HIF-1α介導低氧誘導的內皮細胞Brm表達上調的機制研究*

王授銜， 陳德偉△， 高文祥， 徐 剛， 吳 剛， 陳 建， 高鈺琪△

(第三軍醫大學高原軍事醫學系 1病理生理學與高原病理學教研室， 2高原特需藥品與衛生裝備研究室， 3全軍高原醫學重點實驗室，重慶 400038)

·論 著·

HIF-1α介導低氧誘導的內皮細胞Brm表達上調的機制研究*

王授銜1, 3， 陳德偉1, 3△， 高文祥1, 3， 徐 剛2, 3， 吳 剛1, 3， 陳 建2, 3， 高鈺琪2, 3△

(第三軍醫大學高原軍事醫學系1病理生理學與高原病理學教研室，2高原特需藥品與衛生裝備研究室，3全軍高原醫學重點實驗室，重慶 400038)

目的： 本研究擬探討低氧誘導因子1α(HIF-1α)在低氧誘導的血管內皮細胞Brm表達上調中的作用及機制，為低氧性肺動脈高壓的防治提供理論依據。方法: 在內皮細胞中過表達或siRNA干擾HIF-1α的表達，并給予1%低氧處理24 h后，運用螢光素酶報告基因檢測方法檢測Brm啟動子的轉錄活性，運用RT-qPCR檢測Brm的mRNA表達水平，運用Western blot檢測Brm的蛋白表達水平。運用ChIP技術檢測低氧條件下HIF-1α與Brm啟動子區域的結合變化情況。結果: 過表達HIF-1α可顯著上調Brm的啟動子活性、mRNA及蛋白表達，而siRNA干擾HIF-1α可顯著抑制Brm的啟動子活性、mRNA及蛋白表達，ChIP實驗揭示低氧可顯著增強HIF-1α與Brm啟動子的結合。結論: 低氧上調內皮細胞中Brm的表達依賴HIF-1α的轉錄調控作用。

低氧性肺動脈高壓； 低氧誘導因子1α； Brm蛋白； 內皮細胞

低氧性肺動脈動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是一種由于低氧引起的，以持續性肺血管收縮和肺血管結構改建為特點的，并伴有右心室進行性肥大的慢性進行性疾病。同時也是肺源性心臟病和高原心臟病發病的中心環節。肺動脈高壓的直接后果是右心室肥厚、右心功能不全乃至右心衰，嚴重者可導致死亡。其中由高原低氧引起的肺動脈高壓乃至高原心臟病是嚴重威脅著高原群眾及高原官兵健康的慢性高原病[1]。目前對HPH發病機制認識尚不清楚，也缺乏有效的防治措施。越來越多的研究提示免疫炎癥反應在HPH發生、發展中發揮重要作用[2-3]。研究發現HPH小鼠肺血管周圍有大量炎癥細胞浸潤，肺組織中炎癥因子和黏附分子表達顯著增高。體外實驗證實，低氧(1% O2)可直接上調內皮細胞中細胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAMs)的轉錄和表達，并增強炎癥細胞與內皮細胞的黏附[4-5]。這說明低氧可誘導內皮細胞中CAMs基因的轉錄激活，增強血管內皮細胞和循環炎癥細胞的相互作用，使之在肺血管周圍形成促炎微環境，從而介導或促進肺血管收縮和肺血管結構改建，這可能是HPH形成的重要機制。

Brahma (Brm)蛋白是哺乳動物染色體重構復合物switch (SWI)/sucrose nonfermentable (SNF)的核心ATP酶亞單位，也是調節核小體結構改變和基因轉錄的核心蛋白。它可通過水解ATP釋放能量，改變核小體的結構，從而調節基因的轉錄[6]。前期研究發現低氧可誘導Brm表達上調，并調控內皮細胞中CAMs和內皮素1(endothelin-1，ET-1)的表達，內皮特異性干擾Brm可顯著抑制低氧肺血管炎癥反應、肺血管結構改建、右心室肥厚及右心室壓力升高[4-5]。但低氧如何誘導Brm表達增多，其機制尚不明確。通過生物信息學分析后發現Brm的啟動子區域存在低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的結合位點。因此，本實驗將在內皮細胞模型中，運用質粒過表達或siRNA干擾HIF-1α的表達，再給予低氧處理后，采用螢光素酶報告基因、RT-qPCR、Western blot及染色質免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)技術等檢測方法，明確HIF-1α在低氧上調內皮細胞中Brm表達中的作用及機制，為低氧性肺動脈高壓的防治提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 主要材料

胎牛血清、高糖DMEM培養基和0.25%胰蛋白酶(HyClone)；RNA提取試劑盒(Omega)；β-巰基乙醇(重慶川東化工集團有限公司)；逆轉錄試劑盒和SYBR Green Real-Time PCR試劑盒(TaKaRa)；青-鏈霉素、BCA蛋白定量試劑盒和Western blot實驗 I抗稀釋液(碧云天生物技術研究所)；HRP標記山羊抗兔、HRP標記山羊抗小鼠和HRP標記驢抗山羊IgG 抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；抗Brm和HIF-1α抗體(Abcam)；抗β-actin抗體(Sigma)；Lipofectamine 3000轉染試劑(Invitrogen)；Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑(Invitrogen)；Luciferase Assay System 試劑盒(Promega)；Flag-HIF-1α由南京醫科大學徐涌教授惠贈；pGL3-Brm(深圳百恩維生物技術有限公司)；HIF-1αsiRNA(上海吉瑪生物有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養 人臍靜脈內皮細胞EA.hy926用含青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L和10%胎牛血清的高糖DMEM培養基常規培養，細胞置于 37 ℃、 5% CO2細胞培養箱中培養。等細胞處于對數生長期時用于實驗。細胞進行低氧處理時，將接種的細胞放入接有N2和 CO2的三氣培養箱中，并將O2濃度設定為 1%(5% CO2、94% N2) ，培養相應的時間后取出進行后續實驗。

2.2 螢光素酶報告基因檢測Brm啟動子活性 轉染前1 d，將對數增長期的內皮細胞接種于24孔板中，每孔1×105個細胞。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待培養板中細胞約 80%～90% 融合時開始轉染。按照Invitrogen的Lipofectamine 3000或Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑說明書進行轉染，siRNA組加入60 nmol/L的HIF-1αsiRNA(5′-AGAGGUGGAUAUGUGUGGG-3′)，過表達組加入0.3 μg的HIF-1α表達質粒。置于 37 ℃、 5% CO2細胞培養箱中培養6 h后更換培養基，繼續培養或低氧處理后，參照Promega的Luciferase Assay System 試劑盒說明書進行螢光素酶報告基因檢測啟動子活性。

2.3 RT-qPCR檢測Brm的mRNA表達 將EC細胞以(2～3)×108/L種于35 mm的培養皿中，過夜培養后給予轉染或低氧處理，收集細胞并按照試劑盒說明書操作，提取各組的RNA，使用NanoDrop ND-100超微量分光光度計測量濃度后，按照逆轉錄及熒光定量PCR試劑盒說明進行逆轉錄和擴增，PCR反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s，循環40次。引物由Invitrogen公司合成，Brm的上游引物為5′-TGCAAGAGCGGGAATACAGACT-3′，下游引物為5′- ACCTCCTGTCTCAGCTGACGCT-3′，擴增產物長度為160 bp；HIF-1α的上游引物為5′-GGACAAGTCACCACAGGACA-3′，下游引物為5′-GGGAGAAAATC-AAGTCGTGC -3′，擴增產物長度為169 bp；β-actin的上游引物為5′-CATGGAGTC CTGTGGCATCC-3′，下游引物為5′-AATGCCAGGGTACATGGTGG-3′，擴增產物長度為124 bp。

2.4 Western blot檢測Brm的蛋白表達 收集各實驗組細胞，預冷PBS清洗后加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解15 min后，用細胞刮收集細胞于離心管中，12 000 r/min離心10 min后轉移上清于新的離心管中，BCA法測定蛋白濃度并調整蛋白濃度一致，加入上樣緩沖液95 ℃10 min。采用8%的分離膠進行SDS-PAGE分離，100 V濕轉60 min，轉膜后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，然后置于 I 抗稀釋液稀釋的Brm(1∶500)、β-actin(1∶3 000)和HIF-1α(1∶1 000)抗體中4 ℃孵育過夜。TBST漂洗 10 min、3次；置于5%脫脂奶粉稀釋的HRP標記 II 抗(1∶3 000)中室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次，ECL化學發光法顯色，使用ImageJ軟件對條帶進行光密度分析，計算各組蛋白相對表達量。

2.5 ChIP檢測HIF-1α與Brm啟動子的結合 接種內皮細胞并進行低氧處理后，終濃度1%甲醛進行交聯10 min，甘氨酸解交聯5 min，加入含蛋白酶抑制劑的預冷PBS，細胞刮刮取細胞于EP管中，800×g4 ℃離心5 min，棄上清，用0.5 mL含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液重懸細胞沉淀，冰上裂解15 min。超聲破碎DNA后12 000 r/min離心10 min棄沉淀。BCA法測定蛋白濃度，取300 μg蛋白于新的離心管中，加入抗HIF-1α或IgG抗體5 μg，置于4 ℃ 旋轉孵育過夜。同時取1/10作為 Input。次日每管加入60 μL Protein A/G agarose/Salmon sperm DNA，4 ℃旋轉孵育1 h后，離心棄上清；分別加低鹽、高鹽、LiCl buffer和TE buffer進行清洗，加入新鮮配制的elution buffer進行洗脫，加入20 μL 5 mol/L的NaCl 65 ℃水浴4～5 h充分解交聯；采用酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)及糖原沉淀法提取DNA，PCR檢測DNA富集量。上游引物為5′-CACATTCTTGCACACCGCCC-3′，下游引物為5′-TCCTCCCTGCCCGTCC-3′。

3 統計學處理

數據分析運用 SPSS 18.0 統計軟件。每組實驗重復3次，結果用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間差異的比較用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 低氧誘導內皮細胞Brm表達增多的變化規律及特點

RT-qPCR檢測內皮細胞低氧處理12 h、24 h和48 h后Brm的mRNA表達變化，結果顯示與常氧對照組相比，低氧各組Brm的mRNA表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨低氧時間延長而逐漸增加，見圖1A。

Western blot檢測內皮細胞低氧12 h、24 h及48 h后Brm的蛋白表達的變化，結果顯示與常氧對照組相比，低氧處理組Brm的蛋白表達隨缺氧時間延長而逐漸增加，見圖1B。

Figure 1.Hypoxia activated the expression of Brm in endothelial cells. HUVECs were exposed to 1% O2for 12, 24 and 48 h， and the mRNA (A) and protein (B) levels of Brm were detected with RT-qPCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h.

圖1 RT-qPCR和Western blot檢測不同時點內皮細胞中Brm的mRNA及蛋白表達變化

2 HIF-1α調控Brm的轉錄活性

HIF-1α過表達和siRNA干擾效果的檢測結果顯示，siRNA干擾HIF-1α后HIF-1α的mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，見圖2A。質粒轉染過表達HIF-1α后HIF-1α的mRNA和蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，見圖2B。

螢光素酶報告基因檢測低氧情況下HIF-1α對Brm啟動子活性的影響，結果顯示低氧24 h可顯著上調Brm啟動子活性，干擾HIF-1α后Brm啟動子活性顯著受到抑制；而過表達HIF-1α可顯著上調Brm啟動子活性(P<0.05),見圖2C。

Figure 2.HIF-1α regulated hypoxia-induced Brm transcription. A： HUVECs were transfected with scrambled (SCR) or specificHIF-1αsiRNA (siHIF-1α). Cells were harvested 24 h after hypoxia (1% O2)， and then the mRNA and protein levels of HIF-1α were measured by RT-qPCR and Western blot. B： HUVECs were transfected with negative control vector (NCV) or expression construct for HIF-1α (Flag-HIF-1α) and then exposed to 1% O2for 24 h. The mRNA and protein levels of HIF-1α were measured by RT-qPCR and Western blot. C： theBrmpromoter construct was transfected into HUVECs with specific siRNA or indicated expression constructs and then exposed to 21% or 1% O2for 24 h. Luciferase activity was expressed as normalized relative luciferase unit (NRLU). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSCR+hypoxia；#P<0.05vsNCV+hypo-xia.

圖2HIF-1α的過表達及干擾效果檢測，以及螢光素酶報告基因檢測HIF-1α對Brm啟動子活性的影響

3 HIF-1α調控Brm的mRNA及蛋白表達

RT-qPCR的結果顯示，低氧24 h可顯著上調Brm的mRNA表達，干擾HIF-1α后Brm的mRNA表達顯著降低(P<0.05)，而過表達HIF-1α后Brm的mRNA表達顯著升高(P<0.05)。Western blot實驗結果顯示，低氧24 h可顯著上調Brm的蛋白表達，干擾HIF-1α后Brm的蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而過表達HIF-1α后Brm的蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖3。

4 低氧促進HIF-1α與Brm啟動子結合

ChIP檢測低氧條件下HIF-1α與Brm啟動子結合變化，結果顯示與常氧對照組相比，低氧24 h可顯著增加HIF-1α與Brm啟動子的結合，具有統計學差異(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.HIF-1α regulated hypoxia-induced Brm mRNA (A) and protein (B) expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSCR+hypoxia；#P<0.05vsNCV+hypoxia.

圖3 RT-qPCR及Western blot檢測HIF-1α對Brm表達的影響

Figure 4.HIF-1α was recruited to the Brm promoter under hypoxia. HUVECs was exposed to 21% or 1% O2for 24 h and harvested. ChIP assays were performed with indicated antibodies. Mean±SD.*P<0.05vsnormoxia.

圖4 CHIP檢測低氧條件下HIF-1α與Brm啟動子結合變化

討 論

研究表明，炎癥免疫反應在HPH形成中發揮了重要作用，染色質重構蛋白Brg1和Brm參與了低氧肺血管炎癥反應及肺血管重構[7]。Brg1與Brm結構極其相似，約74%的序列是相同的，功能上也類似，且有一定的互補作用，都可通過水解ATP釋放能量來改變核小體的結構，從而調控基因的轉錄[8-10]。本課題組前期研究發現，Brg1與Brm在低氧應激反應及HPH形成中具有相似的作用和功能。因此，本實驗中著重關注了低氧誘導Brm上調的調控機制，在Brg1的轉錄調控中也可能存在類似的機制。

HIF-1α在調節細胞低氧應激反應中發揮著至關重要的作用[1, 11]。面對低氧刺激，細胞會發生一系列低氧應激反應，尤其是在轉錄水平做出的快速特異性反應，來調節氧供給與利用之間的不平衡，使細胞適應低氧刺激。而這些應激反應絕大多數是通過的HIF-1α來介導的。低氧條件下，HIF-1α與HIF-1β形成二聚體進入細胞核內與靶基因啟動子上的低氧反應元件(hypoxia response elements，HRE)結合來發揮轉錄調控作用，從而參與一系列的細胞低氧應激反應。而在常氧條件下，HIF-1α在脯氨酸羥化酶(proline hydroxylase，PHD)的作用下被羥基化，進而被VHL E3泛素連接酶辨識并泛素化，之后透過蛋白酶體使其被快速降解，所以，在常氧條件下很難檢測到HIF-1α的表達。因此，本研究中檢測HIF-1α的過表達和干擾效率時都是在低氧條件下檢測的。

Brm和Brg1在維持胚胎發育過程中的血管平衡，促進應激相關疾病的發生過程中都發揮著重要作用[12]，也參與調節細胞的增殖分化、遷移、DNA損傷修復以及DNA 甲基化修飾等[13]。HIF-1α 也可以招募 Brg1 和 Brm 到其下游靶基因上參與細胞低氧反應[11]。低氧條件下，Brg1和Brm可以在轉錄水平上調促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)的表達，從而促進 EPO 分泌來增加紅細胞[14]。同時，本課題組在人臍靜脈內皮細胞低氧模型中發現Brm在轉錄水平(mRNA)和翻譯水平(蛋白)的表達都隨低氧(1%)時間的延長而逐漸增加。進一步研究發現，HIF-1α也可直接調控Brm的轉錄和表達。提示我們Brm既是HIF-1α的靶基因，也參與調控HIF-1α的其它靶基因，形成了一個調控網絡。

本研究在明確低氧可顯著上調內皮細胞中Brm的表達，且Brm在低氧肺血管炎癥反應及HPH形成中發揮重要作用后，進一步去探討低氧誘導內皮細胞中Brm上調的具體分子機制。首先，使用生物信息學預測發現Brm啟動子上存在HRE，進一步采用質粒過表達和siRNA干擾HIF-1α的表達后，分別在轉錄和翻譯水平檢測了Brm的啟動子活性、mRNA及蛋白表達變化。實驗結果顯示，在低氧處理下，內皮細胞中Brm的啟動子活性、mRNA及蛋白表達較常氧時顯著增加，過表達HIF-1α后Brm啟動子活性、mRNA及蛋白表達進一步增加，而干擾HIF-1α后，Brm啟動子活性、mRNA及蛋白表達顯著降低。這提示HIF-1α作為轉錄因子可能直接參與了Brm的轉錄調控。為了進一步明確低氧條件下HIF-1α是否通過直接結合到Brm啟動子區域的HRE來轉錄激活Brm的表達。通過ChIP實驗，我們明確了低氧條件下HIF-1α與Brm啟動子的結合顯著增多。上述實驗結果都有力地證明了低氧條件下，HIF-1α與Brm之間的直接轉錄調節關系，而作為結構功能相似的染色體重構蛋白Brg1在低氧下是否也存在相似轉錄調節機制，以及Brg1和Brm是否參與調控HIF-1α的轉錄和表達，還有待我們進一步實驗發現與驗證。

綜上所述，本研究首次明確了低氧誘導Brm表達上調的分子機制，低氧條件下，內皮細胞中的HIF-1α可直接結合到Brm啟動子上，參加調控Brm的轉錄和表達。

[1] 高鈺琪. 高原軍事醫學 [M]. 重慶: 重慶出版社, 2004:54-74.

[2] Pugliese SC, Poth JM, Fini MA, et al. The role of inflammation in hypoxic pulmonary hypertension: from cellular mechanisms to clinical phenotypes[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2015, 308(3):L229-L252.

[3] Price LC, Wort SJ, Perros F, et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension[J]. Chest, 2012, 141(1):210-221.

[4] Chen D, Fang F, Yang Y, et al. Brahma-related gene 1 (Brg1) epigenetically regulates CAM activation during hypoxic pulmonary hypertension[J]. Cardiovas Res, 2013, 100(3):363-373.

[5] Fang F, Chen D, Yu L, et al. Proinflammatory stimuli engage Brahma related gene 1 and Brahma in endothelial injury[J]. Circ Res, 2013, 113(8):986-996.

[6] Kadam S, Emerson BM. Transcriptional specificity of human SWI/SNF BRG1 and BRM chromatin remodeling complexes[J]. Mol Cell, 2003, 11(2):377-389.

[7] Burke DL, Frid MG, Kunrath CL, et al. Sustained hypo-xia promotes the development of a pulmonary artery-speci-fic chronic inflammatory microenvironment[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2009, 297(2):L238-L250.

[8] Reyes JC, Barra J, Muchardt C, et al. Altered control of cellular proliferation in the absence of mammalian brahma (SNF2α)[J]. EMBO J, 1998, 17(23):6979-6991.

[9] Kadoch C, Crabtree GR. Mammalian SWI/SNF chromatin remodeling complexes and cancer: mechanistic insights gained from human genomics[J]. Sci Adv, 2015, 1(5):e1500447.

[10]Schnitzler G, Sif S, Kingston RE. Human SWI/SNF interconverts a nucleosome between its base state and a stable remodeled state[J]. Cell, 1998, 94(1):17-27.

[11]Sena JA, Wang L, Hu CJ. BRG1 and BRM chromatin-remodeling complexes regulate the hypoxia response by ac-ting as coactivators for a subset of hypoxia-inducible transcription factor target genes[J]. Mol Cell Biol, 2013, 33(19):3849-3863.

[12]Takeuchi JK, Lou X, Alexander JM, et al. Chromatin remodelling complex dosage modulates transcription factor function in heart development[J]. Nat Commun, 2011, 2:187.

[13]Dykhuizen EC, Hargreaves DC, Miller EL, et al. BAF complexes facilitate decatenation of DNA by topoisomerase IIα[J]. Nature, 2013, 497(7451):624-627.

[14]Wang F, Zhang R, Beischlag TV, et al. Roles of Brahma and Brahma/SWI2-related gene 1 in hypoxic induction of the erythropoietin gene[J]. J Biol Chem, 2004, 279(45):46733-46741.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

HIF-1α mediates hypoxia-induced Brm transactivation in endothelial cells

WANG Shou-xian1, 3, CHEN De-wei1, 3, GAO Wen-xiang1, 3, XU Gang2, 3, WU Gang1, 3, CHEN Jian2, 3, GAO Yu-qi2, 3

(1DepartmentofPathophysiologyandHighAltitudePathology,2InstituteofMedicineandHygienicEquipmentforHighAltitudeRegion,3KeyLaboratoryofHighAltitudeMedicineofPLA,CollegeofHighAltitudeMilitaryMedicine,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China.E-mail:gaoy66@yahoo.com;cdw528913@163.com)

AIM: To clarify the molecular mechanism of Brm activation in endothelial cells during hypoxia and hypoxic pulmonary hypertension. METHODS: Hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α) was over-expressed or depleted in the endothelial cells under hypoxia. Luciferase activity was assayed after transfection using a luciferase reporter assay system. The expression of Brm at mRNA and protein levels was detected by RT-qPCR and Western blot. The occupancy of HIF-1α onBrmpromoter was detected by the method of chromatin immunoprecipitation (ChIP). RESULTS: Brm expression was induced in cultured endothelial cells challenged with hypoxia. Over-expression ofHIF-1αenhanced, while the depletion ofHIF-1αattenuated Brm transactivation and expression under hypoxia. The results of ChIP revealed that hypoxia up-regulated the occupancy of HIF-1α onBrmpromoter. CONCLUSION: HIF-1α, which is induced by hypoxia, binds toBrmpromoter, and further promotes Brm transactivation in endothelial cells.

Hypoxic pulmonary hypertension; Hypoxia-inducible factor 1 alpha; Brm protein; Endothelial cells

1000- 4718(2017)04- 0577- 06

2016- 10- 18

2017- 01- 06

國家自然科學基金資助項目(No. 81501626); 軍隊重大項目(No. AWS14C007)；國家科技部“973”項目(No. 2012CB518201)

R392.12

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.001

△通訊作者 高鈺琪 Tel: 023-68752399; E-mail： gaoy66@yahoo.com; 陳德偉 Tel: 023-68752392; E-mail： cdw528913@163.com