10批市售僵蠶商品藥材質量評價Δ

趙建國，曲偉紅，余敬謀，呂 璐，張 磊，譚常麗（.九江學院藥學與生命科學學院，江西九江 33005；.九江學院藥學本科008級，江西九江 33005）

·藥品監督·

10批市售僵蠶商品藥材質量評價Δ

趙建國1＊，曲偉紅1，余敬謀1，呂 璐1，張 磊1，譚常麗2（1.九江學院藥學與生命科學學院，江西九江 332005；2.九江學院藥學本科2008級，江西九江 332005）

目的：采用多指標評價市售僵蠶藥材質量狀況，為臨床合理用藥提供參考。方法：按照2015年版《中國藥典》（一部）對市售10批僵蠶藥材外觀性狀進行觀察，對水分、總灰分含量進行測定，采用傅里葉變換紅外光譜法對藥材進行鑒別，采用紫外-可見分光光度法和高錳酸鉀滴定法分別測定有效成分蛋白質和草酸銨的含量。結果：10批僵蠶的水分含量在2.84%～4.07%之間（RSD＜5%，n＝3），總灰分含量在7.79%～34.32%之間（RSD＜5%，n＝3）；紫外和紅外光譜圖基本相似，均能反映出蛋白質多肽類物質的特征峰；蛋白質含量在29.87%～57.19%之間（RSD＜0.5%，n＝3），草酸銨含量在0.27%～4.77%之間（RSD＜5%，n＝3）。結論：10批市售僵蠶均為正品且為炮制品；水分含量符合2015年版《中國藥典》（一部）規定，但總灰分含量未達其要求；其主要成分為蛋白質多肽類物質，但有效組分蛋白質多肽與草酸銨含量差異較大。

僵蠶；傅里葉變換紅外光譜法；蛋白質；草酸銨

僵蠶（Bombyx batryticatus）為蠶蛾科昆蟲家蠶（Bombyx mori Linnaeus）4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌[Beauveria bassiana（Bals.）Vuillant]而致死的干燥體，具有息風止痙、祛風止痛、化痰散結之功效，廣泛用于高溫驚厥、癲癇、抽搐、血管神經性頭痛、咳嗽、哮喘等癥的治療[1]。現代研究表明，僵蠶具有抗凝、抗驚厥、抗癌、抗氧化等多種藥理作用[2-5]。僵蠶化學成分有蛋白質多肽類如白僵菌素、環（D-脯-D-纈）二肽、環（S-脯-R-亮）二肽、環（D-脯-D-異亮）二肽、環（D-脯-D-苯丙）二肽等[6]，黃酮類[7]，多糖類[8]，有機酸類如草酸銨、枸櫞酸銨、脂肪酸、棕櫚酸、赤蘚酸等[1]，甾類如豆甾醇-7，22-二烯-3β，5α，6α-三醇、β-谷甾醇和甾體-11α-羥基化合物等[9]，維生素及18種微量元素等。僵蠶中主要化學成分是蛋白質，含量約為50%，用酸水解法測得僵蠶中含有17種氨基酸殘基，其中甘氨酸含量最高，其次為丙氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酸等[10]。2015年版《中國藥典》（一部）[1]僅從性狀、鑒別、水分、總灰分與醇浸出物的含量等項目對其質量進行分析，并未明確規定有效成分及其含量。

僵蠶為臨床常用的一味動物類中藥，其抗驚厥的主要成分是草酸銨[11]和白僵菌素[3]，其抗凝、抗血栓藥效組分主要為蛋白質多肽類和草酸銨[12-13]。本研究擬采用定性指標（藥材的性狀與光譜特征）、雜質的量（水分與總灰分）和定量指標（蛋白質多肽類和草酸銨含量），對從九江市藥店購買的10批僵蠶樣品進行質量分析與評價，為僵蠶的安全、有效應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TENSOR27傅里葉變換紅外分光光度計，包括DTGS檢測器、OPUS 5.5紅外分析軟件（德國布魯克公司）；UV-1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；BA300電子顯微鏡[麥克奧迪（廈門）電氣股份有限公司]；BT423S電子天平（德國賽多利斯集團）。

1.2 藥材與試劑

僵蠶樣品（購于九江市10家藥店，樣品批號和產地詳見表1）；溴化鉀為光譜純，高錳酸鉀、草酸鈉、濃硫酸、氯化鈣等均為分析純。

表1 僵蠶樣品的批號與產地Tab 1 Batch numbers and origins of B.batryticatus samples

2 方法

2.1 樣品粉末與提取液的制備

僵蠶樣品粉碎成粗粉，過二號篩，備用。分別稱取樣品粉末約10 g，精密稱定，用8倍量的蒸餾水在常溫下超聲（功率：1 000 W）提取2次，每次30 min，合并濾液后用蒸餾水定容至250 mL量瓶中，即得僵蠶提取液，備用。

2.2 性狀觀察

根據2015年版《中國藥典》（一部）規定，直接取僵蠶樣品進行性狀鑒別。

2.3 水分測定

按2015年版《中國藥典》（四部）中0832水分測定法中的第二法（烘干法）測定。具體操作如下：取僵蠶粉末2～5 g，共3份，平鋪于干燥至恒質量的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，精密稱定，開啟瓶蓋在100～105℃干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移至干燥器中，放冷30 min，精密稱定；再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱取質量，至連續2次稱取的質量差異不超過5 mg為止。根據減失的質量計算含水量（%）。含水量（%）＝（干燥前質量－干燥后質量）/干燥前質量×100%。2015年版《中國藥典》（一部）規定含水量不超過14%為合格。

2.4 總灰分測定

按2015年版《中國藥典》（四部）中2302灰分測定法測定。具體操作如下：取僵蠶粉末3 g，共3份，置熾灼至恒質量的坩堝中，稱定質量（準確至0.001 g），于電爐上進行炭化，至炭化完全隨即冷卻后，轉移至馬弗爐中，逐漸升溫至600℃，使完全灰化，降溫至200℃后從爐中取出放入干燥器中冷卻至恒質量，稱定并計算其總灰分含量（%）。總灰分含量（%）＝（灼燒前質量－灼燒后質量）/灼燒前質量×100%。2015年版《中國藥典》（一部）規定灰分不超過6%為合格。

2.5 紅外光譜測定

采用溴化鉀壓片的傅里葉變換紅外光譜法測定。稱取適量經105℃恒溫干燥的樣品粉末，與溴化鉀粉末按比例（1∶150，m/m）充分混勻，于瑪瑙研缽中研磨，用粉末壓片機壓制成半透明溴化鉀晶片，在4 000～400 cm－1范圍內進行掃描（分辨率為2 cm－1，掃描次數32次），得到紅外光譜圖。采用OPUS 5.5紅外分析軟件對光譜圖進行基線校正和歸一化疊加處理。

2.6 蛋白質含量測定

采用紫外-可見分光光度法測定。精密量取“2.1”項下僵蠶提取液1 mL，共3份，置于50 mL量瓶中，加蒸餾水定容，于200～400 nm波長范圍內掃描，記錄光譜圖和260 nm、280 nm波長處的吸光度值（記為A260、A280）。其中，蛋白質質量濃度（mg/mL）＝1.45A280－0.74A260；蛋白質質量含量（%）＝（蛋白質質量濃度×溶液體積×稀釋倍數）/（僵蠶粉末質量×1 000）×100%。

2.7 草酸銨含量測定

采用高錳酸鉀滴定法[8]測定。精密量取“2.1”項下僵蠶提取液6 mL，共3份，置于10 mL離心試管中，加2 mL蒸餾水，于75℃水浴中滴加氯化鈣溶液（0.25 mol/ L）3 mL，使草酸鈣完全沉淀，放冷，離心（離心半徑為6 cm，2 000 r/min，下同）20 min。加約8 mL蒸餾水洗滌1次后離心20 min，用吸管吸去上清液，沉淀用1 mol/L的硫酸15 mL溶解后轉移至250 mL錐形瓶中。用0.2 mmol/L的高錳酸鉀標準溶液滴定，溶液由無色變為淺紅色即為滴定終點。根據消耗高錳酸鉀標準溶液的體積計算出草酸銨含量（草酸根88.1%以草酸銨形態存在，11.9%以其他陽離子鹽形態存在）。草酸銨含量（%）＝（5×6 mL僵蠶提取消耗的高錳酸鉀體積×高錳酸鉀滴定液的濃度×草酸銨的摩爾質量×250×0.881）/（2× 6×僵蠶粉末的質量）×100%。

3 結果

3.1 性狀觀察結果

所有僵蠶樣品均略呈圓柱形，多彎曲皺縮，長2～5 cm，直徑0.5～0.7 cm。表面灰黃色，被有白色粉霜狀的氣生菌絲和分生孢子。其中，3、6、10號樣品表面的石灰粉覆蓋較明顯，10號樣品可見明顯蟲眼，詳見圖1。僵蠶頭部較圓，足8對，體節明顯，尾部略呈二分歧狀。質硬而脆，易折斷，斷面平坦，外層白色，中間有亮棕色或亮黑色的絲腺環4個，氣微腥，味微咸。

3.2 水分與總灰分測定結果

10批僵蠶樣品的水分、總灰分含量分別在2.84%～4.07%、7.79%～34.32%之間，RSD分別在0.67%～3.97%（n＝3）、0.19%～2.90%（n＝3）之間，詳見表2。

圖1 僵蠶的外觀性狀Fig 1 Appearance characters of B.batryticatus samples

表2 僵蠶水分、總灰分測定結果（n＝3，%%）Tab 2 Determination results of moisture and total ash in B.batryticatus samples（n＝3，%%）

3.3 紅外光譜測定結果

10批僵蠶樣品的紅外光譜圖相似，其中在4 000～1 250 cm－1范圍內共有峰6個，分別為3 450～3 200、1 644、1 533、2 925、2 855、1 445 cm－1。指紋區1 250～400 cm－1范圍稍有差異，詳見圖2。

圖2 10批僵蠶樣品的紅外光譜圖Fig 2 FTIR spectra of 10 batches of B.batryticatus samples

3.4 蛋白質與草酸銨測定結果

10批僵蠶樣品在200～400 nm波長范圍內紫外吸收光譜相似，均有2個最大吸收峰，分別為210～220、260～280 nm，詳見圖3。10批僵蠶樣品蛋白質與草酸銨含量分別在29.87%～57.19%、0.27%～4.77%之間，RSD分別為0.02%～0.10%（n＝3）、0.54%～4.55%（n＝3）。其中，10號樣品蛋白質含量最高，7號樣品蛋白質含量最低；1號樣品草酸銨的含量最高，而3號樣品草酸銨的含量最低，詳見表3。

4 討論

圖3 10批僵蠶樣品的紫外吸收光譜圖Fig 3 UV-Vis spectra of 10 batches of B.batryticatus samples

表3 10批僵蠶樣品蛋白質與草酸銨含量測定結果（n＝3，%%）Tab 3 Determination results of proteins and ammonium oxalate in 10 batches of B.batryticatus samples（n＝3，%%）

本次檢驗所分析藥材的性狀符合2015年版《中國藥典》（一部）對僵蠶性狀的描述，判斷均為正品且為炮制品。10號樣品可見明顯的蟲眼且中空，外觀質量較差。僵蠶樣品的水分含量在2.84～4.07%之間，低于2015年版《中國藥典》（一部）標準14%，符合規定。而總灰分含量在7.79%～34.32%之間，高于2015年版《中國藥典》（一部）標準6%，不符合規定。總灰分含量高可能與僵蠶原藥材中添加了較多的石灰粉有關。

10批僵蠶樣品的紅外光譜圖在4 000～1 250 cm－1范圍內共有峰6個，其中3 450～3 200 cm－1是N—H、O—H伸縮振動峰，1 644 cm－1和1 533 cm－1是蛋白質酰胺Ⅰ帶C＝O的伸縮振動峰和酰胺Ⅱ帶N—H的彎曲振動和C—N的振動峰，2 925 cm－1、2 855 cm－1和1 445 cm－1是CH3、CH2的吸收峰，結果與僵蠶的主成分是蛋白質的結果相符[14]。10批藥材在200～400 nm波長范圍內有2個最大吸收峰，其中210～220 nm是肽鍵的特征吸收，260～280 nm是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸殘基的吸收峰。根據紅外光譜法和紫外光譜法結果，判斷僵蠶的主要化學成分是蛋白質多肽類物質。

以上結果表明，市售僵蠶基本上是正品且為炮制品，其主成分為蛋白質多肽類物質，含量在29.87%～57.19%之間，草酸銨的含量在0.27%～4.77%之間，質量差異較大，這可能與藥材的炮制方法不同有關。僵蠶質量主要存在兩個問題：一是原藥材中摻入較多的石灰粉以增加質量；二是有效組分蛋白質多肽與草酸銨含量差異較大。草酸銨和蛋白質含量反映藥理作用強弱，可作為評價其質量的指標之一。本文為僵蠶的定性鑒定和定量測定提供了依據，同時為主成分為蛋白質多肽類物質的動物藥材的質量評價提供了參考。

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Quality Evaluation of 10 Batches of Bombyx batrhticatus Medicinal Materials in the Market

ZHAO Jianguo1，QU Weihong1，YU Jinmou1，LYU Lu1，ZHANG Lei1，TAN Changli2（1.College of Pharmacy and Life Sciences，Jiujiang University，Jiangxi Jiujiang 332005，China；2.Grade 2008，Pharmacy Undergraduate，Jiujiang University，Jiangxi Jiujiang 332005，China）

OBJECTIVE：To evaluate the quality of Bombyx batryticatus medicinal materials in the market by multi-index，and provide reference for clinical rational drug use.METHODS：Referring to the Chinese Pharmacopoeia（2015 edition，part 1），the appearance characters of samples were observed，moisture and the total ash were detected，Fourier transform infrared spectroscopy was adopted to identify the medicinal materials，UV-Visible spectrophotometry and potassium permanganate titration were respectively used to determine the contents of active ingredient protein and ammonium oxalate.RESULTS：The moisture ranged in 2.84%-4.07%（RSD＜5%，n＝3），total ash in 7.79%-34.32%（RSD＜5%，n＝3），UV and FTIR spectra were basically similar，and both can reflect the characteristic peaks of protein peptides.Protein content ranged in 29.87%-57.19%（RSD＜0.5%，n＝3），ammonium oxalate content in 0.27%-4.77%（RSD＜5%，n＝3）.CONCLUSIONS：The 10 batches of samples are authentic and processed products，moisture fits the requirement in pharmacopoeia while total ash does not；and the main ingredient is protein peptides.However，effective protein polypeptide content shows great differences as well as ammonium oxalate.

Bombyx batryticatus；Fourier transform infrared spectroscopy；Protein；Ammonium oxalate

R931.74

A

1001-0408（2017）10-1399-04

2016-04-26

2016-09-29）

（編輯：劉明偉）

江西省衛生計生委中醫藥科研課題（No.2014A119）；九江學院校級科研課題（No.KJ201008）

＊副教授，碩士。研究方向：中藥質量標準。E-mail：zhaojg10000@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.28