HPLC同時測定山豆根中7種生物堿及3種黃酮的含量

韓馥蔓+王莉鑫+陳影+陳兩綿+馮偉紅+王錦玉+劉德文+游云+仝燕

[摘要] 建立HPLC同時測定山豆根中7種生物堿（金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿、槐醇、苦參堿和槐果堿）及3種黃酮（三葉豆紫檀苷、芒柄花素和馬卡因）含量的方法。采用Welch Xtimate_TMC₁₈（4.6 mm × 250 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（A）-0.01 mol·L^-1醋酸銨（氨水調pH 8.0）溶液（B）進行梯度洗脫：0～20 min，4%～14% A；20～30 min，14%～25% A；30～45 min，25%～40% A；45～65 min，40%～55% A；65～75 min，55% A；流速1.0 mL·min^-1，柱溫30 ℃，檢測波長225 nm。方法學驗證結果顯示，10種成分的分離度良好，且在各自濃度范圍內呈現出良好的線性關系，r≥0.999 7，平均回收率在98.60 %～102.6 %，RSD為0.60%～3.7%（n=6），該方法簡便、準確，重復性良好。含量測定結果顯示，7種生物堿和3種黃酮成分在不同樣品中的含量具有顯著性差異。由此表明，不同批次的山豆根藥材，其內在質量存在較大差異。該法可用于山豆根藥材的多成分同步測定，同時可以為山豆根的全面質量評價和質量控制提供科學依據。

[關鍵詞] 山豆根；高效液相色譜法；含量測定；生物堿；黃酮

[Abstract] In this study，an HPLC method was developed for simultaneous determination of seven alkaloids （cytosine，oxymatrine，N-oxysophocarpine，N-methylcytisine，sophoranol，matrine，and sophocarpine） and three flavonoids （trifolirhizin，fermononetin，and maackiain） from different samples of Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma. Samples were analyzed on a Welch Xtimate_TMC₁₈ column （4. 6 mm× 250 mm，5 μm） eluted with the mobile phase of acetonitrile （A） and 0.01 mol·L^-1 ammonium acetate solution （pH 8.0） （B） in a linear gradient mode as follows： 0-20 min，4%-14% A；20-30 min，14%-25% A；30-45 min，25%-40% A；45-65 min，40%-55% A；65-75 min，55% A. The flow rate of the mobile phase，the column temperature，and the PDA detector wavelength were set at 1.0 mL·min^-1，30 ℃，and 225 nm，respectively. For the method validation，these ten compounds showed good separation and satisfactory linearity （r≥0.999 7） within the concentration ranges tested. The mean recoveries were in the range of 98.60% to 102.6% with the RSD （n=6） between 0.60% and 3.7%. This method was proved to be simple，accurate and repeatable. The quantitative results showed that there were significant differences in the contents of seven alkaloids and three flavonoids among the different samples. This result revealed that the quality of Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma varied widely. This method could be used for the simultaneous determination of the multi-ingredients from Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma，which might provide scientific evidences to evaluate/control the quality of Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma，comprehensively.

[Key words] Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma；HPLC；quantitative analysis；alkaloid；flavonoid

doi：10.4268/cjcmm20162423

山豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep. 的干燥根和根莖，主產于廣西、貴州、江西、云南等地，味苦，性寒，具有清熱解毒，消腫利咽的功效，主治火毒蘊結，乳蛾喉痹，咽喉腫痛，齒齦腫痛，口舌生瘡[1]。山豆根中主要含有生物堿、黃酮及多糖類成分[2]。現代藥理學研究表明，山豆根中所含生物堿類成分具有多重功效，如苦參堿和氧化苦參堿等具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗心律失常、降血壓和解熱鎮痛等藥理活性[3]；槐花醇、槐果堿和氧化槐果堿等具有抗乙肝病毒活性[4]，槐果堿還具有鎮靜、鎮痛及對抗室性心律失常等作用[5]。山豆根中黃酮類成分具有誘導腫瘤細胞凋亡[6]，抑制胃酸分泌，治療胃潰瘍等作用[7]，其中三葉豆紫檀苷和馬卡因可抑制白血病HL-60細胞[8]，芒柄花素具有抑制過敏性炎癥和抗宮頸癌等作用[9-10]。因此，山豆根的整體藥效是山豆根中多種有效成分共同作用的宏觀反映，山豆根的內在質量由多種有效成分的含量高低共同決定。目前，對于山豆根的質量評價和質量控制，主要以生物堿類成分苦參堿和氧化苦參堿的含量作為評價指標[11-14]，對于同時測定多種黃酮和生物堿類成分含量的研究報道較為少見。本研究建立了HPLC同步測定7種生物堿（金雀花堿、槐醇、槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿、N-甲基金雀花堿）和3種黃酮（三葉豆紫檀苷、芒柄花素及馬卡因）含量的分析方法，并對山豆根藥材的質量進行了分析與評價，可為山豆根藥材的全面質量控制提供科學依據。

1 材料

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BT 125D型1/10萬電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；BSA 2224S-CW型1/1萬電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；JA1003型1/1000電子天平（上海良平儀器有限公司）；B2510E-DTH型超聲波清洗儀（美國Bransonic公司）；DET-50型號高速萬能粉碎機（溫嶺市大德中藥機械有限公司）。

氧化苦參堿（批號PSO187-0020，純度>98.5%）、苦參堿（批號PSO986-0025，純度>99.0%）和芒柄花素（批號PSO215-0025，純度>98.0%）購自成都普斯生物科技有限公司；金雀花堿（批號J-008-160311，純度>98.0%）、N-甲基金雀花堿（批號J-008-160311，純度>98.0%）、槐果堿（批號H-031-140729，純度≥98.0%）、三葉豆紫檀苷（批號S-061-150924，純度>98.0%）和馬卡因（批號M-030-150731，純度>98.0%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；槐醇（批號CFS201601，純度≥98.0%）購自武漢天植化學生物科技有限公司；氧化槐果堿（批號Z1856B3547，純度≥98.0%）購自廣州雋沐生物科技有限公司。甲醇和乙腈為色譜純（賽默飛世爾科技有限公司），醋酸銨、濃氨水和二氯甲烷均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司），水為娃哈哈純凈水。

實驗用山豆根藥材8批，于2016年收集，其中江西產山豆根1批（JX-1），貴州產山豆根1批（GZ-1），廣西產山豆根6批（GX-1，GX-2，GX-3，GX-4，GX-5和GX-6），經中國中醫科學院中藥研究所何希榮老師鑒定為山豆根S. tonkinensis 的干燥根和根莖。

2 方法和結果

2.1 色譜條件 采用Welch Xtimate TM C₁₈（4.6 mm × 250 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（A）- 0.01 mol·L^-1醋酸銨（氨水調pH 8.0）溶液（B）進行梯度洗脫，梯度洗脫程序：0～20 min，4%～14% A；20～30 min，14%～25% A；30～45 min，25%～40% A；45～65 min，40%～55% A；65～75 min，55% A；流速1.0 mL·min^-1，柱溫30 ℃，檢測波長225 nm。在上述色譜條件下，樣品中金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿、槐醇、苦參堿、槐果堿、三葉豆紫檀苷、芒柄花素和馬卡因色譜峰的保留時間與對照品保持一致，10種成分的色譜峰能達到較好的分離，且純度檢查符合要求，樣品中其它成分對待測成分的測定無干擾。對照品及典型的山豆根樣品的HPLC圖見圖1。

2.2 對照品儲備溶液的制備 分別取各對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成含40.3 mg·L^-1金雀花堿、 427.2 mg·L^-1氧化苦參堿、106.7 mg·L^-1氧化槐果堿、 27.2 mg·L^-1 N-甲基金雀花堿、 28.4 mg·L^-1槐醇、51.9 mg·L^-1苦參堿、23.3 mg·L^-1槐果堿、58.5 mg·L^-1三葉豆紫檀苷、18.1 mg·L^-1芒柄花素和52.8 mg·L^-1馬卡因的混合對照儲備溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取藥材粉末（過50目篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入二氯甲烷-40%氨水（25∶1）的混合溶液25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，稱重，用混合溶液補足減失的質量，搖勻，濾過；精密量取續濾液10 mL，水浴揮干，殘渣加入甲醇適量使溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.4 線性與范圍、檢測限（LOD）和定量限（LOQ） 分別精密吸取2.2項下混合對照品儲備溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配制成系列濃度的對照品溶液。取各個濃度的混合對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件測定峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），對照品濃度（mg·L^-1）為橫坐標（X），繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數（r）；同法逐級稀釋，分別以S/N=3和S/N=10的進樣濃度確定檢測限（LOD）和定量限（LOQ），結果見表1。結果表明，各待測物在各自濃度范圍內線性關系良好，檢測限為0.118～1.15 mg·L^-1，定量限為0.395～3.82 mg·L^-1。

2.5 精密度考察 取同一中等濃度的混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積，計算峰面積的RSD。結果顯示，金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿、槐醇、苦參堿、槐果堿、三葉豆紫檀苷、芒柄花素和馬卡因峰面積的RSD分別為1.8%，0.65%，1.9%，0.71%，2.3%，1.7%，1.8%，1.3%，1.9%，0.94%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定性考察 取同一份供試品溶液，分別于配制后0，2，4，6，8，12 h進樣，測定峰面積，計算峰面積的RSD。結果顯示，金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿、槐醇、苦參堿、槐果堿、三葉豆紫檀苷、芒柄花素及馬卡因峰面積的RSD分別為2.9%，2.2%，2.7%，2.7%，1.9%，2.7%，2.6%，1.8%，2.9%，2.4%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.7 重復性考察 取同一批次的山豆根樣品（GX-3）約0.5 g，共6份，按照2.3項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL進樣，測定峰面積，計算含量。結果顯示，金雀花堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿、槐醇、苦參堿、槐果堿、三葉豆紫檀苷、芒柄花素和馬卡因含量的RSD分別為1.8%，2.9%，1.6%，1.2%，2.1%，2.4%，1.5%，1.6%，2.4%，2.9%，表明重復性良好。

2.8 加樣回收率考察 取已知含量的同一批次的山豆根樣品（GX-3）約0.25 g，共 6 份，分別加入對照品適量，按照2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下的色譜條件進行含量測定，計算10種成分的平均回收率及RSD，結果見表2。10種待測成分的平均回收率在98.60%～102.6%，RSD均小于4.0%，表明方法的準確度良好。

2.9 樣品的含量測定 取各山豆根樣品粉末，按照2.3項下方法制備供試品溶液，每個樣品平行2份，并按照2.1項下的色譜條件進行測定，計算各山豆根樣品中10種成分的含量，含量測定結果見表3。

3 討論

本研究建立了HPLC測定山豆根中金雀花堿、槐醇、槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿、N-甲基金雀花堿等7種生物堿及三葉豆紫檀苷、芒柄花素、馬卡因等3種黃酮含量的方法，該方法簡便，準確，重復性良好。采用該法，對不同批次的山豆根樣品進行了測定。

3.1 供試品溶液制備方法的考察 實驗考察了水浴回流法和超聲法2種提取方法對待測成分的提取效果，結果表明2種提取方法的提取效率無顯著性差異，考慮到實驗的簡便易行，最終選擇超聲提取法；比較了甲醇-氨水、三氯甲烷-氨水、三氯甲烷-甲醇-氨水、二氯甲烷-氨水4種混合溶液的提取效率，結果表明含有甲醇的混合溶液的提取效率較低且雜質干擾嚴重，三氯甲烷-氨水和二氯甲烷-氨水混合溶液的提取效率最高且二者無顯著性差異，故選擇了毒性較小的二氯甲烷-氨水混合溶液作為提取溶劑。此外，實驗考察了超聲時間（20，30，40 min）和氨水濃度（40%，50%，100%）對提取效率的影響，最終選擇了以二氯甲烷-40%氨水（25∶1）為提取溶劑，超聲提取20 min作為供試品的提取條件。

3.2 色譜柱，流動相及檢測波長的選擇 實驗考察了Welch Ultimate XB-NH₂柱，Welch Ultimate XB-C₁₈柱，Welch Xtimate_TM-C₁₈柱和Topsil-C₁₈柱等4種色譜柱對各待測成分的分離效能，結果表明使用Welch Xtimate^TM-C₁₈柱可以獲得較為平穩的基線，且各待測成分的峰形較好，故選擇該柱作為分離柱。比較了流動相為乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液和乙腈-0.01 mol·L^-1醋酸銨水溶液系統的分離效能，結果表明，以乙腈-0.01 mol·L^-1醋酸銨水溶液為流動相，其色譜圖的基線較為平穩，各色譜峰的拖尾因子在0.95～1.05；通過優化梯度洗脫條件，10種待測成分能達到較好的分離且純度檢查符合要求，故選擇乙腈-0.01 mol·L^-1醋酸銨水溶液作為流動相的梯度洗脫系統。采用二極管陣列檢測器，于190～400 nm波長對10種待測成分進行全波長掃描，結果表明10種成分在225 nm處均有較大吸收，且色譜圖的基線較為平穩，故選擇225 nm作為檢測波長。

3.3 測定結果分析 本實驗對不同產地不同批次的山豆根藥材中10種成分的含量進行了測定，由含量測定結果可知，8批藥材中苦參堿和氧化苦參堿的總量在7.15～13.5 mg·g^-1，符合2015年版《中國藥典》一部對于山豆根藥材中苦參堿和氧化苦參堿的總含量要求（苦參堿和氧化苦參堿的總量≥0.7%），表明以上8批山豆根藥材均符合中國藥典的質量要求。8批藥材中，7種生物堿類成分的質量分數之和為10.5～16.3 mg·g^-1，3種黃酮類成分的質量分數之和為1.06～2.32 mg·g^-1，10種成分的質量分數之和為12.2～18.7 mg·g^-1，不同批次的山豆根藥材中生物堿和黃酮類成分的質量分數之和具有較大差異。GX-3樣品中苦參堿的質量分數為12.7 mg·g^-1，氧化苦參堿的質量分數為0.784 mg·g^-1，而GZ-1樣品中苦參堿的質量分數為1.99 mg·g^-1，氧化苦參堿的質量分數為5.89 mg·g^-1，山豆根中氧化苦參堿與苦參堿的含量呈現出此消彼長的關系。此外，表3的含量測定數據顯示，GX-3樣品中氧化槐果堿的含量是GX-1樣品中的17.4倍，GX-6樣品中N-甲基金雀花堿的含量是JX-1樣品中的3.37倍，GX-4樣品中槐醇的含量是GX-2樣品中的12.5倍，GX-4樣品中槐果堿的含量是JX-1樣品中的18.1倍，GX-3樣品中三葉豆紫檀苷的含量是JX-1樣品中的5.64倍，GX-4樣品中芒柄花素的含量是GX-1樣品中的5.48倍，JX-1樣品中三葉豆紫檀苷的含量是GX-1樣品中的2.78倍。以上結果表明，10種成分在不同批次的山豆根藥材中的含量差異顯著，其內在質量差異較為明顯，故對山豆根中的多種成分進行同步測定可以更加全面的反映山豆根的內在質量。

山豆根為有毒中藥，據現有文獻報道[2，5]，山豆根中生物堿類成分既是有效成分亦是潛在的毒性成分，尤其以苦參堿和金雀花堿的毒性較強。如何建立山豆根中各種生物堿的含量與其藥效及毒性的內在相關性，有待進一步研究。此外，山豆根中的生物堿類成分并非山豆根的專屬性成分，比如苦參為無毒中藥，但所含生物堿類成分卻與山豆根十分相似。那么，山豆根中的其他類成分，比如黃酮類成分，是否與山豆根的毒性具有相關性，研究報道甚少，亦有待研究。

[參考文獻]

[1] 中國藥典.一部[S]. 2015：27.

[2] 王君明，崔瑛. 山豆根化學成分、藥理作用及毒性研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志，2011，14（4）：229.

[3] 張鳳玲，唐永，張景梅. 苦參堿、氧化苦參堿的藥理作用及其制劑的研究進展[J].河南中醫學院學報，2004，19（112）：84.

[4] 丁佩蘭.山豆根和苦參化學成分的比較研究[D].上海：復旦大學，2004.

[5] 鄭麗娜，孫虎，謝元璋，等. 山豆根化學成分與功效、毒性相互關系的研究進展[J]. 食品與藥品，2011，13（5）：205.

[6] Kajimoto S，Takanashi N，Kaimoto T，et al. Sophoranone，extracted from a traditional Chinese medicine Shandougen，induces apoptosis in human leukemia U937 cells via formation of reactive oxygen species and opening of mitochondrial permeability transition pores [J]. Int J Cancer，2002，99（6）：879.

[7] He C M，Cheng Z H，Chen D F. Qualitative and quantitative analysis of flavonoids in Sophora tonkinensis by LC/MS and HPLC [J]. Chin J Nat Medicines，2013，11（6）： 690.

[8] Aratanechemuge Y，Hibasami H，Katsuzaki H，et al. Induction of apoptosis by maackiain and trifolirhizin （maackiain glycoside） isolated from sanzukon （Sophora subprostrate Chen et T. Chen） in human promyelotic leukemia HL-60 cells [J].Oncol Rep，2004，12 （6）：1183.

[9] 王燕，陶羽，王曉鈺，等. 芒柄花素抑制小鼠Th2型變應性接觸性皮炎的機制分析[J]. 中國實驗方劑學雜志，2016，22（10）：88.

[10] Jin Y M，Xu T M，Zhao Y H，et al. In vitro and in vivo anti-cancer activity of formononetin on human cervical cancer cell line HeLa [J]. Tumor Biol，2014，35 （3）：2279.

[11] 郝學志，劉臣，王新彥. HPLC法測定山豆根中苦參堿及氧化苦參堿的含量[J]. 黑龍江中醫藥，2002（3）： 56.

[12] 馬長華，曹天海. HPLC法測定山豆根中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J]. 藥物分析雜志，2000，20（6）： 408.

[13] 李南，鄧紅，張蜀. UPLC法快速測定山豆根中氧化苦參堿和苦參堿的含量[J]. 今日藥學，2012，22（6）：347.

[14] 丁佩蘭，郁韻秋，王鋼力. RP-HPLC法評價山豆根藥材質量[J]. 復旦學報，2004，31（2）： 208.

[責任編輯 丁廣治]