山茱萸的化學成分研究

葉賢勝+赫軍+張佳琳+龐曉斌+張蕾+喬灝祎+潘雪格+張佳+劉淑娜+張維庫+續潔琨

[摘要] 利用各種色譜技術對山茱萸的化學成分進行研究，從山茱萸水提取物中分離得到6個化合物，分別為6′-O-乙酰基-7α-O-乙基莫諾苷（1），（-）-isolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside（2），芹菜素（3），cirsiumaldehyde（4），對香豆酸（5），咖啡酸（6），其中化合物1為新化合物，化合物2～4為首次從山茱萸屬植物中分離得到。利用MTT 法檢測了化合物2～6對缺氧缺糖損傷的PC12細胞的保護作用，結果表明化合物4在1.0 μmol·L^-1的濃度下，對OGD/R損傷的PC12細胞物有一定的保護作用。

[關鍵詞] 山茱萸；化學成分；6′-O-乙酰基-7α-O-乙基莫諾苷；PC12細胞

[Abstract] To investigate the chemical compounds from the fruit of Cornus officinalis，six compounds were isolated and determined by extensive spectroscopic analysis as 6′-O-acetyl-7α-O-ethyl morroniside （1），（-）-isolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside（2），apigenin （3），cirsiumaldehyde（4）， p-coumaric acid （5），caffeic acid （6）. Compound 1 was a new iridoid glucoside，and compounds 2-4 were obtained from the Cornus genus for the first time. Compounds 2-6 were evaluated for the viability of PC12 cells when exposed in conditions of oxygen and glucose deprivation. The MTT results showed that compound 4 increased cell viability moderately in OGD/R treated PC12 cells at the concentration of 1.0 μmol·L^-1.

[Key words] Cornus officinalis；chemical constituents；6′-O-acetyl-7α-O-ethyl morroniside；PC12 cells

doi：10.4268/cjcmm20162419

山茱萸為山茱萸科Cornaceae植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，主產于山西、陜西、河南等省[1]，是我國傳統的名貴滋補中藥材。始載于《神農本草經》，其性酸、澀，微溫，歸肝、腎經，具有補益肝腎和澀精固脫之功效[2]。研究表明山茱萸的化學成分主要為環烯醚萜、鞣質、黃酮、三萜和苯丙素類等[3-5]。現代藥理學研究表明山茱萸在降血糖，降血脂，抗炎、抑菌，抗心律失常，抗氧化，抗衰老，抗腫瘤，抗血栓等方面均表現出較好的活性[3，6-9]。目前關于山茱萸的化學成分研究還不夠深入，為了更好的闡明其藥效物質基礎，本實驗對山茱萸的化學成分進行了系統地研究，采用硅膠柱色譜、ODS柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜和制備高效液相色譜等方法分離純化得到6個化合物，根據理化性質和波譜數據分別鑒定為6′-O-乙酰基-7α-O-乙基莫諾苷（1），（-）-isolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside（2），芹菜素（3），cirsiumaldehyde（4），對香豆酸（5），咖啡酸（6）。其中化合物1為新化合物（圖1），化合物2～4為首次從山茱萸屬植物中分離得到。此外，還利用MTT法檢測了化合物2～6對缺氧缺糖損傷的PC12細胞的保護作用，結果表明在化合物4在1.0 μmol·L^-1的濃度下，對OGD/R損傷的PC12細胞物有一定的保護作用。

1 材料

JASCO P-2000 Polarimeter型旋光儀（JASCO公司）；Nicolet 5700型FT-IR紅外光譜儀（Thermo Fisher公司）；Bruker AV-400/600型核磁共振儀（BrukerBiospin公司）；Agilent 1200 LC/MSD TOF型液相色譜-質譜聯用儀（Agilent公司）；Agilent 1100型分析液相（DAD檢測器）；Waters制備液相（泵：Waters 515型，檢測器：Waters 2487）；島津制備液相（泵：LC-20AR，檢測器：SPD-20A）；WFH-203三用紫外分析儀；Sartorius-BS223S電子分析天平；D101型大孔吸附樹脂為滄州寶恩吸附材料科技有限公司生產；柱層析硅膠（100～200目，200～300目）為青島海洋化工廠生產；硅膠GF254薄層預制板為煙臺化學工業研究所產品；ODS（30～50 μm）為YMC公司生產；Sephadex LH-20型凝膠為Pharmacia公司生產；制備型HPLC色譜柱為ES Epic C₁₈色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）和ES Sonoma C₁₈色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）；實驗所用試劑均為分析純（北京化工廠）和色譜純（Honeywell）。

實驗所用山茱萸為2013年11月采摘自陜西省佛坪縣，由北京中醫藥大學續潔琨副教授鑒定為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸C. officinalis的成熟果實，樣本存放于中日友好醫院臨床醫學研究所（No.20131106）。

2 提取分離

干燥的山茱萸果實（63 kg），水煎煮提取2次（600，500 L），每次2 h。合并提取液，減壓濃縮得到總浸膏（約28.9 kg）。總浸膏用水混懸后經D101型大孔吸附樹脂柱，依次用水，30%，55%，95%乙醇洗脫。30%乙醇洗脫部位濃縮后得浸膏2.8 kg，經硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（100∶0，95∶5，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，1∶1）梯度洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr.A～Fr.E。

Fr. A經硅膠柱色譜分離，氯仿-丙酮（100∶0，95∶5，9∶1，6∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1）梯度洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr.A1～Fr.A4；Fr.A1經硅膠柱色譜分離，環己烷-乙酸乙酯（100∶0，9∶1，8∶1，6∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1）梯度洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr. A1-1～Fr. A1-8，其中Fr. A1-6經ODS柱色譜分離，依次用10%，18%，25%，33%，40%，50%，65%，85%，100%甲醇梯度洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr. A1-6-1～Fr. A1-6-8；Fr. A1-6-4在甲醇中結晶得到化合物4（24 mg）。Fr. A2經ODS柱色譜分離，依次用10%，20%，30%，40%，50%，60%，80%甲醇梯度洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr.A2-1～Fr.A2-6，其中Fr.A2-1經制備液相分離（色譜柱ES Epic C₁₈；流動相30%甲醇；流速4.0 mL·min^-1）得到化合物6（18 mg）；Fr.A2-2經制備液相分離（色譜柱ES Epic C₁₈；流動相18%乙腈；流速4.5 mL·min^-1）得到化合物5（20 mg）；Fr. A2-4經制備液相分離（色譜柱ES Epic C₁₈；流動相15%甲醇；流速3.5 mL·min^-1）得到化合物3（10 mg）。Fr.A3經ODS柱色譜分離，依次用10%，20%，30%，40%，50%，60%，75%甲醇梯度洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr.A3-1～Fr.A3-4，其中Fr.A3-2經制備液相分離（色譜柱ES Epic C₁₈；流動相30%乙腈，流速4.5 mL·min^-1）得到化合物1（2 mg）。Fr.B經Sephadex LH-20（甲醇）柱色譜分離，得組分Fr.B1和Fr.B2；Fr.B2經ODS柱色譜分離，依次用5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，80%甲醇梯度洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr.B2-1～Fr.B2-6，其中Fr.B2-3再經Sephadex LH-20（甲醇）柱色譜分離，得8個組分（Fr.B2-3-1～Fr.B2-3-8）；Fr.B2-3-2經制備液相分離（色譜柱ES Sonoma C₁₈；流動相33%甲醇；流速5.0 mL·min^-1）得到化合物2（5 mg）。

3 結構鑒定

化合物1 淡黃色粉末。[α] 25D+20.33 （c 0.03，MeOH）。HR-ESI-MS m/z 499.178 7 [M+Na]+ （計算值為499.178 6），結合¹H和¹³C-NMR譜確定分子式為C₂₁H₃₂O₁₂，不飽和度為6。IR顯示該化合物含有羥基（3 381 cm^-1）和羰基（1 734 cm^-1）等結構片段。

¹H-NMR （CD₃OD，400 MHz）譜（表1）高場區顯示3個甲基質子信號δ_H1.20 （3H，t，J=7.2 Hz，H-14），1.36 （3H，d，J=7.2 Hz，H-10），δ_H2.09 （3H，s，H-8′ ）；1個甲氧基質子信號δ_H3.72 （3H，s，-OCH₃）；低場區顯示3個縮醛質子信號δ_H4.56 （1H，dd，J=10.0，2.4 Hz，H-7），4.80 （1H，d，J=8.0 Hz，H-1′ ），5.76 （1H，d，J=9.2 Hz，H-1）；1個連氧烯氫質子信號δ_H7.53 （1H，s，H-3）；此外，δ_H3.24～4.36為1組葡萄糖特征質子信號，葡萄糖端基氫（δ_H4.80）的偶合常數為8.0 Hz，提示為β型葡萄糖。¹³C-NMR （CD₃OD，100 MHz）譜（表1）共顯示21個碳信號，結合DEPT譜分別為3個季碳，11個次甲基，3個亞甲基，4個甲基。結合HSQC譜進一步確定該化合物在高場區含有3個甲基碳信號δ_C15.6，19.7，20.9；1個亞甲基碳信號δ_C35.9；2個次甲基碳信號δ_C31.9，40.5；1個甲氧基碳信號δ_C51.9；1個連氧亞甲基碳信號δ_C65.4；1個連氧次甲基碳信號δ_C74.0；1組葡萄糖碳信號δ_C75.0 （C-2′），78.0 （C-3′），72.0 （C-4′），75.5 （C-5′），64.8 （C-6′）；在中低場區顯示3個縮醛碳信號δ_C96.6，100.5，103.0，其中δ_C100.5為葡萄糖的端基碳信號；1個烯碳信號δ_C111.4；1個連氧烯碳信號δ_C154.7；在低場區顯示1個羰基碳信號δ_C168.8和1個乙酰基碳信號δ_C173.0；結合以上波譜數據，該化合物的NMR數據與7α-乙氧基莫諾苷[10]十分相似，不同之處在于該化合物的¹H-NMR譜在δ_H2.09 （3H，s）處多出3個氫信號，¹³C-NMR譜在δ_C173.0和20.9處多出一組乙酰基信號。在HMBC譜（圖2）中H-8′ （δ_H2.09）和H-6′ （δ_H4.32和4.36） 與C-7′ （δ_C173.0）遠程相關，證明化合物的乙酰基結構片段和葡萄糖結構片段的6′位相連接。在NOESY 譜（圖2）中，H-1與CH₃-10α相關，H-5β與H-7，H-8，H-9相關，確定H-1，H-10為α構型，H-5，H-7，H-8，H-9為β構型。

化合物1 按照文獻[11]方法進行酸水解和衍生化處理，HPLC分析結果顯示化合物1的糖基部分衍生物與D-葡萄糖標準品的衍生物保留時間一致（t=18.513 min），故確定化合物1的結構中含有D-葡萄糖。

綜合上述分析，化合物1的結構鑒定為6′-O-乙酰基-7α-O-乙基莫諾苷（圖1）。經SciFinder系統文獻檢索，發現該化合物為未經報道的新化合物。

化合物 2 白色粉末。¹H-NMR （CD₃OD，400 MHz） δ： 6.75 （1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.70 （1H，d，J=1.9 Hz，H-2′），6.66 （1H，s，H-8），6.65 （1H，d，J=2.0 Hz，H-6′），6.19 （1H，s，H-5），4.05 （1H，d，J=7.8 Hz，H-1″），3.85～3.64 （m），3.81 （3H，s，-OCH₃），3.80（3H，s，-OCH₃），3.36-3.23 （m），3.17（1H，m），3.06 （1H，m），2.89 （1H，m，H-1a），2.76 （1H，dd，J=4.0，15.4 Hz，H-1b），1.96 （2H，m，H-2，H-3）；¹³C-NMR （CD₃OD，100 MHz）δ： 149.1 （C-3′），147.4 （C-7），146.2 （C-6），145.4 （C-4′），138.9 （C-1′），133.9 （C-10），129.4 （C-9），123.6 （C-6′），117.5 （C-5），116.1 （C-5′），114.1 （C-2′），112.5 （C-8），104.0 （C-1″），78.4 （C-5″），78.0 （C-3″），75.2 （C-2″），71.5 （C-4″），70.9 （C-3a），65.6 （C-2a），62.6 （C-6″），56.6 （3′-OCH₃），56.5 （7-OCH₃），45.5 （C-3），41.3 （C-2），33.8 （C-1）。以上數據與文獻[12]對比，故鑒定該化合物為（-）-isolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside。

化合物3 黃色針晶（甲醇）。¹H-NMR （DMSO-d₆，400 MHz） δ： 12.95 （1H，s，5-OH），7.91 （2H，d，J=8.8Hz，H-2′，6′），6.92 （2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.76 （1H，s，H-3），6.46 （1H，s，H-8），6.19 （1H，s，H-6）；¹³C-NMR （DMSO-d₆，100 MHz） δ： 181.7 （C-4），164.7 （C-7），163.7（C-2），161.4 （C-4′），161.3 （C-5），157.3 （C-8a），128.4 （C-2′），128.4 （C-6′），121.1 （C-1′），116.0 （C-3′），116.0 （C-5′），103.5 （C-4a），102.8 （C-3），99.0 （C-6），94.0 （C-8）。以上數據與文獻[13] 對比，故鑒定該化合物為芹菜素（apigenin）。

化合物4 淡黃色粉末。¹H-NMR （DMSO-d₆，400 MHz） δ： 9.59 （2H，s，-CHO×2），7.50 （2H，d，J=3.6 Hz，H-3，3′），6.76 （2H，d，J=3.6 Hz，H-4，4′），4.63 （4H，s，H-6，6′）；¹³C-NMR （DMSO-d₆，100 MHz） δ： 178.4 （-CHO×2），157.3 （C-5，5′），152.3 （C-2，2′），123.7 （C-3，3′），112.3 （C-4，4′），63.7 （C-6，6′）。以上數據與文獻[14] 對比，故鑒定該化合物為cirsiumaldehyde。

化合物5 淡黃色粉末。¹H-NMR （DMSO-d₆，400 MHz） δ： 7.50 （1H，d，J=8.0 Hz，H-7），7.47 （2H，d，J=15.6 Hz，H-3，5），6.78 （2H，d，J=8.0 Hz，H-2，6），6.28 （1H，d，J=15.6 Hz，H-8）；¹³C-NMR （DMSO-d₆，100 MHz） δ： 168.2 （C-9），159.5 （C-4），143.8 （C-7），130.0 （C-2，6），125.3 （C-1），115.7 （C-3，5），114.8 （C-8）。以上數據與文獻[15] 對比，故鑒定該化合物為對香豆酸（p-coumaric acid）。

化合物6 淡黃色粉末。¹H-NMR （DMSO-d₆，400 MHz） δ： 7.41 （1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.02 （1H，d，J=2.0Hz，H-2），6.95 （1H，dd，J=2.0，8.4 Hz，H-6），6.75 （1H，d，J=8.4 Hz，H-5），6.17 （1H，d，J=16.0 Hz，H-8）； 13C-NMR （DMSO-d₆，100 MHz） δ： 167.6 （-COOH），147.8 （C-4），145.2 （C-7），144.2 （C-3），125.4 （C-1），120.8 （C-8），115.4 （C-6），114.9 （C-5），114.3 （C-2）。以上數據與文獻[16] 對比，故鑒定該化合物為咖啡酸（caffeic acid）。

4 化合物對PC12細胞缺氧缺糖損傷的保護作用

大鼠嗜鉻瘤PC12細胞用含10%FBS的High-DMEM培養基培養于37 ℃，5%CO₂的培養箱中，隔天換培養液。待細胞鋪滿培養瓶底部的80%以上時，以0.25%胰蛋白酶消化 2 min后，加入10%新生牛血清的DMEM培養液終止消化，以彎頭滴管輕輕吹下貼壁生長細胞，吹打均勻后分至新細胞培養瓶，加培養液，放入37 ℃，5% CO₂的培養箱中培養。待培養瓶中PC12細胞的融合度達到80%以上時，經行傳代操作并按照6萬個/mL的密度鋪滿96孔板，100 μL/孔，并分為空白對照組，模型組，陽性藥組，以及化合物組；24 h后依次加入1.0 μmol·L^-1的化合物2～5，陽性藥組加入終濃度為5.0 μmol·L^-1的尼莫地平，空白組與模型組換液處理，放置于細胞培養箱中孵育，作用24 h后，對模型組，陽性藥組，以及各濃度加化合物組加入終濃度為8.0 mmol·L^-1無糖Earles稀釋的Na₂S₂O₄缺氧缺糖損傷45 min，然后各組均加入完全培養基復氧復糖4 h；與超凈工作臺中以10 μL/孔加入MTT，細胞培養箱中孵育4 h，用多功能酶標儀450 nm下測定各組的A。

實驗結果顯示，與空白組（100%）相比，模型組細胞存活率（54.1%）明顯降低；與模型組相比，化合物4組細胞存活率從54.1%升高至69.2%，表明化合物4對缺糖缺氧損傷的PC12細胞有一定的保護作用，其他化合物對PC12細胞均無保護作用。

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[責任編輯 丁廣治]