苯并硫雜蒽衍生物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞作用的拉曼光譜研究

徐 寧，董瑩瑩，魏船河，徐 玲(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

苯并硫雜蒽衍生物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞作用的拉曼光譜研究

徐 寧，董瑩瑩，魏船河，徐 玲
(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

苯并硫雜蒽衍生物是一種可特異性與細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)凋亡的靶向小分子化合物.為了理解該靶向小分子化合物對(duì)Hela細(xì)胞的作用機(jī)制，從分子水平區(qū)分經(jīng)小分子處理和未經(jīng)處理的Hela細(xì)胞，將苯并硫雜蒽衍生物和HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞的拉曼光譜變化.結(jié)果表明：苯并硫雜蒽衍生物作用24 h后，HeLa細(xì)胞代表蛋白質(zhì)的主鏈和側(cè)鏈、核酸、脂類的拉曼譜帶都發(fā)生了一定的改變，經(jīng)不同濃度苯并硫雜蒽衍生物處理的細(xì)胞拉曼光譜間有顯著區(qū)別，其中1.6 μmol/L組尤其明顯.

苯并硫雜蒽衍生物；人宮頸癌細(xì)胞；拉曼光譜

Hela細(xì)胞是人宮頸癌細(xì)胞株，已被廣泛運(yùn)用于抗腫瘤化合物的篩選.苯并硫雜蒽類分子在其母體結(jié)構(gòu)引入烷氨基側(cè)鏈后，是一類水溶性好、細(xì)胞毒性低和抗腫瘤活性強(qiáng)的小分子化合物，具有靶向細(xì)胞核內(nèi)DNA，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞包括Hela細(xì)胞凋亡的作用[1].雖然當(dāng)前用來(lái)研究細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的主要手段是流式細(xì)胞術(shù)和激光掃描共聚焦熒光顯微鏡，但該方法制備樣本過(guò)程繁瑣，需要熒光標(biāo)記抗體或熒光標(biāo)記探針并長(zhǎng)時(shí)間與細(xì)胞反應(yīng)，因此在細(xì)胞凋亡或其他細(xì)胞的行為等分子機(jī)制研究中的應(yīng)用受到一定的限制.而拉曼光譜分析由于它的非破壞性、高度敏感性等優(yōu)點(diǎn)，在提供分子生化信息組成、相互作用和細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)生理?xiàng)l件等方面，已經(jīng)成為一個(gè)有用的工具.拉曼光譜也是分析生物材料中蛋白質(zhì)、核酸、脂類以及碳水化合物等大分子結(jié)構(gòu)變化的有力手段.拉曼光譜特征峰的強(qiáng)度、峰寬和位置可提供分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)等信息，反映分子中不同的化學(xué)鍵或官能團(tuán)[2].

為了探究拉曼光譜區(qū)分苯并硫雜蒽衍生物處理與未處理Hela細(xì)胞的可行性，在分子層面上探討其對(duì)Hela細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)理，為抗癌藥物的篩選提供一種新方法和新思路，筆者對(duì)苯并硫雜蒽衍生物處理24 h后的Hela細(xì)胞進(jìn)行了拉曼光譜特性研究.

1 材 料

1.1 化合物及細(xì)胞來(lái)源

苯并硫雜蒽衍生物由浙江工業(yè)大學(xué)張文教授實(shí)驗(yàn)室合成贈(zèng)送，分子量424.10；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640購(gòu)自吉泰生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司.

N-(N′-N′-二甲胺基丙基)苯并[k,l]硫雜蒽-3,4-二甲酰亞胺鹽酸鹽(N-(3-(dimethylamino)propyl)benzo[k,l]thioxanthene-3,4-dicarboximidehydrochloride)，化學(xué)式C23H21N2O2ClS+，由浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室合成，結(jié)構(gòu)式為

1.2 顯微共聚焦拉曼光譜儀

Renishawinvia Reflex型拉曼光譜儀自帶顯微鏡，使用標(biāo)準(zhǔn)陣列CCD探測(cè)器，Ar+為光源.WiRE 3.2軟件獲取光譜.

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Hela細(xì)胞接種至裝有1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS))的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、相對(duì)濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至六孔板，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞爬片.24 h后每孔分別加入0.4，0.8，1.6，4.0 μmol/L的苯并硫雜蒽衍生物，同時(shí)設(shè)置不加任何化合物的空白對(duì)照組.培養(yǎng)24 h后吸去上清，用PBS緩沖液洗滌兩次，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精固定爬片細(xì)胞30 min，-20 ℃保存待測(cè).

2.2 苯并硫雜蒽衍生物溶液的制備

取4.5 mg苯并硫雜蒽衍生物溶解于1 059 μL二甲基亞砜(DMSO)中，超聲微熱使樣品完全溶解，得到10 mmol/L的化合物儲(chǔ)存液，-20 ℃保存.處理細(xì)胞時(shí)，將苯并硫雜蒽衍生物用DMSO稀釋至所需濃度.

2.3 拉曼光譜檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

激發(fā)波長(zhǎng)514 nm，物鏡50×，功率25 mW，曝光10 s，累積2次，掃描范圍為400～3 200 cm-1.將固定有細(xì)胞的載玻片置于鏡下，調(diào)整焦距將聚焦點(diǎn)對(duì)于細(xì)胞處.選取形態(tài)正常的Hela細(xì)胞，取細(xì)胞內(nèi)任意三點(diǎn)獲取光譜并進(jìn)行平均，每個(gè)濃度組重復(fù)選擇10個(gè)以上細(xì)胞檢測(cè).

實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)使用Labspec 5或wire 3.2軟件進(jìn)行處理(光滑、去基底、歸一化等).origin軟件畫圖.所有光譜扣除苯并硫雜蒽衍生物所產(chǎn)生的熒光本底.

3 結(jié)果與分析

3.1 掃描區(qū)域以及拉曼光譜原始圖

酒精固定好的Hela細(xì)胞爬片經(jīng)顯微拉曼光譜檢測(cè)，對(duì)照組和經(jīng)1.6 μmol/L苯并硫雜蒽衍生物作用24 h后的實(shí)驗(yàn)組Hela細(xì)胞的顯微圖像及拉曼光譜如圖1所示.

圖1 Hela細(xì)胞顯微圖像及其拉曼原始譜圖Fig.1 The Hela cells and their Raman original spectrum

3.2 拉曼光譜數(shù)據(jù)的處理

Wire軟件可自動(dòng)或手動(dòng)調(diào)平所得拉曼光譜基線，以利于互相比較.在檢測(cè)時(shí)，由于宇宙射線等原因造成原始拉曼光譜出現(xiàn)鬼峰，都用軟件去除，結(jié)果如圖2所示.

1—原始拉曼光譜；2—調(diào)基線；3—去除鬼峰圖2 拉曼原始譜預(yù)處理Fig.2 The Raman spectrum preprocessing

3.3 400～1 800 cm-1拉曼光譜峰的解析

3.3.1 不同濃度苯并硫雜蒽衍生物處理后的Hela細(xì)胞拉曼光譜

由于細(xì)胞在1 800 cm-1之后有很長(zhǎng)一段拉曼光譜無(wú)反應(yīng)區(qū)，這一部分的拉曼光譜隨著苯并硫雜蒽衍生物濃度的增加，熒光本底以及干涉條紋的干擾明顯增強(qiáng).因此我們截取了400～1 800 cm-1部分進(jìn)行分析，這一區(qū)域豐富的拉曼峰代表核酸、蛋白質(zhì)以及脂類的信息.不同濃度苯并硫雜蒽衍生物處理后的Hela細(xì)胞拉曼光譜如圖3所示.

圖3 不同組別Hela細(xì)胞拉曼光譜(514 nm, 350～1 750 cm-1)Fig.3 The Raman spectrum of different groups(514 nm,350～1 750 cm-1)

3.3.2 拉曼峰歸屬

Hela細(xì)胞的拉曼光譜峰歸屬見表1.

表1 HeLa細(xì)胞的拉曼光譜峰歸屬Table 1 The Raman spectra peaks assigment of Hela cells

3.3.3 譜帶分析

1) 核 酸

2) 氨基酸與蛋白質(zhì)

如圖4所示，570 cm-1的譜線未發(fā)生移動(dòng)，但強(qiáng)度降低.根據(jù)既往文獻(xiàn)，相同分子振動(dòng)能量結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的散色光，不同濃度的化合物可改變色氨酸的分子振動(dòng)能量結(jié)構(gòu)[13]，提示高濃度的苯并硫雜蒽衍生物破壞了Hela細(xì)胞的部分分子振動(dòng)能量結(jié)構(gòu).在1 004 cm-1的位置上呈現(xiàn)的尖銳強(qiáng)峰代表苯丙氨酸的單基取代苯基環(huán)，經(jīng)苯并硫雜蒽衍生物作用后未發(fā)生頻移，說(shuō)明Hela細(xì)胞中苯丙氨酸對(duì)苯并硫雜蒽衍生物不敏感.

位于1 231 cm-1的拉曼譜峰歸屬于酰胺III β-折疊結(jié)構(gòu)，1 662 cm-1的拉曼譜峰歸屬于酰胺I無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu).加入苯并硫雜蒽衍生物后，兩個(gè)譜峰的位置未發(fā)生明顯變化，但強(qiáng)度增加，尤其是加入1.6 μmol/L的苯并硫雜蒽衍生物后譜峰的強(qiáng)度最高.說(shuō)明經(jīng)苯并硫雜蒽衍生物處理后，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)比例上升，1.6 μmol/L組的改變效果最明顯.1 484 cm-1的譜峰屬于酰胺II，苯并硫雜蒽衍生物處理后譜峰強(qiáng)度下降，當(dāng)濃度達(dá)到1.6 μmol/L時(shí)，此譜峰消失，說(shuō)明高濃度的苯并硫雜蒽衍生物破壞了蛋白質(zhì)酰胺II結(jié)構(gòu).

圖4 苯并硫雜蒽衍生物濃度對(duì)拉曼峰強(qiáng)度的影響Fig.4 The influence of Benzothioxanthene derivatives concentration on Raman peak intensity

和對(duì)照組相比，低濃度處理組細(xì)胞中1 336 cm-1(色氨酸)的譜線發(fā)生藍(lán)移，當(dāng)苯并硫雜蒽衍生物濃度增加時(shí)，譜線消失，說(shuō)明該小分子破壞了色氨酸的結(jié)構(gòu).

綜上所述，苯并硫雜蒽衍生物作用于Hela細(xì)胞后，拉曼光譜所展示的細(xì)胞凋亡過(guò)程主要體現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)構(gòu)的變化，而細(xì)胞內(nèi)部分蛋白質(zhì)含量的增加大多是因?yàn)榧?xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)中的生物化學(xué)過(guò)程、細(xì)胞容積和細(xì)胞膜發(fā)生相應(yīng)的變化導(dǎo)致的[14].

4 結(jié) 論

當(dāng)前拉曼光譜在醫(yī)學(xué)上已被用于對(duì)各種細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的研究.一方面，從細(xì)胞測(cè)定的拉曼光譜可以推測(cè)發(fā)生改變的基團(tuán)，分子相互作用的位置與模式等；另一方面，由于拉曼光譜對(duì)物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、構(gòu)象以及它們所處的環(huán)境很敏感，可從分子水平深入地研究其構(gòu)象變化和相互作用的過(guò)程.不同濃度組苯并硫雜蒽衍生物作用于Hela細(xì)胞后，細(xì)胞中蛋白質(zhì)的主鏈、側(cè)鏈、核酸和脂類的譜帶都發(fā)生了一定的改變，譜帶變化復(fù)雜.其中經(jīng)1.6 μmol/L苯并硫雜蒽衍生物處理的Hela細(xì)胞變化最為明顯.應(yīng)用拉曼光譜研究苯并硫雜蒽衍生物對(duì)細(xì)胞的影響操作方便，樣品無(wú)需特殊處理，有助于我們理解探討化合物與腫瘤細(xì)胞的凋亡作用的分子機(jī)理，更可望發(fā)展為一種新的篩選化合物活性的有效方法.

[1] ZHANG W, CHEN M, LING W Y, et al. Formation and stabilization of the telomeric antiparallel G-quadruplex and inhibition of telomerase by novel benzothioxanthene derivatives with anti-tumor activity[J]. Scientific reports,2015,5:13693.

[2] DEPCIUCH J, KAZNOWSKA E, ZAWLIK I, et al. Application of Raman spectroscopy and infrared spectroscopy in the identification of breast cancer[J]. Applied spectroscopy,2016,70(2):251-263.

[3] HU S F, FENG Y Y, ZHANG D S, et al. Raman spectral changes of Artemisinin-induced Raji cells apoptosis[J]. Vibrational spectroscopy,2015,81:83-89.

[4] FARHANE Z, BONNIER F, CASEY A, et al. Cellular discrimination using in vitro Raman micro spectroscopy: the role of the nucleolus[J]. Analyst,2015,140(17):5908-5919.

[5] LIANG L, HUANG D, WANG H, et al. In situ surface-enhanced Raman scattering spectroscopy exploring molecular changes of drug-treated cancer cell nucleus[J]. Analytical chemistry,2015,87(4):2504-2510.

[6] EL-MASHTOLY S F, YOSEF H K, PETERSEN D, et al. Label-free Raman spectroscopic imaging monitors the integral physiologically relevant drug responses in cancer cells[J]. Analytical chemistry,2015,87(14):7297-7304.

[7] SCHULZA H G, KONOROV S O, PIRET J M, et al. Label-free imaging of mammalian cell nucleoli by Raman microspectroscopy[J]. Analyst,2013,138(12):3416-3423.

[8] ZHU J, ZHOU J, GUO J, et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy investigation on human breast cancer cells[J]. Chemistry central journal,2013,7(1):37.

[9] MARRO M, NIEVA C, SANZ-PAMPLONA R, et al. Molecular monitoring of epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer cells by means of Raman spectroscopy[J]. Biochimica et biophysicaacta (BBA)-Molecular cell research,2014,1843(9):1785-1795.

[10] HUEFNER A, KUAN W L, BARKER R A, et al. Intracellular SERS nanoprobes for distinction of different neuronal cell types[J]. Nano letters,2013,13(6):2463-2470.

[11] BRAUCHLE E, NOOR S, HOLTORF E, et al. Raman spectroscopy as an analytical tool for melanoma research[J]. Clinical and experimental dermatology,2014,39(5):636-645.

[12] MOVASAGHI Z, REHMAN S, REHMAN I U. Ramanspectroscopy of biological tissues[J]. Applied spectroscopy reviews,2007,42(5):493-541.

[13] QI J, LIU B L, LI Y T, et al. Raman spectroscopic study on Hela cells irradiated by X rays of different doses[J]. Chinese optics letters,2009,7(8):734-737.

[14] FARHANE Z, BONNIER F, CASEY A, et al. Raman micro spectroscopy forinvitrodrug screening: subcellular localisation and interactions of doxorubicin[J]. Analyst,2015,140(12):4212-4223.

[15] NAUMANN D. Infrared and NIR Raman spectroscopy in medical microbiology[J]. The international society for optical engineering,1998,3257:245-257.

(責(zé)任編輯：朱小惠)

Raman spectra analysis of Hela cell treated by benzothioxanthene derivatives

XU Ning, DONG Yingying, WEI Chuanhe, XU Ling
(College of Pharmacy, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Benzothioxanthene derivatives could bind specifically to the nucleus DNA and induced apoptosis of human cervical cancer cells (Hela cells). In order to explore the mechanism of interaction, a method is established to distinguish HeLa cells which is either treated or untreated by benzothioxanthene derivatives. Changes in Raman spectrum of HeLa cells were observed after 24 hours treated by benzothioxanthene derivatives. Results indicated that after 24h treated by benzothioxanthene derivatives, Raman spectrum of HeLa cells have changed, including the bands of protein backbone, side chain, nucleic acids and lipids. There are significant differences in Raman spectra of cells of different groups, especially the spectrum of the group of 1.6 μmol/L.

benzothioxanthene derivatives; human cervical cancer cells; Raman spectra

2016-03-05

浙江省科技計(jì)劃分析測(cè)試項(xiàng)目(2014C37075)

徐 寧(1973—)，女，浙江湖州人，副研究員，博士，研究方向?yàn)楣庾由飳W(xué)，E-mail：xuning@zjut.edu.cn.

O657.3

A

1006-4303(2017)02-0206-04