脂多糖對胰腺星狀細胞Smad和ERK1/2信號通路相關蛋白表達的影響

張青 陳凱 盧美麗 許威 向曉輝 夏時海 冀潤利

·論著·

脂多糖對胰腺星狀細胞Smad和ERK1/2信號通路相關蛋白表達的影響

張青 陳凱 盧美麗 許威 向曉輝 夏時海 冀潤利

目的 探討脂多糖(LPS)干預對胰腺星狀細胞(PSC)Smad和ERK1/2信號通路相關蛋白表達的影響。方法 體外培養大鼠PSC細胞株LTC-14，用不同濃度LPS和不同時間干預LTC-14細胞，采用蛋白質印跡法檢測細胞Smad、ERK1/2通路相關蛋白以及α-平滑肌肌動(α-SMA)蛋白的表達。結果 0、1、5、10、20、50 mg/L LPS干預LTC-14細胞后，Smad3的蛋白表達量分別為0.15±0.02、0.37±0.02、0.44±0.01、0.46±0.02、0.37±0.01、0.24±0.03，Smad7蛋白表達量分別為0.79±0.05、0.84±0.02、0.55±0.03、0.45±0.03、0.34±0.02、0.92±0.07，p-ERK1/2蛋白表達量分別為0.48±0.05、0.74±0.03、0.72±0.04、0.89±0.02、0.81±0.02、0.72±0.03，p-cPLA2蛋白表達量分別為0.15±0.03、0.30±0.01、0.31±0.01、0.30±0.02、0.28±0.03、0.32±0.02，α-SMA蛋白表達量分別為0.56±0.06、0.62±0.06、0.54±0.04、1.03±0.11、1.39±0.08、1.28±0.10，均在LPS干預后發生顯著變化(P值均<0.01)；ERK1/2蛋白表達量分別為0.56±0.03、0.57±0.02、0.53±0.02、0.58±0.02、0.59±0.05、0.55±0.04，未隨著LPS濃度的升高而發生顯著變化。10 mg/L LPS干預0、1、3、6、9 h后，LTC-14細胞Smad3蛋白表達量分別為0.69±0.05、0.68±0.07、1.02±0.14、1.82±0.06、2.04±0.11，Smad7蛋白表達量分別為2.77±0.10、1.37±0.08、1.45±0.14、0.78±0.09、0.63±0.06，p-ERK1/2蛋白表達量分別為0.16±0.03、0.32±0.05、0.79±0.03、1.50±0.07、1.77±0.04， p-cPLA2蛋白表達量分別為0.15±0.04、0.32±0.06、0.63±0.04、0.95±0.04、1.49±0.10，α-SMA的蛋白表達量分別為0.84±0.03、1.26±0.21、1.81±0.19、4.28±0.26、4.37±0.15，均隨著LPS干預時間的延長而發生顯著變化(P值均<0.05或<0.01)；ERK1/2蛋白表達量分別為0.75±0.03、0.72±0.02、0.80±0.04、0.74±0.03、0.85±0.09，不隨LPS干預時間的延長而發生顯著變化。結論 LPS呈時間-劑量依賴性上調α-SMA表達，并激活胞內Smad和ERK1/2炎癥通路，這可能是CP發生的分子機制之一。

胰腺； 脂多糖類； 星型細胞； 信號傳導

慢性胰腺炎(CP)是由多種原因所致的胰腺實質內腺泡和胰管的反復或持續性損傷，引起腺泡和胰島細胞萎縮或消失，最終被纖維組織代替。CP臨床表現多樣，早期不易診斷。近年來大量研究顯示CP患者胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cell, PSC)的活化程度與胰腺組織纖維化程度呈正相關， PSC 在胰腺慢性纖維化的進程中具有重要作用，是各種誘因作用的靶點，也是導致CP 纖維化的重要物質基礎[1]。在CP起因的眾多假說中，腸道屏障破壞造成的細菌易位、反復的炎癥刺激是CP的主要成因之一。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是細菌細胞壁的主要成分，也是主要的致炎因素，可以通過TGF-β1通路誘導多器官的炎癥反應[2-3]。大鼠PSC中TGF-β1的分泌依賴于Smad和ERK1/2信號通路[4]。Smad3表達升高與PSC的激活有關[5]，而Smad7高表達的小鼠，胰腺纖維化程度減輕[6]；p-ERK1/2表達升高可以激活PSC[7]，胞質型磷脂酶 A2(cytosolic phospholipase A2，cPLA2)作為ERK1/2通路的下游分子，是炎癥反應的關鍵酶，在多種炎癥反應中發揮作用[8]。由此推測LPS誘導PSC活化所發生的炎癥反應可能有Smad和ERK1/2信號通路的參與。本研究應用LPS刺激PSC，觀察其對Smad和ERK1/2信號通路相關蛋白表達的影響，探討CP發生的分子機制。

材料和方法

一、細胞株及試劑

LTC-14細胞株是從大鼠胰腺分離出來的PSC，由德國Rostock大學醫學院Robert Jaster教授惠贈[9]；胎牛血清購自Gibco公司；青鏈霉素混合液購自Solarbio公司；IMDM培養基購自HyClone公司；LPS購自Sigma公司；胰酶消化液購自Gibco公司； ERK、β-actin單克隆一抗購自Proteintech公司； Smad3、Smad7抗體購自Abcam公司；p-ERK、p-cPLA2抗體購自Sigma公司；DMSO購自Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京碧云天生物技術有限責任公司；PVDF膜購自BD公司；蛋白Marker購自Solarbio公司；ECL發光液購自碧云天公司；顯影膠片購自柯達公司；顯影粉和定影粉購自天津世紀奧博公司。

二、細胞培養及分組

LTC-14細胞復蘇后常規培養、傳代。取對數生長期LTC-14細胞，待細胞70%融合時更換無血清培養液，分別加入0、1、5、10、20、50 mg/L LPS干預3 h，棄培養液，加入RIPA裂解液裂解細胞，提取蛋白；另取對數生長期LTC-14細胞，待細胞70%融合時更換無血清培養基，加入10 mg/L LPS分別干預0、1、3、6、9 h，棄去培養基，加入RIPA裂解液裂解細胞，提取蛋白。

三、蛋白質印跡法檢測細胞相關通路的蛋白表達

取上述提取的蛋白，BCA定量后常規行蛋白質印跡法檢測細胞α-SMA、Smad3、Smad7、p-ERK1/2、ERK、p-cPLA2蛋白表達，一抗工作濃度均為1∶1 000，內參GAPDH工作濃度為1∶5 000， HRP標記的二抗工作濃度為1∶5 000，最后用ECL化學發光顯影。

四、統計學處理

結 果

一、LPS干預對LTC-14細胞 Smad3、Smad7表達的影響

LPS干預后LTC-14細胞Smad3蛋白表達量先隨LPS劑量的增加而增加，在10 mg/L時達峰值，其后又逐漸下降；Smad7蛋白表達量先隨LPS劑量增加而下降，在20 mg/L時達最低值，50 mg/L時又顯著升高(表1，圖1A)。LTC-14細胞Smad3蛋白表達量隨10 μg/ml LPS干預時間的延長而增加；Smad7蛋白表達量隨LPS干預時間的延長而減少(表2，圖1B)。

表1 不同濃度LPS干預后LTC-14細胞Smad3、Smad7蛋白表達量的變化

注：與0 mg/L組比較，aP<0.01

表2 10 mg/L LPS干預不同時間后LTC-14細胞Smad3、Smad7蛋白表達量的變化

注：與0 h組比較，aP<0.01

圖1 0、1、5、10、20、50 mg/L LPS干預3 h后(1A)及10 mg/L LPS干預0、1、3、6、9 h后(1B) LTC-14細胞Smad3、Smad7蛋白的表達

二、LPS干預對LTC-14細胞ERK1/2信號通路的影響

LPS干預后LTC-14細胞p-ERK1/2、p-cPLA2蛋白表達量增加；而LPS干預對ERK1/2蛋白表達沒有影響(表3，圖2A)。10 mg/L LPS干預后LTC-14細胞p-ERK1/2、p-cPLA2蛋白表達量隨干預時間的延長而增加，在9 h時達峰值；而干預時間的延長對ERK1/2的表達沒有影響(表4，圖2B)。

三、LPS干預對LTC-14細胞α-SMA表達的影響

0、1、5、10、20、50 mg/L LPS干預后LTC-14細胞α-SMA蛋白表達量分別為0.56±0.06、0.62±0.06、0.54±0.04、1.03±0.11、1.39±0.08、1.28±0.10，≥10 mg/L LPS干預后LTC-14細胞α-SMA蛋白表達量顯著高于未干預細胞，差異均有統計學意義(P值均<0.01，圖3A)。

10 μg/ml LPS干預0、1、3、6、9 h后LTC-14細胞α-SMA蛋白表達量分別為0.84±0.03、1.26±0.21、1.81±0.19、4.28±0.26、4.37±0.15，隨干預時間的延長逐漸升高，6 h時達峰值(圖3B)，干預時間≥3 h時的表達量顯著高于未干預細胞，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。

圖2 0、1、5、10、20、50 mg/L LPS干預3 h后(2A)及10 mg/L LPS干預0、1、3、6、9 h后(2B ) LTC-14細胞 p-ERK1/2、ERK1/2、p-cPLA2蛋白的表達

圖3 0、1、5、10、20、50 μg/ml LPS干預3 h后(3A)及10 μg/ml LPS干預0、1、3、6、9 h后(3B) LTC-14細胞α-SMA蛋白的表達

CP的臨床表現主要為腹痛、脂肪瀉和糖尿病，嚴重影響患者的生活質量[10]。CP確診后20～25年的病死率為50%，并有4%的患者可發展為胰腺癌[11]。然而由于其發病機制尚不明確，目前尚無針對CP的有效藥物，因此研究CP的發病機制迫在眉睫。

腸道細菌易位學說是解釋胰腺炎發病機制的理論之一，該學說認為，正常情況下腸道內的細菌由于

表3 不同LPS濃度干預后LTC-14細胞ERK1/2通路相關蛋白表達量的變化

注：與0 mg/L組比較，aP<0.01

表4 10 mg/L LPS干預不同時間后LTC-14細胞ERK1/2通路相關蛋白表達量的變化

注：與0 h組比較，aP<0.05，bP<0.01

受到腸黏膜屏障的阻礙而難以易位到腸外組織，但在細菌過度生長、腸黏膜破壞的情況下，細菌可突破腸黏膜屏障而發生易位，易位的細菌除本身刺激細胞產生致炎因子外，革蘭陰性細菌死亡或被吞噬后釋放LPS進一步刺激機體免疫系統產生大量炎性因子，最終引發多臟器損傷[12]。

LPS引起的炎癥反應有TGF-β1信號通路的參與。作為TGF-β1的核心信號通路，Smad通路與LPS引起的炎癥反應關系密切[2-3]。大量研究表明，Smad通路在CP纖維化進程中也發揮重要作用[5-6]，但其在細菌易位方面的研究還未見報道。為此，本研究用LPS模擬腸道細菌突破腸黏膜屏障，采用不同LPS濃度及不同時間干預LTC-14細胞。結果顯示，隨著LPS刺激濃度的增加，Smad3表達逐漸升高，在10 mg/L時達峰值，其后逐漸降低；而Smad7蛋白的變化正好與其相反，LPS作用拐點的出現可能與高劑量LPS誘發了胞內的其他應激反應有關。而隨著LPS干預時間的延長，Smad3表達逐漸升高，Smad7表達逐漸降低，表明Smad通路被持續活化，且活化程度不斷提高。提示當有適量的細菌反復刺激時，胰腺產生的炎癥反應會逐漸增強，這與細菌易位假說相呼應，可能是CP發生的病理基礎。

細胞外信號調節激酶(ERK)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的主要成員，至少包括ERK1和ERK2兩個亞型。ERK通路參與應激、細菌產物和炎癥遞質等引起的細胞反應。研究證實，用細胞因子干預大鼠PSC可激活ERK通路，增加CX3CL1的釋放；而阻斷ERK1/2通路可抑制CX3CL1的分泌，表明PSC通過ERK1/2通路促進CP的發生[7]。在大鼠雪旺細胞實驗中，LPS可以顯著激活ERK1/2通路，進而誘導TNF-α的產生[13]。最近研究發現，LPS觸發的炎性環境可抑制BMP-9的表達，并激活ERK1/2信號通路[14]。cPLA2作為ERK1/2通路的下游分子，是炎癥反應的關鍵酶，cPLA2水解胞膜磷脂酸釋放花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，AA 在環氧化酶2(cycloxygenase，COX)和脂氧化酶(lypoxygenase，LOX)進一步催化下生成前列腺素、 血栓素、白三烯以及ROS等物質，廣泛參與炎癥反應與氧化應激過程[8]。本研究結果顯示，LPS干預PSC后可上調p-ERK1/2及其下游分子p-cPLA2的表達，并隨著LPS干預時間的延長而逐漸升高；然而LPS干預并不影響ERK1/2蛋白的表達，表明LPS對ERK1/2通路的激活僅起到一個類似分子開關的作用，但激活程度不隨LPS濃度的增加而變化，而是隨著LPS干預時間的延長逐漸加大，與Smad通路效果類似。

PSC的活化在CP的發生和發展過程中起著關鍵的作用，PSC活化所致的胰腺慢性纖維化是CP和胰腺癌共同的病理經過，活化的PSC已經有望成為CP和胰腺癌治療的一個新靶標[15-16]。有研究證明，Smad通路和ERK1/2通路都參與PSC的活化。在二丁基二氯化物(dibutyltin dichloride，DBTC)所致的大鼠CP中，Smad7表達顯著降低，同時TGF-β1和α-SMA表達明顯升高，PSC被廣泛激活[17]。最近研究發現，ERK1蛋白在PSC的活化中發揮重要作用[18]，而α-SMA 表達是PSC激活的標志[19]。為了更直接地反映LPS對PSC的影響，本研究同樣檢測了α-SMA的表達變化。結果顯示，低劑量LPS干預對PSC的α-SMA表達沒有影響，中劑量LPS干預使α-SMA的表達逐漸升高，而高劑量LPS干預后α-SMA的表達未繼續增加，表明中劑量LPS干預才能活化PSC，且隨著LPS干預時間的延長而逐漸增加，與胰腺Smad通路和ERK1/2通路的效果類似。由此推測，PSC中LPS所致α-SMA的表達變化可能是通過Smad通路和ERK1/2通路實現的。

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(本文編輯：屠振興)

The influence of LPS on the protein expression of related molecules in Smads and ERK1/2 signal pathway in LTC-14 cells

ZhangQing,ChenKai,LuMeili,XuWei,XiangXiaohui,XiaShihai,JiRunli.

DepartmentofGastrointerology,TianjinXiqingHospital,Tianjin300162,China

Objective To explore the influence of LPS treatment on related molecules in Smads and ERK1/2 signal pathway in pancreatic stellate cell line LTC-14. Methods LTC-14 cells were cultured in vitro, and were treated with LPS at different dose in different time points. Protein expressions of related molecules in Smads pathway and ERK1/2 pathway and α-SMA in LTC-14 Cells were examined by Western blot. Results On Treated LTC-14 cells by 0, 1, 5, 10, 20 and 50 mg/L LPS，protein expressions of Smad3 were 0.15±0.02, 0.37±0.02, 0.44±0.01, 0.46±0.02, 0.372±0.01 and 0.24±0.03; expressions of Smad7 were 0.79±0.05, 0.84±0.02, 0.55±0.03, 0.45±0.03, 0.34±0.02 and 0.92±0.07; p-ERK1/2 levels were 0.48±0.05, 0.74±0.03, 0.72±0.04, 0.89±0.02, 0.81±0.02 and 0.72±0.03; p-cPLA2 levels were 0.15±0.03, 0.30±0.01, 0.31±0.01, 0.30±0.02, 0.28±0.03 and 0.32±0.02; α-SMA levels were 0.56±0.06, 0.62±0.06, 0.54±0.04, 1.03±0.11, 1.39±0.08 and 1.28±0.10. The changes of protein expressions before and after LPS treatment were obvious (allP<0.01). The protein expressions of ERK1/2 were 0.56±0.03, 0.57±0.02, 0.53±0.02, 0.58±0.02, 0.59±0.05 and 0.55±0.04, which did not change obviously along with increased LPS dosages. LTC-14 cells treated with 10 mg/L LPS for 0, 1, 3, 6 and 9 h，the expressions of Smad3 were 0.69±0.05, 0.68±0.07, 1.02±0.14, 1.82±0.0 and 2.04±0.11，those of Smad7 were 2.77±0.10, 1.37±0.08, 1.45±0.14, 0.78±0.09 and 0.63±0.06，those of p-ERK1/2 were 0.16±0.03, 0.32±0.05, 0.79±0.03, 1.50±0.07 and 1.77±0.04，those of p-cPLA2 were 0.15±0.04, 0.32±0.06, 0.63±0.04, 0.95±0.04 and 1.49±0.10，those of α-SMA were 0.84±0.03, 1.26±0.21, 1.81±0.19, 4.28±0.26 and 4.37±0.15, all of which changed obviously as the treatment time increased (P<0.05 or 0.01). The expressions of ERK1/2 were 0.75±0.03, 0.72±0.02, 0.80±0.04, 0.74±0.03 and 0.85±0.09, which did not change obviously as the treatment time increased. Conclusions LPS could upregulate the expression of α-SMA in a time- and dose-dependent way, and activate intracellular Smads and ERK1/2 inflammatory pathways, which may be the potential molecular mechanism of the development of chronic pancreatitis.

Pancreas; Lipopolysaccharides; Astrocytes; Signal transductionFund program: Subject Foundation of Tianjin Xiqing Hospital(xqlx201401, xqlx201406); Seed-foundation of Affiliated Hospital of Logistics University of PAP(FYM201522); Startup Project of Doctor Scientific Research of Logistics University of PAP(WHB201515)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.02.005

300162 天津，天津市西青醫院消化內科(張青)；武警后勤學院附屬醫院消化二科/肝膽胰脾中心(陳凱、盧美麗、許威、向曉輝、夏時海、冀潤利)

冀潤利， Email: base_19901s@163.com

天津市西青醫院院級課題(xqlx201401，xqlx201406)；武警后勤學院附屬醫院種子基金(FYM201522)；武警后勤學院博士啟動金(WHB201515)

2016-09-06)