Latexin對耐吉西他濱胰腺癌細胞化療改善作用及其可能機制的體外研究

鄭繼行 王成 周香 薛戰雄 蔡振寨

·論著·

Latexin對耐吉西他濱胰腺癌細胞化療改善作用及其可能機制的體外研究

鄭繼行 王成 周香 薛戰雄 蔡振寨

目的 觀察Latexin干預對耐吉西他濱胰腺癌SW1990細胞耐藥性的影響，探討其可能機制。方法 采用吉西他濱藥物濃度梯度遞增誘導法建立吉西他濱耐藥SW1990細胞株(SW1990/GZ)。采用CCK-8法檢測吉西他濱對SW1990、SW1990/GZ細胞的IC50，并檢測10、20、40 ng/μl Latexin干預細胞48 h后的IC50，計算耐藥指數(RI)。采用定量RT-PCR 法、蛋白質印跡法檢測SW1990、SW1990/GZ細胞Latexin基因mRNA和蛋白的表達，檢測40 ng/μl Latexin干預48 h后SW1990、SW1990/GZ細胞Shh、Gli1的mRNA和蛋白表達。結果 成功建立了SW1990/GZ細胞株，它在含150 μmol/L吉西他濱的培養液中穩定生長、傳代。 吉西他濱對SW1990、SW1990/GZ細胞的IC50值分別為(3.8±0.4)μmol/L和(226.5±13.6)μmol/L，SW1990/GZ細胞顯著高于SW1990細胞，差異有統計學意義(P=0.000)；RI均值為59.6。10、20 、40 ng/μl Latexin干預48 h后，吉西他濱對SW1990細胞IC50值分別為(3.0±0.4)、(2.5±0.3)、(1.8±0.3)μmol/L，對SW1990/GZ細胞的IC50值分別為(113.08±5.01)、(70.26±2.31)、(42.12±1.31)μmol/L，除10 ng/μl Latexin干預的SW1990細胞外，其余劑量Latexin干預的SW1990、SW1990/GZ細胞IC50值均較未干預細胞顯著下降，差異具有統計學意義(P值均<0.05)；RI均值分別為37.7、28.1、23.1。SW1990、SW1990/GZ細胞Latexin的mRNA相對表達量分別為0.85±0.08、0.31±0.07， 蛋白相對表達量分別為0.49±0.09、0.13±0.05，SW1990/GZ細胞的表達量顯著低于SW1990細胞，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。40 ng/μl Latexin干預48 h后，SW1990/GZ細胞Shh mRNA表達量從未干預細胞的0.89±0.09下降至0.53±0.06，Gli1 mRNA表達量從0.58±0.06下降至0.35±0.05；Shh蛋白表達量從0.72±0.09下降至0.35±0.06，Gli1蛋白表達量從0.78±0.08下降至0.28±0.03，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。結論 Latexin能增強耐吉西他濱胰腺癌SW1990細胞對吉西他濱的敏感性，其機制可能與抑制SHH通路的激活有關。

胰腺腫瘤； Latexin； 抗藥性，腫瘤； 藥物療法； 吉西他濱； 信號傳導

Fund program：Project received research funding from Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China(Y2100546)

胰腺癌是嚴重威脅人類健康的消化系統常見惡性腫瘤，早期診斷困難，發現時往往已失去根治手術機會。化療是晚期胰腺癌的主要治療方法，但胰腺癌化療敏感性低，易耐藥，因此尋求改善胰腺癌耐藥的藥物及探索其可能機制具有重要意義。Sonic Hedgehog(SHH)是一條高度保守的信號轉導通路，在胰腺癌發生和發展及耐藥機制中發揮重要作用，同時還能影響細胞凋亡相關信號通路。Latexin作為內源性羧肽酶抑制劑，是胰腺癌潛在的腫瘤抑制劑[1]。本課題組之前的研究發現，Latexin在胰腺癌組織中的表達顯著下降，通過基因轉染使Latexin過表達及給予外源性Latexin蛋白均能抑制胰腺癌干細胞樣細胞的增殖[1-3]。本研究進一步建立耐吉西他濱胰腺癌細胞株,通過外源性Latexin干預，觀察其對化療的改善作用及其可能的相關機制。

材料與方法

一、吉西他濱耐藥細胞株的建立

人胰腺癌細胞株SW1990購自中科院上海生命科學研究院，常規培養于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及鏈霉素的RPMI-1640培養液。收集對數生長期細胞，以5×105/ml細胞密度接種于培養瓶，采用吉西他濱藥物濃度梯度遞增誘導法建立吉西他濱耐藥細胞株(SW1990/GZ)。先以3 μmol/L吉西他濱誘導培養3 d，去除死亡細胞，更換培養液后繼續培養3 d，待細胞穩定達到對數生長期，繼續傳代。根據細胞生長狀態遞增吉西他濱濃度為6、12、24、48、70、90、110、130、150、170 μmol/L。誘導約8個月，確定細胞能夠穩定存活并能夠連續傳代的最高吉西他濱濃度，以獲得SW1990/GZ。進行下述實驗前脫藥培養細胞4周。

二、CCK-8法檢測吉西他濱的IC50值

取對數生長期的SW1990、SW1990/GZ細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板，SW1990細胞分別加入0.1、0.5、2.5、5.0、10 μmol/L吉西他濱，SW1990/GZ細胞分別加入10、50、100、200、400 μmol/L吉西他濱，每個濃度設5個復孔，以未加藥物孔作為對照。常規培養48 h后吸棄上清，更換培養液，每孔加入10 μl CCK-8，繼續培養4 h后，置酶聯免疫檢測儀上檢測各孔450 nm波長的吸光度值(A450值)。應用graphpad prism 5軟件獲取IC50值，計算耐藥指數(resistance index，RI)。RI=SW1990/GZ細胞IC50值/SW1990細胞IC50值。

取對數生長期SW1990、SW1990/GZ細胞，以每孔1×104個細胞接種96孔板，加入10、20、40 ng/μl Latexin干預培養48 h，采用上述同樣方法檢測吉西他濱的IC50值。

三、蛋白質印跡法檢測細胞Latexin、Shh、Gli1蛋白表達

取對數生長期SW1990、SW1990/GZ細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板，培養48 h后收集細胞，采用預冷裂解液提取細胞總蛋白，蛋白定量后行蛋白質印跡法檢測細胞Latexin蛋白表達，以β-actin為內參。兔抗人Latexin多克隆抗體(Abcam公司)工作濃度1∶1 000。最后ECL發光，X線曝光、顯影、定影。

取對數生長期SW1990、SW1990/GZ細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板，加入40 ng/μl Latexin干預培養48 h，同上述方法檢測Shh、Gli1蛋白表達。兔抗人Shh、Gli1多克隆抗體(Cell Signalling Technology公司)工作濃度均為1∶1 000。

利用Design-Expert8.0Trial數據處理軟件中ANOVA程序對表3的試驗結果進行二次回歸分析，計算出方程各項系數并進行方差分析，可得2個因子與Y之間的回歸方程：Y=99.21+2.22A-1.45B+0.95AB-1.22A2-1.12B2。

應用AlphaEaseFC4.0圖像分析軟件檢測各條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

四、定量RT-PCR 法檢測細胞Lacexin、Shh、Gli1 mRNA表達

收集上述各組細胞，采用Trizol提取細胞總RNA，于紫外分光光度儀檢測RNA純度及濃度，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)將RNA逆轉錄成cDNA。使用SYBR?Premix Ex Taq(Perfect Real Time)熒光實時定量PCR試劑盒(日本Takara公司)在Roche Light Cycle480熒光定量PCR儀上進行擴增。引物序列：Latexin上游引物5′-GAAGGTCAAACAAGCCAGCAT-3′，下游引物5′-AACCCAGGCTAAATGTAGAACG-3′；Shh上游引物5′-AGGCTGATGACTCAGAGGTGT-3′，下游引物：5′-GCCCTCGTAGTGCAGAGACT-3′；Gli1上游引物5′-TTCCTACCAGAGTCCCAAGT-3′，下游引物5′-CCCTATGTGAAGCCCTATTT-3′；內參β-actin上游引物5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物：5′-AAGAAAGGGTGTAACGCAACTAAG-3′。PCR反應條件：95℃ 30 s，95℃ 10 s、60℃ 20 s，45個循環。確認qRT-PCR擴增曲線和融解曲線，通過儀器自帶軟件獲取Ct值，采用公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。

五、統計學處理

結 果

一、吉西他濱的IC50值

二、Latexin mRNA及蛋白表達的變化

SW1990、SW1990/GZ細胞Latexin mRNA相對表達量分別為0.85±0.08、0.31±0.07，蛋白相對表達量分別為0.49±0.09、0.13±0.05 ，SW1990/GZ細胞的表達量顯著低于SW1990細胞，差異有統計學意義(t=8.80，P=0.001；t=6.06，P=0.004；圖1)。

圖1 Latexin蛋白在SW1990(1)、SW1990/GZ(2)細胞中的表達

三、Latexin干預后吉西他濱IC50值的變化

應用10 、20、40 ng/μl Latexin干預48 h后，吉西他濱對SW1990細胞的IC50值分別為(3.0±0.4)、(2.5±0.3)、(1.8±0.3)μmol/L，除10 ng/μl外，其余劑量干預組顯著低于未干預的SW1990細胞，差異有統計學意義(t值分別為2.45、4.50、6.93，P值分別為0.070、0.011、0.002)；吉西他濱對SW1990/GZ的IC50值分別為(113.08±5.01)、(70.26±2.31)、(42.12±1.31)μmol/L，均顯著低于未干預的SW1990/GZ細胞，差異具有統計學意義(t值分別為13.55、19.61、23.20，P值均為0.000)。RI均值分別為37.7、28.1、23.1。

四、Latexin干預后細胞Shh、Gli1 mRNA及蛋白表達的變化

應用40 ng/μl Latexin干預48 h后，SW1990細胞Shh mRNA表達量從未干預細胞的0.56±0.06下降至0.37±0.05，Gli1 mRNA從未干預細胞的0.41±0.05下降至0.30±0.04，差異均有統計學意義(t=4.21，P=0.014；t=2.98，P=0.041)；Shh蛋白表達量從0.34±0.04下降至0.14±0.03，Gli1蛋白表達量從0.43±0.04下降至0.19±0.03，差異均有統計學意義(t=6.93，P=0.001；t=9.98，P=0.001；圖2)。

圖2 Latexin干預前(1)及干預后(2)SW1990細胞Shh、Gli1蛋白表達

應用40 ng/μl Latexin干預48 h后，SW1990/GZ細胞Shh mRNA表達量從未干預細胞的0.89±0.09下降至0.53±0.06，Gli1 mRNA從未干預細胞的0.58±0.06下降至0.35±0.05，差異均有統計學意義(t=5.77，P=0.004；t=5.10，P=0.007)；Shh蛋白表達量從0.72±0.09下降至0.35±0.06，Gli1蛋白表達量從0.78±0.08下降至0.28±0.03，差異均有統計學意義(t=5.93，P=0.004；t=10.13，P=0.001；圖3)。

討 論

胰腺癌是消化系統常見的惡性腫瘤，其手術切除率不足20%[4]，化療仍然是胰腺癌的重要治療方法。吉西他濱是一種新型人工合成嘧啶核苷類似物，吉西他濱單藥或者聯合其他抗腫瘤藥物是治療胰腺癌的首選化療方案，但其治療效果有限，無法顯著延長患者的生存時間[5]，對吉西他濱等化療藥物產生耐藥性是化療失敗的主要原因。因此，改善胰腺癌化療耐藥，探索其可能機制意義重大。

圖3 Latexin干預前(1)及干預后(2)SW1990/GZ細胞Shh、Gli1蛋白的表達

Latexin是哺乳類羧肽酶的內源性抑制物，它與潛在的腫瘤抑制因子他扎羅汀誘導基因(TIG)1具有廣泛的同源性[6]，可非競爭性、不可逆地抑制羧肽酶活性，通過調控細胞間信號通路及調節蛋白聚集等方式獨立或協同其他分子調節細胞增殖與凋亡[7]。越來越多的研究表明，Latexin在多種腫瘤中表達下調，并抑制腫瘤的生長。本研究采用藥物濃度梯度遞增誘導法建立吉西他濱耐藥細胞株，結果顯示Latexin在吉西他濱耐藥的SW1990細胞中表達下降，經過Latexin干預后可降低耐藥細胞株的耐藥指數，提示其能改善化療的治療效果。

SHH是一條高度保守的信號轉導通路，由糖蛋白配體(Hh)、跨膜蛋白受體(Ptch,Smo)及下游轉錄因子Gli家族等組成，其在胰腺癌發生、發展及耐藥中發揮重要作用[8]。激活SHH通路中的Gli2基因能誘導未分化的胰腺腫瘤，通過環靶明或其他方式阻斷SHH通路能夠誘導腫瘤細胞凋亡[9-10]。在胰腺癌的化療治療模型中，抑制SHH通路能增加個體對化療藥物的敏感性[11]。因此，阻斷SHH信號通路有望成為逆轉腫瘤耐藥的重要靶點[12]。本研究結果顯示，Latexin干預SW1990/GZ細胞后Shh、Gli1 mRNA及蛋白的表達明顯被抑制，提示Latexin可能通過抑制SHH通路的激活而抑制胰腺癌細胞增殖，從而改善對吉西他濱的化療耐藥性。

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(本文編輯：冀凱宏)

In vitro study on the improvements of Latexin on the chemosensitivity in gemcitabine-resistant pancreatic cancer cells and potential mechanism

ZhengJihang,WangCheng,ZhouXiang,XueZhanxiong,CaiZhenzhai.

DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China

CaiZhenzhai,Email:czz77@sina.com

Objective To observe the effect of Latexin treatment on the chemoresistance in gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SW1990, and explore the potential mechanism. Methods Gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SWl990/GZ was induced and established by increasing gemcitabine dosage intermittently. IC50of gemcitabine in SW1990 cells and SWl990/GZ cells pre and post Latexin treatment at the dosage of 10, 20 and 40 ng/μl for 48 h was evaluated using CCK-8 assay. The mRNA and protein expression of Latexin gene in SW1990 and SW1990/GZ cells were evaluated using qRT-PCR and h. Results A gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line SWl990/GZ was obtained successfully, which can grow stably and passage in the media containing 150 μmol/L gemcitabine. The IC50 values of gemcitabine in SW1990 cells and SWl990/GZ cells were (3.8±0.4)μmol/L and(226.52±13.61)μmol/L, respectively, and the later was greatly higher than the former, which was statistically different (P=0.000). The drug resistance indexes (RI) was 59.6. After treated with different concentrations of Latexin(10，20，40 ng/μl), the IC50of SW1990 cells was (3.0±0.4)μmol/L, (2.5±0.3)μmol/L and (1.8±0.3)μmol/L, respectively，and the IC50of SW1990/GZ cells was(113.08±5.01)μmol/L,(70.26±2.31)μmol/L and (42.12±1.31)μmol/L, respectively. Compared with the untreated cells，the IC50of gemcitabine in 20，40 ng/μl Latexin treated cells was obviously decreased, and the differences were statistically significant (P<0.05). Compared with the SW1990 cells，the expression of Latexin in SW1990/GZ cells was obviously decreased. RI were 37.7, 28.1 and 23.1，respectively. mRNA relative expression of Latexin in SW1990 and SW1990/GZ cells were 0.85±0.08 and 0.31±0.07, and protein relative expression were 0.49±0.09 and 0.13±0.05, and Latexin expression in SW1990/GZ was obviously lower than that in SW1990 cells and the difference was statistically significant (P<0.05). After being treated by 40 ng/μl Latexin, SHH mRNA in SW1990/GZ cells decreased from 0.89±0.09 (control cells) to 0.53±0.06, Gli1 mRNA decreased from 0.58±0.06 to 0.35±0.05, Shh protein decreased from 0.72±0.09 to 0.35±0.06，Gli1 protein level decreased from 0.78±0.08 to 0.28±0.03, and all the differences were statistically significant (P<0.05 or 0.01). Conclusions Latexin can significantly improve the chemosensitivity in gemcitabine-resistant pancreatic cancer cells, and the potential mechanism may be related to the inhibition of sonic hedgehog pathway activation.

Pancreatic neoplasms； Latexin； Drug resistance neoplasm； Drug therapy; Gemcitabine; Signal tvansduction

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.02.009

325000 浙江溫州，溫州醫科大學附屬第二醫院普外科(鄭繼行、周香)，消化內科(薛戰雄、蔡振寨)；寧波市第一醫院普外科(王成)

蔡振寨，Email: czz77@sina.com

浙江省自然科學基金(Y2100546)

2016-10-13)