標準品及試驗回收的MRM質譜圖。

圖1 嘧菌環胺MRM色譜圖

2.2 灌溉水中嘧菌環胺提取溶劑的選擇

本研究針對灌溉水中嘧菌環胺的萃取，分別比較二氯甲烷、石油醚和乙腈3種提取溶劑對該藥回收率的影響。由圖2可知，3種溶劑中的回收率均達到75%以上，其中乙腈、二氯甲烷溶液回收率達到85%以上，考慮到二氯甲烷的沸點更低，有利于后續的濃縮及凈化過程，因此選擇二氯甲烷作為提取溶劑。在萃取體積的選擇上，使用20 mL二氯甲烷萃取1次得到的回收率為66.1%，而使用20、10和10 mL分次萃取，回收率在90.0%以上，說明分批萃取可從樣品中有效萃取嘧菌環胺。因此本試驗選擇用20、10和10 mL二氯甲烷的體積分3次萃取嘧菌環胺。

圖2 不同溶劑及不同體積二氯甲烷萃取嘧菌環胺的回收率

研究過程發現，使用標準工作溶液和基質工作溶液定量對回收率的影響較大，且基質工作溶液定量比標準工作溶液的回收率高10%～15%，表明基質效應對嘧菌環胺殺菌劑的影響較大。研究中均采用基質工作溶液進行定量。

2.3 嘧菌環胺在灌溉水中穩定性的測定

農藥殘留的貯存穩定性不僅與其本身的性質(如化學結構、蒸汽壓、水溶性等)，還與貯存條件(光照、溫度、濕度等)等因素有關[9]。本研究在試驗室模擬了大田中正常溫度和光照條件下噴施農藥后嘧菌環胺在水中的降解情況。嘧菌環胺在灌溉水中的降解計算采用一級動力學方程式(Ct=C0e-kt)[10]。

圖3顯示，嘧菌環胺在灌溉水中的消解趨勢符合一級反應動力學方程，半衰期為3.12 d。隨著時間的延長，嘧菌環胺含量降低，在1和3 d時的濃度分別較0 d降低5.48%和47.3%，在5、6和7 d時濃度僅為0 d時的6.31%、3.55%和2.33%。表明嘧菌環胺在室溫、正常光照條件下，1 d內穩定，在2 d后降解速度加快，4 d后降解速度減慢并趨于穩定。揭示了嘧菌環胺在正常環境條件下的降解規律，為實際生產中如何施藥提供了一定的參考依據。

圖3 嘧菌環胺在灌溉水中殘留量消解動態

2.4 方法的線性范圍、加標回收率、精密度和定量限

取0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100、0.200、0.500 mg·L-1質量濃度的嘧菌環胺農藥，按優化色譜條件進樣1 μL，以峰面積為縱坐標，標準樣品的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，其線性回歸方程為Y=3 057.4X-14 731，相關系數為0.999 1，以信噪比S/N≥3估算儀器的檢出限(LOD)，S/N≥10估算儀器的定量下限(LOQ)分別為0.083和0.270 μg·kg-1。

稱取不含農藥的空白大米及灌溉水樣品，分別添加0.010 0、0.100和1.00 mg·kg-1不同水平的嘧菌環胺標準溶液進行回收率試驗，每個添加水平重復3次，添加回收試驗結果見表2，空白基質及加標回收氣質色譜結果見圖1。

表2 嘧菌環胺加標回收率及相對標準偏差

3 小結

本文建立了氣相色譜- 串聯質譜分析大米及其灌溉水中嘧菌環胺殺菌劑的農藥殘留方法，大米、灌溉水樣品分別用乙腈和二氯甲烷萃取，大米樣品用NH2- SPE固相萃取柱凈化后，進入GC- MS/MS檢測分析，利用外標法進行定量。結果表明，該方法靈敏度高、回收率好，可以用于嘧菌環胺的檢測分析；模擬大田實際環境，對嘧菌環胺在水中的穩定性進行分析，結果表明，該藥在室溫、正常光照條件下，24 h內穩定，在48 h后降解速度加快，96 h后降解速度減慢并趨于穩定。揭示了嘧菌環胺在正常環境條件下的降解規律，為實際水稻生產如何施藥提供了一定的參考依據。

[1] 潘東，楊紅，劉賢進. 葡萄中嘧菌環胺的氣相色譜分析[J].江蘇農業學報，2009，25(5)：1199- 1200.

[2] 何永梅，賈世宏. 內吸性殺菌劑—嘧菌環胺[J].農化市場十日訊，2011(28)：32.

[3] 艾爽，侯昌亮，胡寒哲，等. 8種殺菌劑對水稻紋枯病菌的室內毒力比較[J].長江大學學報自然科學版(石油/農學)，2014，11(2)：4- 5.

[4] 徐桂方，陳二龍，姜國慶，等. 早稻稻瘟病田間藥效試驗[J].植物醫生，2015，28(4)：32- 33.

[5] European pesticides database of maximum residue levels(Last update：2016- 02- 17). http：//ec.europa.eu/food/plant/pesticides/max_residue_ levels/index_en.htm.

[6] OTERO R R，RUIZ C Y，GRANDE B C，et al. Solid- phase microextraction- gas chromatographic- mass spectrometric method for the determination of the fungicides cyprodinil and fludioxonil in white wines[J]. Journal of Chromatography A，2002，942(1/2)：41- 52.

[7] LUIS V F，ANA S，JESS S A，et al. Determination of cyprodinil and fludioxonil in the fermentative process of must by high- performance liquid chromatography- diode array detection[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2008，88(11)：1943- 1948.

[9] 王素利，陳振山，江樹人，等. 農藥殘留樣本貯存穩定性概述[C]//農藥與環境安全國際會議論文集. 北京：中國農業大學出版社，2005.

[10] GAO J，GARRISON A W，HOEHAMER C，et al. Uptake and phytotransformation of organophosphorus pesticides by axenically cultivated aquatic plants[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2000，48(12)：6114- 6120.

(責任編輯：張瑞麟)

2016- 10- 24

劉芯成(1987—)，助理工程師，大專，從事農獸藥殘留檢測工作，E- mail：15185227@qq.com。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170335

S511

B

0528- 9017(2017)03- 0472- 04

文獻著錄格式：劉芯成，黃亮，朱萌萌，等. 氣相色譜- 串聯質譜法測定大米及其灌溉水中嘧菌環胺的殘留量[J].浙江農業科學，2017，58(3)：472- 475.