丙泊酚尾靜脈泵注對骨髓間充質(zhì)干細胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的影響

周亞凈 劉建敏 曹建明 郝麗娜 侯少科 穆 麗 徐麗輝

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院麻醉科，河北 邢臺 054001)

丙泊酚尾靜脈泵注對骨髓間充質(zhì)干細胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的影響

周亞凈 劉建敏1曹建明1郝麗娜 侯少科 穆 麗2徐麗輝1

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院麻醉科，河北 邢臺 054001)

目的 檢測丙泊酚尾靜脈泵注對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的影響。方法 建立80只成年的Wistar大鼠脊髓損傷模型，用隨機數(shù)字表法分為4組。①BMSC移植組經(jīng)尾靜脈泵注等體積BMSC細胞液。②對照組尾靜脈注入培養(yǎng)液組。③丙泊酚組：丙泊酚注射液(2 ml·kg-1·h-1)尾靜脈滴注4 h；④聯(lián)合組尾靜脈注射BMSC細胞后，經(jīng)尾靜脈泵注丙泊酚注射液(2 ml·kg-1·h-1)持續(xù)4 h。依次于術(shù)前、術(shù)后1、3 d與1～4 w通過斜板試驗、改良Tarlov 評分進行運動功能評定、運動功能量表(BBB)評分。術(shù)后4 w取材進行病理切片HE染色及熒光顯微鏡觀測CM-Dil標記的分布及BMSC存活情況。使用熒光金逆行追蹤法檢測脊髓損傷區(qū)神經(jīng)纖維的再生，并且使用透射電鏡法觀測神經(jīng)軸突的生長。結(jié)果 造模后，大鼠下肢運動功能評價聯(lián)合組優(yōu)于BMSC移植組及丙泊酚組，BMSC移植組和丙泊酚組優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HE染色，對照組可見脊髓組織缺失及脊髓空洞形成，無神經(jīng)軸索通過。BMSC移植組和丙泊酚組損傷區(qū)可見少量神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)，脊髓空洞較小，聯(lián)合組可見較多神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)，未見脊髓空洞。術(shù)后4 w，熒光金陽性神經(jīng)纖維數(shù)和CM-Dil陽性細胞：對照組最少，BMSC移植組和丙泊酚組次之，聯(lián)合組最多，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。透射電鏡觀察，BMSC移植組和丙泊酚組橫斷面正中可見新生的無髓及有髓神經(jīng)纖維，聯(lián)合組無髓及有髓神經(jīng)纖維數(shù)多于其他組，對照組電鏡下有髓及無髓神經(jīng)纖維數(shù)最少。結(jié)論 丙泊酚尾靜脈泵注可以提高向神經(jīng)功能細胞分化及移植的BMSC在脊髓損傷區(qū)的存活，促進BMSC移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的效果。

骨髓間充質(zhì)干細胞；丙泊酚；脊髓損傷；移植；治療；修復(fù)

脊髓損傷具有病情重、發(fā)病急、致殘率、致死率高，預(yù)后差等特點，如何在臨床工作中有效治療脊髓損傷,降低致殘率及死亡率，達到最佳功能康復(fù)，改善患者預(yù)后仍然是一個困擾著神經(jīng)外科醫(yī)生的重大難題〔1,2〕。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在一定條件下可以被誘導(dǎo)分化為各種神經(jīng)功能細胞，在移植后起到修復(fù)神經(jīng)損傷的作用，為臨床治療脊髓損傷提供了新思路〔3〕。丙泊酚是具有神經(jīng)保護作用的麻醉藥物，其在脊髓損傷治療中的應(yīng)用引起研究者的關(guān)注。本研究討論丙泊酚尾靜脈泵注對移植BMSC修復(fù)大鼠脊髓損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 1只雌雄不限1個月齡Wistar大鼠，80只成年雌性，體重200～250 g健康Wistar大鼠〔許可證號SCXK(冀)20080004〕，該大鼠購于河北省實驗動物中心；L-DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco BRL公司產(chǎn)品)；胎牛血清(FBS)(Hyclone公司產(chǎn)品)；0.01 mol/L PBS(粉劑，pH7.2)(上海信然生物技術(shù)有限公司)； EDTA(天津市化學(xué)試劑一廠)；胰蛋白酶(GibcoBRL公司)；細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma 公司)。CM-Dil、谷氨酰胺(美國Sigma公司)；熒光金(aminostilbamidine，methanesulfonate)(Invitrogen，美國)

1.2 大鼠BMSC的培養(yǎng)及鑒定 1只1個月齡的Wistar大鼠處死后，將其浸入75%的酒精容器中進行徹底消毒，約為10 min。在確保無菌操作情況下取大鼠雙側(cè)脛骨及股骨,切除兩側(cè)的骨端,通過含5%胎牛血清1 ml的DMEM完全培養(yǎng)基自一端清洗骨髓腔,制成單細胞懸液,細胞數(shù)為3×104個/ml，接種于100 ml的培養(yǎng)瓶中，于飽和濕度37℃、5%的CO2的孵育箱中培養(yǎng),在 24 h后進行全量換液，3 d換液1次并按1∶2的比例進行傳代。每天用顯微鏡觀察細胞的生長情況，當細胞融合到80%以上時，接而進行再次傳代，按1∶3比例進行。進行多次傳代培養(yǎng)擴增后，該其BMSC逐漸純化。用流式細胞儀法觀察表面抗原鑒定BMSCs。

1.3 CM-Dil標記BMSC 在避光后吸取5 μl的CM-Dil液，加入1.5 ml的EP管中，再加入1ml含5%胎牛血清的完全培養(yǎng)液，混勻后，即得CM-Dil標記液。提取貼壁并且融合達80%的BMSC，吸棄培養(yǎng)液后，加入上述標記液40 μl/cm2，用PBS清洗3次，飽和濕度37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱孵育20 min，再吸棄標記液，加入5 ml 37℃的含5%胎牛血清完全培養(yǎng)液，孵育10 min吸棄后，再加入含5%胎牛血清完全培養(yǎng)液清洗3次。在熒光顯微鏡下于檢測培養(yǎng)24 h后，BMSC標記形態(tài)和CM-Dil標記效果。傳代時取適量的BMSC由流式細胞儀測CM-Dil的標記率。

1.4 動物模型的建立及分組 80只體重200～250 g的雌性Wistar大鼠，在實驗室中飼養(yǎng)2 w后，用10%的水合氯醛按照350 mg/kg腹腔注射麻醉，俯臥位將大鼠固定在實驗平臺上，腰背部備皮滿意后，按T8～9棘突為切口中心，自大鼠背部正中逐層切開，咬除T8～9棘突和部分椎板，充分顯露T7～10的椎板和棘突，將其暴露硬膜保持完整，作為損傷區(qū)。運用改良的Allen法打擊〔3,4〕，將由2.5 cm高度處10 g的重物自由落下，撞擊脊髓組織及大鼠硬膜(術(shù)后雙下肢癱瘓且大鼠尾巴痙攣擺動表明成功)。雙氧水清洗傷口，然后逐層縫合背部切口。在術(shù)后每天擠尿2～3次，直至大鼠恢復(fù)了排尿反射為止。動物分組：隨機數(shù)字表法分為每組20只，共4組 。在其建模后6 h運用1 ml注射器經(jīng)尾靜脈注入不同的移植液：BMSC組為注射1 ml BMSC(3×106個)懸液移植組。對照組為注射1 ml培養(yǎng)液組。聯(lián)合組：在尾靜脈注射1 ml BMSC(3×106個)懸液的同時通過尾靜脈留置針持續(xù)泵注丙泊酚注射液(2 ml·kg-1·h-1)持續(xù)4 h。丙泊酚組：運用尾靜脈留置針泵注丙泊酚注射液(2 ml·kg-1·h-1)持續(xù)4 h。

下肢運動功能評價：所有大鼠均在造模前、后1、3 d、1、2、3、4 w對4組大鼠進行運動功能評定。評定項目〔5,6〕包括改良Tarlov評分〔4〕，運動功能量表(BBB)評分〔7,8〕,斜板試驗〔9〕。評定時間均統(tǒng)一為上午8∶00開始。評分均為兩人合評。使用雙盲法對4組大鼠進行評分，分別于術(shù)前、術(shù)后1、3 d與1～4 w對4組大鼠進行檢測，共分析6次，取平均值。

1.5 HE及熒光顯微鏡觀察 造模后4 w，4組均處死5只大鼠，取材行免疫組織化學(xué)和HE染色，10%水合氯醛350 mg/kg麻醉滿意后剖胸，完全的表露了大鼠的心臟，運用升主動脈插管，首先剪開右心耳后用生理鹽水清洗，其次4%多聚甲醛再固定后，完整地取出損傷區(qū)的脊髓組織，取損傷部位的脊髓組織約1 cm，在酒精梯度脫水后行脊髓的縱行冰凍切片，其厚度為20 μm。進行HE染色：在蘇木素染色5 min后，經(jīng)自來水清洗，使用鹽酸酒精分化10 s，再次使用伊紅染色7 min，自來水沖洗10 min，自來水洗后，以梯度酒精脫水，通過二甲苯透明，用中性樹膠封片。在各組脊髓損傷處組織實行常規(guī)冰凍切片后，用熒光顯微鏡分析。然后隨機取10個視野，于高倍鏡下(×200)觀察，分析各個視野陽性細胞數(shù)，取均值作為各組陽性CM-Dil細胞數(shù)。

1.6 熒光金逆行追蹤 在大鼠脊髓損傷術(shù)后4 w，4組分別隨機取6只大鼠，麻醉滿意后于股外側(cè)肌間隙完全顯露坐骨神經(jīng)后，每側(cè)坐骨神經(jīng)按照0.1 μl/min的注射速度注射0.4 μl的 2%的熒光金，運用止血鉗夾挫大鼠傷坐骨神經(jīng)后，坐骨神經(jīng)的挫傷區(qū)多處于避光下條件經(jīng)微量注射器注射熒光金，注射時留針5 min，使用8萬U的青霉素鹽水反復(fù)清洗切口后，逐層縫合，術(shù)后進行正常飼養(yǎng)。1 w后對脊髓損傷區(qū)進行組織學(xué)觀察。將30%的蔗糖保存于4℃的冰箱過夜，次日-18℃條件下通過OCT 冰凍切片包埋后行20 μm冠狀面和橫斷面的冰凍切片，各切片分別于高倍鏡(×200)下任取10個視野，檢測每個視野中熒光金標記的神經(jīng)纖維數(shù)，取其平均值作為各組的熒光金陽性神經(jīng)纖維數(shù)。

1.7 透射電鏡觀察 在大鼠脊髓損傷術(shù)后4 w,四組各隨機抽取大鼠6只,用2.5%的戊二醛固定過夜，經(jīng)心給大鼠灌注2.5%的戊二醛后取材，取脊髓損傷區(qū)中心脊髓組織寬1 mm，長1 cm，鋨酸4℃下固定2 h，經(jīng)反復(fù)漂洗后，使用丙酮梯度脫水，經(jīng)環(huán)氧樹脂6101包埋后，4℃條件下醋酸鈾染色4 h，進行透射電鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行LSD法單因素方差分析及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 BMSC形態(tài)觀察 經(jīng)5 d培養(yǎng)后，培養(yǎng)瓶中集落數(shù)及BMSC明顯增多。傳1～3代的BMSC增殖活躍，可見大多數(shù)細胞傳代培養(yǎng)后呈單層貼壁生長，多為大多角形、梭形或三角形，BMSC形態(tài)逐漸保持一致，以梭形BMSC為主，折光性強，可見兩個或多個突起，核仁及細胞核可見，細胞融合后，平行狀或旋渦狀生長，見圖1。 流式細胞儀分析CD29、CD44、CD166、CD105表達陽性，CD34、CD86、CD80陰性，BMSCs的均一性好，純度達95%以上。

原代

第三代

2.2 下肢運動功能評價結(jié)果 見表1。術(shù)前全部大鼠的BBB評分、改良的Tarlov評分及斜板試驗差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)相關(guān)治療后，BMSC組、丙泊酚組、聯(lián)合組三項評分在各時間點(造模后2～4 w)較對照組都明顯增加(P<0.05)。而聯(lián)合組三項評分在術(shù)后2～4 w較丙泊酚組、BMSC組高(P<0.05)。

組別損傷前損傷后1d3d1w2w3w4wBBB評分 對照組21.00±0.000.00±0.001.24±0.062.44±0.698.35±1.4711.11±1.3213.78±0.66 BMSC組21.00±0.000.00±0.002.41±0.073.90±1.0010.23±1.501)2)12.68±1.761)2)15.12±0.141)2) 丙泊酚組21.00±0.000.00±0.002.43±0.043.95±1.0110.25±1.281)2)12.15±1.431)2)15.22±0.141)2) 聯(lián)合組21.00±0.000.00±0.003.42±0.076.10±1.0312.29±1.231)14.75±1.321)17.56±0.221)2)斜板試驗 對照組42.50±2.3415.82±1.6416.49±1.3421.83±2.1322.91±2.1426.21±2.3228.12±1.43 BMSC組42.50±1.5416.76±2.1918.91±1.5424.58±2.2130.22±2.301)2)34.53±2.061)2)38.63±2.121)2) 丙泊酚組42.50±2.3116.84±2.1718.83±1.5124.65±1.4330.32±2.091)2)34.25±2.341)2)38.22±2.211)2) 聯(lián)合組42.51±2.7318.53±2.5421.59±2.0225.42±2.2133.49±2.381)38.51±2.521)41.41±2.291)改良Tarlov評分 對照組5.00±0.000.00±0.000.41±0.140.82±0.131.63±0.322.45±0.222.66±0.54 BMSC組5.00±0.000.00±0.000.72±0.181.58±0.192.79±0.321)2)3.60±0.201)2)3.88±0.321)2) 丙泊酚組5.00±0.000.00±0.000.73±0.191.61±0.202.80±0.531)2)3.61±0.191)2)3.87±0.291)2) 聯(lián)合組5.00±0.000.00±0.000.82±0.181.84±0.153.03±0.331)3.45±0.221)4.15±0.211)

與同時期對照組比較：1)P<0.05；與同時期聯(lián)合組比較：2)P<0.05

2.3 HE染色和熒光顯微鏡觀察 大鼠脊髓損傷造模后4 w，光鏡下,對照組脊髓損傷區(qū)可見脊髓組織斷裂，為瘢痕連接，有明顯空洞形成。丙泊酚組及BMSC組的組織空洞較聯(lián)合組大，較對照組小。聯(lián)合組損傷處脊髓組織空洞幾乎消失，見圖2。聯(lián)合組及BMSC組熒光顯微鏡下均可見散在的CM-DIL染色陽性的紅色熒光：丙泊酚組(0±0.00)個/高倍視野，對照組(0±0.00)個/高倍視野，BMSC組(23.56±9.48)個/高倍視野，聯(lián)合組(42.58±8.60)個/高倍視野，BMSC組及聯(lián)合組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，丙泊酚組和對照組、聯(lián)合組和BMSC組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

2.4 FG皮質(zhì)脊髓束逆行追蹤 對照組大鼠脊髓損傷區(qū)頭側(cè)端FG 標記的陽性神經(jīng)纖維數(shù)為(9.3±3.2)個；BMSC組為(26.3±3.4)個；丙泊酚組為(25.3±4.2)個，聯(lián)合組為(42.6±5.1)個，見圖4。與對照組比，聯(lián)合組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與對照組相比，丙泊酚組、BMSC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

對照組

對照組

丙泊酚組

BMSC組

聯(lián)合組

對照組

BMSC組

丙泊酚組

聯(lián)合組

2.5 透射電鏡 通過透射電鏡檢測表明術(shù)后4 w，對照組可見少量有髓神經(jīng)纖維及膠質(zhì)瘢痕，巨噬細胞吞噬變性壞死的有髓神經(jīng)纖維。在聯(lián)合組的透射電鏡分析可見大量的無髓神經(jīng)纖維及有髓神經(jīng)纖維，數(shù)量軸突的較多，再生軸突可見完整髓鞘。丙泊酚組及BMSC組的大鼠脊髓損傷區(qū)中可見到較多的無髓神經(jīng)纖維及有髓神經(jīng)纖維，較聯(lián)合組少而多于對照組，見圖5。

對照組

聯(lián)合組

BMSC組

丙泊酚組

3 討 論

社會現(xiàn)代科技的高速發(fā)展,脊髓損傷作為神經(jīng)外科的常見疾病，是一個極其復(fù)雜的病理生理過程，不但發(fā)病急、病情變化迅速，致殘率、預(yù)后差及致死率高，給家庭以及社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔〔10〕。急性脊髓損傷后早期微循環(huán)障礙導(dǎo)致局部缺血缺氧并發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)，腫瘤壞死因子α、白細胞介素1等炎癥因子被大量激活，小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的增殖、活化、遷徙，形成繼發(fā)細胞毒性并形成瘢痕，持續(xù)的脊髓代謝紊亂缺血及缺氧，不利于軸突及神經(jīng)元的再生，最終導(dǎo)致繼發(fā)性脊髓損傷〔10,11〕。

目前臨床上治療脊髓損傷的主要方式是理療康復(fù)方法及營養(yǎng)神經(jīng)挽救損傷區(qū)及周圍瀕臨壞死的神經(jīng)元，促進神經(jīng)元功能的修復(fù)，逆轉(zhuǎn)脊髓的缺血缺氧〔12〕。但人脊髓損傷不具有自我修復(fù)神經(jīng)元的能力,因此治療效果不理想〔13〕。伴隨著脊髓損傷組織工程研究的不斷深入，又發(fā)現(xiàn)存在于骨髓、臍帶血、外周血、胎盤等多種組織的BMSCs是一類特殊的干細胞，在一定條件誘導(dǎo)下具有自我更新、多向分化、遷移的能力〔14〕,能在體外分化培養(yǎng)擴增為多種遺傳穩(wěn)定的組織細胞,包括成神經(jīng)元、成軟骨細胞、脂肪細胞、骨細胞、肌肉細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等〔15〕，所以作為理想的神經(jīng)元移植供體BMSCs移植后分化成神經(jīng)膠質(zhì)及神經(jīng)元，修復(fù)受損的神經(jīng)元，為了進一步治療脊髓損傷展現(xiàn)了一種更為有效的新方法〔16〕。宿主體內(nèi)移植存活的BMSCs在受損傷脊髓部位產(chǎn)生和釋放趨化因子的影響向損傷區(qū)域遷移、聚集，分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，分泌多種生長因子，抑制炎癥因子的表達，保護并促進神經(jīng)元的再生重構(gòu)，誘導(dǎo)損傷區(qū)域微血管的再生，降低局部的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，而其分化的反應(yīng)性神經(jīng)細胞有治療脊髓損傷的作用〔17〕。

丙泊酚能夠抑制自由基的生成，具有抗氧化活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成,阻礙于自由基的級鏈反應(yīng)，因此丙泊酚可以降低神經(jīng)氧代謝率，調(diào)解特定細胞通路，S100β蛋白是神經(jīng)組織中的一種酸性鈣結(jié)合蛋白，該研究說明脊髓損傷后血清S100β蛋白含量的增加，早期應(yīng)用丙泊酚可以減低血清S100β蛋白含量，減少脊髓組織總鈣含量，降低脊髓含水量，在一定程度上提供神經(jīng)保護作用〔18〕。

本研究顯示，丙泊酚尾靜脈泵注可以有效提高BMSC在向神經(jīng)功能細胞的分化及脊髓損傷區(qū)的存活率，優(yōu)化BMSC移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的效果，在進一步臨床工作中將會成為治療脊髓損傷的新方法和思路。

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〔2016-03-18修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

1 河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科 2 河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院手術(shù)室

周亞凈(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事麻醉學(xué)研究。

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A

1005-9202(2017)07-1598-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.014