CCR5第二胞外環的拮抗短肽對哮喘小鼠肺組織炎癥細胞浸潤和TNF-α表達的影響*

梁蓉蓉， 李雯靜▲， 劉 娟， 沈溪明， 黃花榮△

(中山大學孫逸仙紀念醫院 1兒科， 2病理科， 廣東 廣州 510120)

CCR5第二胞外環的拮抗短肽對哮喘小鼠肺組織炎癥細胞浸潤和TNF-α表達的影響*

梁蓉蓉1， 李雯靜1▲， 劉 娟1， 沈溪明2， 黃花榮1△

(中山大學孫逸仙紀念醫院1兒科，2病理科， 廣東 廣州 510120)

目的： 研究與CC趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5，CCR5)第二胞外環特異性結合的拮抗短肽對哮喘小鼠肺組織炎癥細胞浸潤和TNF-α表達的影響。方法: 篩選最適宜的卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏濃度，構建OVA誘導的BALB/c小鼠哮喘模型。模型構建成功后通過尾靜脈注射不同濃度拮抗短肽干預模型小鼠，HE染色對肺組織進行病理細胞學分析及炎癥分級，real-time PCR與Western blot實驗分別檢測小鼠肺組織TNF-α的mRNA和蛋白表達水平。結果: 篩選出的OVA最佳致敏濃度為500 mg/L (0.1 mL)。尾靜脈注射0.2 mL不同濃度(1.5 g/L、2.5 g/L和3.5 g/L)拮抗短肽干預哮喘小鼠，能減輕哮喘小鼠肺組織炎癥程度，抑制TNF-α的表達，以2.5 g/L濃度效果最佳，較模型組炎癥程度減輕2級，炎癥細胞數明顯減少，TNF-α的mRNA表達量較模型組下降近90%，蛋白表達水平下降約70%。同時該短肽(2.5 g/L)也起到了一定的預防作用，炎癥程度改善1級，TNF-α的mRNA及蛋白水平較模型組下降約50%左右。結論: CCR5第二胞外環的拮抗短肽能有效減輕哮喘小鼠肺組織炎癥程度，抑制TNF-α的表達。

CC趨化因子受體5； 拮抗短肽； 哮喘； TNF-α

哮喘的本質是氣道的慢性免疫性炎癥，氣道上皮細胞以及多種炎癥細胞和細胞組分共同參與其發生及發展[1-2]。研究表明趨化因子及其受體通過對炎癥細胞的募集與激活，在哮喘的發生發展中發揮重要作用，CC趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5， CCR5)具有調控T細胞和單核細胞/巨噬細胞系的遷移、增殖與免疫功能，成為近年來哮喘發病機制和治療的重要研究內容[3-4]，TNF-α是激活CCR5啟動子轉錄活性的關鍵環節，TNF-α是由激活的單核巨噬細胞分泌的Ⅱ型膜蛋白，通過與細胞膜上特異性受體結合，促進細胞生長、分化、凋亡及誘發炎癥，在哮喘多種炎癥細胞相互作用中發揮重要作用[5]。本研究擬探討不同濃度的CCR5第二胞外環拮抗短肽對卵白蛋白(ovalbumin, OVA)致敏的哮喘小鼠肺組織炎癥細胞的浸潤和TNF-α 表達的影響，為支氣管哮喘的精準治療提供新的靶點。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

1.1 動物 SPF級BALB/c小鼠70只，雌性，6～8周，體重20～22 g，由中山大學醫學動物實驗中心提供，許可證號為IACUC-DB-15-0702。

1.2 主要試劑與儀器 CCR5第二胞外環的拮抗短肽和OVA購自Sigma；TRIzol試劑盒和real-time PCR試劑盒購自TaKaRa；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成；TNF-α和NF-κB通路抗體購自CST。實時熒光定量PCR儀(Light Cycler 480)。

2 方法

2.1 模擬肽的合成 由中山大學孫逸仙紀念醫院鐘英強教授惠贈，純度>95%，用PBS將其稀釋成1.5 g/L、2.5 g/L和3.5 g/L 備用。

2.2 OVA誘導BALB/c小鼠哮喘模型的建立 參考文獻方法加以改良[6-7]，OVA溶液采用不同濃度(0、250、500和1 000 mg/L)加等量10%硫酸鋁鉀混勻，10 mol/L NaOH調pH值至6.5，室溫孵育60 min，離心750×g15 min，去上清使OVA仍保持原有濃度。于實驗開始時及第5天2次致敏，途徑采用腹腔+皮內注射相結合，總量為每只0.1 mL，其中腹腔注射0.05 mL，皮內分3點注射0.05 mL，于第12、13和14天開始予滴鼻激發。激發前用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉，將50 μL激發液(含100 μg OVA及生理鹽水)經鼻滴入，每天1次，連續3 d，利用小鼠自然呼吸將液滴吸入氣道，滴完后轉動小鼠體位數次以促進激發液在肺內均勻分布，緩慢分次進行。觀察小鼠激發后行為表現，根據表1從呼吸頻率、肺部聽診、咳嗽/噴嚏、持續時間及黏膜改變5個方面對小鼠行癥狀評分，根據得分對小鼠行哮喘發作程度分級：輕度2～4分；中度5～7分；重度8～10分。于實驗第15天收集標本，并對肺組織炎癥細胞計數及氣管周圍炎癥分級。

表1 小鼠激發后哮喘發作評分表

2.3 應用CCR5拮抗短肽在OVA誘導的BALB/c小鼠哮喘模型進行體內實驗 將70只小鼠隨機分為7組:空白對照組(control組)：等體積的NS代替OVA相同部位致敏、激發；哮喘致敏組(sensitization組)：OVA致敏(以篩選出最適宜的OVA致敏濃度，下同)，等體積的NS代替OVA激發；哮喘模型組(model組)：OVA致敏、激發；預防組(prevention組)：OVA致敏，第6天起通過尾靜脈予2.5 g/L拮抗短肽注射液(0.2 mL)，每天1次，共7 d，后激發同模型組；治療組(peptide組)：按治療劑量的不同分3個組，第15天起予OVA誘導的小鼠哮喘模型通過尾靜脈予3個梯度濃度(1.5 g/L、2.5 g/L和3.5 g/L)拮抗短肽注射液(0.2 mL)，每天1次，共7 d。

2.4 收集標本與炎癥分級 于實驗第22天各組小鼠眼眶取全血，斷頸處死后經右心室灌注，待雙肺組織發白后將肺組織分離，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色后進行肺組織病理細胞學觀察。先在低倍鏡下隨機選取10個視野，然后轉200倍鏡下分析。各類炎癥細胞進行分類直接計數，對氣管外周炎癥進行分級，共6級(每張切片炎癥分級=每個視野中支氣管周圍炎癥細胞分級總數/10個視野中支氣管總數，以3個淋巴細胞的厚度為1周)：1級為支氣管周圍缺乏炎癥細胞；2級為少于支氣管周長25%的散在炎癥細胞；3級為集中于支氣管周圍25%～75%周長的炎癥細胞；4級為圍繞支氣管1周的炎癥細胞浸潤；5級為圍繞支氣管2周的炎癥細胞浸潤；6級為圍繞支氣管3周或更多的炎癥細胞浸潤[8]，以評估氣道炎癥的嚴重程度；部分肺組織置于-80 ℃凍存。

2.5 Real-time PCR檢測TNF-α的mRNA表達水平 用TRIzol法提取肺組織總RNA，以β-actin為內參照，反應條件為95 ℃ 3 min;95 ℃10 s、55 ℃ 30 s、40個循環，根據Ct值，利用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達情況。TNF-α的上游引物為5’-CCT CTA GCC CAC GTC GTA GC-3’，下游引物為5’-AGC AAT GAC TCC AAA GTA GAC C-3’；β-actin的上游引物為5’-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3’，下游引物為5’-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC CG-3’。

2.6 Western blot檢測TNF-α蛋白的表達水平 用RIPA細胞裂解液收集蛋白，用BCA試劑盒將蛋白定量，加熱變性后進行SDS-PAGE；電泳后將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉搖床上室溫封閉60 min，加入相應 I 抗(使用1∶2 000的 TNF-α抗體)，4 ℃孵育過夜；TBST洗脫3次后加入 II 抗室溫下孵育60 min，TBST洗脫10 min、3次，用高靈敏度化學發光檢測試劑盒進行化學發光反應，顯影、定影，觀察蛋白條帶并用相關軟件(Image-Pro Plus 6.0)進行圖像分析。

3 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，計量資料采取均數±標準差(mean±SD)表示，結果采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用LSD法；等級資料結果采用多組有序多分類資料的秩和檢驗(Kruskal-WallisH檢驗)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 篩選OVA最佳致敏濃度

500 mg/L OVA組小鼠激發后癥狀為中度，小鼠體重、胃納和活動能力穩定，激發完畢后肺組織炎癥細胞浸潤程度適中，以嗜酸性粒細胞及淋巴細胞為主，支氣管外周炎癥分級為4.00±0.67，較空白對照組提高3倍左右，程度適中，故選取500 mg/L OVA (配成0.1 mL致敏液)構建小鼠哮喘模型。詳見圖1及表2、3。

Figure 1.The lung tissues of the mice stimulated with different concentrations of OVA observed with HE staining (×200).

圖1 各致敏濃度模型小鼠肺組織的HE染色觀察

表2 各致敏濃度模型小鼠激發后癥狀評分、程度及肺組織炎癥細胞的直接計數比較

Table 2.The score and degree of asthma attacks, and direct counting of inflammatory cells in the lung tissues after sensitization by different concentrations of OVA (Mean±SD.n=10)

GroupScoreDegreeInflammatorycellsEosinophilLymphocyteNeutrophil250mg/LOVA3.00±0.82Mild248±15*76±6*88±8*70±10*500mg/LOVA6.80±0.63Moderate329±12*#106±9*#118±9*#89±11*#1000mg/LOVA9.00±0.94Severe430±10*150±8* 174±10*92±12*Control0.00±0.00-35±3 8±215±3 10±3

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vs1 000 mg/L OVA group.

表3 各致敏濃度模型小鼠氣管外周炎癥分級的比較

*P<0.05vscontrol group.

2 OVA誘導BALB/c小鼠哮喘模型的特點

以最適宜致敏濃度(500 mg/L)的OVA 0.1 mL構建哮喘小鼠模型。如圖2所示，致敏組小鼠僅予致敏液致敏，鏡下可見支氣管周圍炎癥細胞呈灶性浸潤，炎癥細胞浸潤25%～75%，尚未完全包繞氣管，炎癥分級較空白對照組提高2倍左右(P<0.05)。模型組小鼠激發后明顯出現不同程度的頭面部瘙癢，呼吸加深加快，點頭呼吸，安靜少動，弓背，前肢縮抬，口唇、耳、尾巴黏膜發紫，雙肺聞及哮鳴音，二便失禁等哮喘急性相表現。肉眼可見肺臟體積增大，有形狀不規則的暗紅色充血區。鏡下可見支氣管及伴行血管周圍大量炎癥細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞為主。支氣管管腔內可見黏液栓，黏膜皺壁減少，杯狀細胞增生，血管平滑肌明顯增生，部分肺泡間隔融合形成肺氣腫。致敏組和模型組小鼠炎癥分級均在3級以上，空白對照組小鼠無陽性反應，確定哮喘模型建立成功。

3 CCR5第二胞外環拮抗短肽對小鼠肺組織病理細胞學的影響

致敏組與模型組的炎癥分級均明顯高于空白對照組，以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞為主，炎癥分級均在3級以上(P<0.05)。在拮抗短肽的干預下，預防組及各劑量治療組肺組織炎癥細胞數及炎癥分級出現不同程度減少和下降，以2.5 g/L短肽治療組效果最為顯著(P<0.05)，炎癥細胞總數較空白對照組減少近50%，以嗜酸性粒細胞及中性粒細胞減少最明顯，減少幅度約50%，炎癥分級降至2.30±0.67，較治療前改善了2級左右。預防組肺組織炎癥程度改善1級，與致敏組炎癥程度相近。詳見圖2及表4、5。

Figure 2.HE staining of lung tissue in different groups (×200).

圖2 各組小鼠肺組織HE染色的觀察

4 CCR5第二胞外環拮抗短肽對小鼠肺組織TNF-α mRNA表達水平的影響

相對于空白對照組，致敏組和模型組的TNF-α的mRNA相對表達量明顯升高，以模型組最為明顯，升高1倍左右，在拮抗短肽的干預下，預防組、1.5 g/L 短肽治療組、2.5 g/L短肽治療組及3.5 g/L短肽治療組的TNF-α mRNA相對表達量相較于致敏組及模型組均有不同程度的降低，其中預防組及1.5 g/L 短肽治療組較模型組表達量下調近50%左右，2.5 g/L短肽治療組治療效果最佳，TNF-α相對表達量相較于模型組下降了近90%(P<0.05)。3.5 g/L短肽治療組經拮抗短肽干預后， TNF-α mRNA相對表達量相較于模型組下調了60%左右,見圖3。

表4 各組肺組織炎癥細胞直接計數的比較

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsmodel group.

表5 各組小鼠氣管外周炎癥分級的比較

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsmodel group.

Figure 3.Comparison of the relative mRNA expression of TNF-α in the lung tissues of each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsmodel group；△P<0.05vs2.5 g/L peptide group.

圖3 各組小鼠肺組織TNF-α的mRNA表達水平

5 CCR5第二胞外環拮抗短肽對小鼠肺組織TNF-α蛋白表達水平的影響

相對于空白對照組，致敏組和模型組的TNF-α蛋白相對表達量明顯升高，以模型組最為明顯，升高1倍余，預防組、1.5 g/L短肽治療組、2.5 g/L短肽治療組及3.5 g/L短肽治療組的TNF-α蛋白相對表達量相較于致敏組及模型組均有不同程度的降低，其中預防組較模型組表達量下調近50%左右。1.5 g/L短肽治療組較模型組表達量下調近68%，2.5 g/L短肽治療組下調效果最佳，TNF-α蛋白相對表達量相較于模型組下降了70%左右(P<0.05)，3.5 g/L短肽治療組經拮抗短肽干預后， TNF-α相對表達量相較于模型組下調了55%左右,見圖4。

討 論

隨著哮喘的基礎研究不斷進展，構建小鼠哮喘模型的方法已較成熟，尤其以OVA致敏的BALB/c小鼠易產生氣道高反應性和高滴度的IgE[9]。為了增強免疫應答反應，本研究在致敏液配制過程中加入了氫氧化鋁。Hayashi等[10]研究發現雌性小鼠遲發型反應明顯強于雄性小鼠，故本實驗中均選取雌性的BALB/c小鼠。激發方式上，無論滴鼻激發還是霧化激發模型的成功率均很高。Jeong等[11]通過霧化OVA溶液20 min激發的哮喘模型也具有明顯的氣道炎癥和反應性；研究表明滴鼻激發建立的哮喘模型炎癥更明顯、穩定，且操作更加簡單[12]，故本研究采用滴鼻法激發小鼠哮喘發作模擬人類哮喘發病。以往主要是以肺組織是否存在明顯的嗜酸性粒細胞浸潤為標準判斷造模的成功與否，沒有明確的診斷標準。本研究首先采用了激發后小鼠的癥狀評分，同時結合肺組織炎癥細胞計數及支氣管周圍炎癥分級來確定造模是否成功以及炎癥的程度，使得模型的建立更加客觀與精準。

Figure 4.Comparison of the relative protein expression of TNF-α in the lung tissues of each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsmodel group；△P<0.05vs2.5 g/L peptide group.

圖4 各組小鼠肺組織TNF-α蛋白表達水平

近年來研究表明CCR5在哮喘、炎癥性腸病、類風濕關節炎、COPD等疾病的發生發展中起重要作用[13-14]。CCR5能夠調控T細胞和單核細胞/巨噬細胞系的遷移、增殖與免疫功能，CCR5與其特異性配體RANTES、MIP-1、MIP-1b結合后，通過酪氨酸激酶信號轉導，引發白細胞的趨化性、炎癥因子的釋放(如TNF-α、IL-6、IL-8等)及炎癥反應等各種生理功能。TNF-α作為重要的促炎癥因子，能刺激氣道平滑肌，產生RANTES、IL-8和GM-CSF，增加ICAM-1的表達，促進炎癥細胞在氣道表面的黏附力，并可趨化嗜酸粒細胞釋放LTs、PAF、PG等炎性介質，還可刺激其它對氣道有強烈收縮作用的物質產生，如內皮素等，從而使哮喘的炎癥反應更強烈，在誘導哮喘多細胞相互作用中發揮重要作用[15]。因此對CCR5及其拮抗劑的研究，為多種免疫炎癥性疾病的治療提供了新的方法[16]。Suzaki 等[17]利用TAK 799 (一種新型CCR5 和CXCR3拮抗劑)干預小鼠哮喘模型，結果發現該拮抗劑可以下調CCR5、CXCR3及Th1 型細胞因子的表達，改善肺功能、減輕氣道炎癥，起到防止哮喘發生、發展的作用。Lefebvre等[18]利用CCR2/CCR5拮抗劑cenicriviroc干預動物肝腎纖維化模型，結果發現cenicriviroc發揮了顯著的抗炎及抗纖維化作用。

CCCR5的天然結構存在3個胞外環。在研究HIV感染人體的過程時發現，R5嗜性的HIV-1主要是通過其膜蛋白gP120與細胞表面輔助受體CCR5的N端和第二胞外環相互作用，從而介導HIV-1進入細胞內[19]。由于第一、三胞外環較短，沒有明確的生物學功能，因此在本研究選取的是CCR5第二胞外環的拮抗短肽。本課題組先前應用噬菌體展示肽庫技術淘選了大鼠CCR5第一、二胞外環特異性結合的活性拮抗肽，并進行了初步鑒定[20]。在本研究中，我們發現CCR5第二胞外環的拮抗短肽能有效減輕哮喘小鼠肺組織炎癥程度，抑制TNF-α的表達，且具有濃度依賴性和飽和性。同時，在哮喘小鼠激發前給予一定劑量的拮抗短肽(2.5 g/L)也能夠在一定程度上減輕其炎癥程度及TNF-α的表達，這提示CCR5第二胞外環的拮抗短肽在小鼠哮喘模型中起到了一定的抗炎作用。傳統哮喘的治療主要以β受體激動劑及糖皮質激素為主，但因不少不良反應而在一定程度上限制其長期應用。傳統的哮喘治療藥物大多是在炎癥細胞進入組織后才發揮作用的，而CCR5第二胞外環拮抗短肽則是通過抑制炎癥細胞進入組織起到治療作用，在哮喘的急性期使用能有效緩解炎癥程度。

綜上所述，本研究首先發現了在哮喘小鼠體內應用CCR5第二胞外環的拮抗短肽能有效減輕哮喘小鼠肺組織炎癥程度，抑制TNF-α的表達，證實CCR5在哮喘進程中發揮重要作用，為哮喘治療提供了新靶點。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of antagonistic peptide specifically binding to second extracellular loop of CCR5 on inflammatory cell infiltration and TNF-α expression in lung tissues of asthmatic mice induced by OVA

LIANG Rong-rong1, LI Wen-jing1, LIU Juan1, SHEN Xi-ming2, HUANG Hua-rong1

(1DepartmentofPediatrics,2DepartmentofPathology,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:hhrvivi@126.com)

AIM: To investigate the effects of antagonistic peptide specifically binding to the second extracellular loop of CC chemokine receptor 5 (CCR5) on inflammatory cell infiltration and TNF-α expression in lung tissues of asthmatic mice. METHODS: The asthmatic model of BALB/c mice was induced by ovalbumin (OVA) and the optimal sensitization concentration of OVA was screened. After modeling, the mice were intervened by gradual concentrations of antagonistic peptide via tail-vein injection. The pathocytological analysis and grading were performed in the lung tissues with HE staining. The expression of TNF-α at mRNA and protein levels in the lung tissues was determined by real-time PCR and Western blot. RESULTS: The optimal concentration of OVA was 500 mg/L (0.1 mL) as this concentration of OVA stably induced moderate degree of inflammation in the BALB/c mice. Treatment with different concentrations (1.5 g/L, 2.5 g/L and 3.5 g/L) of antagonistic peptide at 0.2 mL through tail-vein injection inhibited the expression of TNF-α, and markedly reduced the degree of inflammation in the lung tissues. The optimal concentration of antagonistic peptide was 2.5 g/L as the lung inflammation degree in 2.5 g/L group alleviated by 2 grades, and the number of inflammatory cells was also significantly reduced. Moreover, the mRNA expression abundance of TNF-α was nearly decreased by 90%, and the protein expression of TNF-α was decreased by 70% compared with model group. Meanwhile, the use of antagonistic peptide at 2.5 g/L before OVA stimulation confirmed the preventive function to some degree. In this group, the lung inflammation degree alleviated by 1 grade， and the expression of TNF-α at both mRNA and protein levels decreased by nearly 50%. CONCLUSION: The antagonistic peptide of CCR5 effectively inhibits the expression of TNF-α and relieves the inflammation in the asthmatic mouse lung tissues in a concentration-dependent manner.

CC chemokine receptor 5; Antagonistic peptide; Asthma; TNF-α

1000- 4718(2017)04- 0596- 07

2016- 12- 19

2017- 01- 16

廣東省自然科學基金資助項目(No. 2014A030313020； No. 2015A030313027； No. 2016A03031343)

R725.6； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.004

△通訊作者 Tel： 020-81332003； E-mail： hhrvivi@126.com

▲并列第1作者