精氨酸加壓素翻轉脂多糖引起大鼠發熱及其對痛覺敏感性的影響*

李博萍， 孟 立， 羅 蓉， 胥建輝， 楊永錄△

(1成都醫學院體溫與炎癥四川省高校重點實驗室，四川 成都 610500; 2隴東學院岐伯醫學院, 甘肅 慶陽 745000)

精氨酸加壓素翻轉脂多糖引起大鼠發熱及其對痛覺敏感性的影響*

李博萍1, 2， 孟 立1， 羅 蓉1， 胥建輝1， 楊永錄1△

(1成都醫學院體溫與炎癥四川省高校重點實驗室，四川 成都 610500;2隴東學院岐伯醫學院, 甘肅 慶陽 745000)

目的： 研究外周給精氨酸加壓素(AVP)對脂多糖(LPS)引起的大鼠發熱和痛覺過敏的影響，以及與血清中IL-1β和PGE2水平變化的關系。方法: 實驗用成年雄性SD大鼠，在23 ℃環境溫度下，明暗時間各12 h。用無線遙測系統連續測量大鼠體核溫度(Tc)、棕色脂肪溫度(TBAT)和活動。10:00或11:30分別給大鼠腹腔注射LPS(50 μg/kg)、AVP(10 μg/kg)或V1a受體阻斷劑(30 μg/kg)。用ELISA法測定血清IL-1β和PGE2的含量。用足底痛覺測試儀(Hargreaves test)測試大鼠熱痛縮爪潛伏期的變化。結果: (1) 腹腔注射LPS引起大鼠雙相發熱過程伴有痛覺過敏現象。 (2) AVP能夠翻轉LPS引起的Tc和TBAT升高反應，降低發熱引起的痛覺敏感性。(3) 外周給V1a受體阻斷劑能提高LPS引起的發熱反應，但不影響發熱引起的痛覺敏感性變化。(4) AVP能抑制LPS引起的發熱大鼠血液中IL-1β和PGE2水平升高。結論: (1) 外周給予AVP可通過抑制棕色脂肪產熱以及降低血液中IL-1β和PGE2的濃度而翻轉LPS發熱反應并降低發熱伴隨的痛覺敏感性升高現象。(2) 內源性AVP也有限制LPS發熱的作用，但可能不影響發熱引起的痛覺閾值降低現象。

精氨酸加壓素； 發熱； 脂多糖； 痛覺過敏

發熱伴有疼痛和痛覺敏感性升高是臨床上常見的癥狀。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起發熱及痛覺敏感性升高與LPS引起機體釋放白細胞介素1β(interleukine-1β，IL-1β)、白細胞介素6(interleukine-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和前列素E2(prostaglandin E2，PGE2)等炎性細胞因子有關[1-3]。炎性細胞因子引起發熱和作用于外周傷害感受器可引起痛覺和疼痛過敏反應[1-2]。最近報道，組織固有巨噬細胞在炎癥的發生發展、疼痛和痛覺過敏中也發揮重要的作用[3]。

精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)是下丘腦視上核和室旁核神經元產生的一種九肽激素，參與維持體液平衡、血壓、抗利尿、學習和記憶功能。另外,AVP在正常體溫調節、退熱和痛覺調制中也發揮重要的作用[4-9]。雖然許多學者分別對AVP的退熱和鎮痛作用進行了研究[6-9]，但關于AVP影響LPS引起的發熱與痛覺敏感性的時間曲線變化及其機制研究不多，故本研究觀察了AVP影響LPS性發熱與痛覺敏感性變化的時間曲線，并測定棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)產熱和血清中IL-1β和PGE2水平的變化。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和試劑

實驗用成年雄性SD大鼠(四川醫學科學院實驗動物研究所購買)89只，體重230～290 g。LPS、AVP和AVP V1a受體阻斷劑均購于Sigma，用無菌生理鹽水分別稀釋LPS、AVP和V1a受體阻斷劑，分裝并儲存于-30 ℃待用。大鼠IL-1β和PGE2的 ELISA試劑盒為BD產品。

2 實驗方法

2.1 溫度和活動記錄的實驗方法 用DSI生產的無線遙測溫度傳感器(model TA10TAM2-F40-TT)連續測量大鼠體核溫度(Tc)、BAT溫度(TBAT)和活動的變化。術前用1%碘伏溶液浸泡手術器械和傳感器60 min以上，腹腔注射4%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)麻醉動物，手術操作同以往的工作[5]。手術后，肌肉注射青霉素(2×104U)以防感染，然后讓動物恢復7 d以上再進行實驗。

2.2 實驗分組與步驟 實驗分為4組：(1) 對照組(n=7)：生理鹽水(1 mL/kg)+生理鹽水(1 mL/kg)；(2) LPS組(n=8)： LPS (50 μg/kg)+生理鹽水(1 mL/kg)；(3) LPS+AVP組(n=7)： LPS (50 μg/kg)+AVP (10 μg/kg)；(4) LPS+V1a阻斷劑組(n=7)： LPS (50 μg/kg)+V1a阻斷劑組(30 μg/kg)。

實驗前一天下午，大鼠稱重后置于23 ℃人工氣候箱內(重慶永生實驗儀器廠產品)進行適應性過夜，動物處于自由活動、進食和進水狀態。氣候箱內晝光期和暗光期時間各12 h，即06:00～18:00開燈，18:00～次日06:00關燈。實驗當天06:00開始記錄大鼠Tc和活動，10:00 先給動物腹腔注射鹽水或LPS，11:30再次給動物注射生理鹽水、AVP或V1a受體阻斷劑，然后連續記錄到18:00。

判定體溫變化的指標：用平均體溫反應曲線和體溫反應最大幅度與基線體溫之間的差(ΔT)表示。

2.3 大鼠足底痛覺敏感性的測定 用Ugo生產的足底痛覺測試儀(Hargreaves test)測試痛覺敏感性的變化。將3只大鼠分別放置于三格圍箱的一格中，待動物適應環境后，將玻璃框下的紅外發生器直接放到大鼠后足下方，移動紅外發生器，用其發出的白光瞄準測試部位，動物感覺疼痛時立即縮回后足需要的時間即為熱刺激痛覺反應潛伏期，縮回反應時間可以精確到0.1 s。用痛覺反應潛伏期的變化表示痛覺閾值高低的變化。每次測量間隔1 min，連續測量5次，取其平均值。然后每間隔30 min,以同樣方法進行下一次測量。實驗動物分組和給藥方法同2.2。

2.4 血清IL-1β和PGE2水平的測定 實驗標本來自于3組大鼠，即對照組、LPS組和LPS+AVP組，給藥時間和方法同2.2。用含有促凝劑的一次性真空采血管經心臟穿刺抽取血液并將其放在冰中，然后用低溫離心機3 000 r/min離心15 min分離血清,并分裝儲存于-30℃冰箱中，以備測定血清IL-1β和PGE2含量。用ELISA法測定血清IL-1β和PGE2的含量,具體操作嚴格按照試劑盒說明進行。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(A)。以標準品濃度為橫坐標，對應A值為縱坐標,繪制出標準曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

3 統計學處理

采用SPSS 19.0進行統計學分析。實驗數據用均數±標準誤(mean±SEM)表示。各組間采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 LPS引發熱與痛覺敏感性的變化

對照組和LPS組動物給藥前Tc基線水平分別為36.97～37.17 ℃和36.99～37.19 ℃，兩組之間的差異無統計學顯著性；分別注射生理鹽水和LPS后，均出現短暫的輕度Tc升高反應，即應激性體溫升高反應。注射LPS 90 min后，Tc才出現升高反應；150 min出現第1熱相，Tc為(37.92±0.16) ℃；330 min出現第2熱相，Tc為(38.11±0.18) ℃；480 min后Tc恢復到接近給藥前水平。對照組注射鹽水后，Tc無明顯變化。LPS對動物活動無明顯影響。

LPS能明顯縮短大鼠熱痛縮爪反應潛伏期，腹腔注射LPS后60 min，熱痛縮爪反應潛伏期開始出現縮短，較Tc開始升高的時間提前30 min。LPS后120 min熱痛縮爪反應潛伏期由給藥前(12.23±1.43) s減少到(8.54±1.03) s，與給藥前和同時點對照組比較有明顯差異(P<0.05)，持續到給予LPS后360 min，見圖1。

Figure 1.Time course of core temperature (A), hyperalgesia (B) and motor activity (C) following intraperitoneal injection of LPS or saline. Mean±SEM.*P<0.05,**P<0.01vssaline.

圖1 腹腔注射LPS或生理鹽水后體核溫度與痛覺敏感性以及動物活動變化的時間曲線

2 AVP翻轉LPS引起的發熱反應并降低痛覺敏感性

10:00腹腔注射LPS 90 min后， 即Tc開始出現升高時注射AVP能完全翻轉LPS引起的發熱反應。給予AVP 30 min后，Tc由給藥前(36.93±0.25) ℃降低到(35.11±0.21) ℃，分別與給藥前和LPS大鼠同時點Tc比較降低1.82 ℃和2.46 ℃。給予AVP 80 min后，Tc恢復到接近給藥前水平，但隨后又出現短暫的下降反應，大約300 min 后Tc接近LPS大鼠的Tc，見圖2。用雙探頭溫度遙測傳感感器同步記錄AVP對LPS引起BAT產熱影響，給AVP 40 min后，TBAT由給藥前(36.48±0.21) ℃降低到(35.52±0.26) ℃，即較給藥前降低0.95 ℃，與同時點Tc比較降低幅度小和恢復速度快，但二者差異無統計學顯著性，見圖3。

在AVP翻轉LPS性發熱過程中，大鼠熱痛縮爪反應潛伏期較LPS組明顯延長，給AVP 后30 min與60 min熱痛縮爪反應潛伏期分別為(13.17±1.07) s和(12.45±1.26) s，較LPS大鼠同時間的潛伏期分別延長4.63 s和4.35 s (P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effects of intraperitoneal injection of AVP on LPS-induced fever (A) and hyperalgesia (B). Mean±SEM.*P<0.05,**P<0.01vsLPS.

圖2 腹腔注射AVP對LPS引起發熱與伴隨痛覺敏感性變化的影響

3 V1a受體阻斷劑對LPS引起的大鼠發熱反應與痛覺敏感性的影響

腹腔注射V1a受體阻斷劑能提高LPS發熱的幅度，第1熱相和第2熱相的峰值較LPS組均出現升高現象，但差異不明顯。V1a受體阻斷劑對LPS性發熱大鼠熱痛縮爪潛伏期無明顯影響，見圖4。

Figure 3.Effects of AVP on changes of core and BAT temperature following intraperitoneal administration of LPS. A: the changes in core and BAT temperature at 40 min after AVP treatment; B: time-dependent changes of core and BAT temperature. Mean±SEM.n=6.

圖3 腹腔注射AVP對LPS引起的Tc 和TBAT變化的影響

4 AVP對LPS引起的發熱大鼠血清IL-1β和PGE2水平的影響

給大鼠腹腔注射LPS 120 min后，血清中IL-1β和PGE2濃度明顯高于鹽水組；注射AVP能明顯抑制IL-1β和PGE2濃度的升高反應，見表1。

討 論

本實驗首先觀察了LPS引起大鼠發熱反應與痛覺敏感性變化的時間曲線。腹腔注射LPS 90 min后，大鼠Tc開始升高，隨后出現雙相發熱反應；痛覺敏感性也出現明顯升高反應，而大鼠的活動無明顯變化，實驗結果與文獻報道相似[1-3, 10-11]。需要指出的是本實驗測定了LPS引起發熱全過程的痛覺敏感性變化。實驗顯示，腹腔注射LPS后 60 min Tc未出現升高反應時，大鼠熱痛縮爪反應潛伏期縮短注射，即痛覺敏感性出現升高現象，這種現象持續于發熱全過程，說明LPS發熱過程伴有痛覺敏感性升高反應，但痛覺敏感性升高反應的時間先于Tc上升的時間，提示腹腔注射LPS 60 min后可能出現炎性因子IL-1β和PGE2升高，而導致痛覺敏感性升高。

Figure 4.The effects of intraperitoneal injection of V1a antagonist (V1a-ant) on LPS-induced fever (A) and hyperalgesia (B). Mean±SEM.

圖4 腹腔注射V1a受體阻斷劑對LPS引起的發熱和痛覺敏感性變化的影響

表1 AVP對腹腔注射LPS引起的血清中IL-1β 和PGE2變化的影響

*P<0.05,**P<0.01vssaline；#P<0.05vsLPS.

AVP不僅在維持正常體溫恒定及體溫晝夜節律中有緊張性溫調節作用[5-7]，而且也有限制發熱和促進退熱的作用[7,10]。但以往研究采用熱電偶溫度計或電子溫度計不能連續測量AVP退熱的體溫時間曲線變化，因而本實驗用無線遙控測溫技術連續測量AVP對LPS引起的大鼠發熱效應的影響。令人感興趣的是外周給予AVP能夠翻轉LPS發熱反應，Tc不僅明顯低于對照組(LPS組)，而且也較給藥前基線水平低1.62 ℃。AVP翻轉LPS發熱反應與文獻報道AVP只能部分阻斷LPS發熱的實驗結果完全不一致，但與我們以往用無線遙控測溫技術連續測量AVP引起正常大鼠低溫反應的結果相似[5, 12]。解釋以往研究者往大鼠中樞和外周注射AVP的實驗結果是困難的，我們分析可能是由于以往研究者用人工操作測溫法，反復測量直腸溫度引起動物應激性Tc升高干擾了AVP的降溫作用，從而導致虛假實驗現象[4, 12]。

動物實驗和臨床均證明，BAT是人與哺乳動物體內非戰栗產熱的主要來源，在維持能量平衡和體溫恒定中發揮重要作用[13]。TBAT的變化可以作為評估其產熱變化的指標[5 ,12]。因而，我們也同步觀察了AVP對給LPS大鼠TBAT的影響。實驗觀察到AVP能快速降低TBAT，但其恢復時間較Tc快，證明AVP對LPS發熱效應的翻轉作用與其能快速降低BAT產熱有關；而TBAT恢復速度快，提示BAT快速恢復產熱作用使體內熱量增多，有利于Tc的恢復。

本實驗表明，腹腔注射V1a受體阻斷劑能提高LPS發熱反應，即第1熱相和第2熱相峰值高于LPS組，提示內源性AVP不僅能通過V1a受體參與晝光期正常大鼠緊張性體溫調節[4-5], 也可能通過V1a受體參與限制LPS的發熱反應。實驗中給大鼠腹腔注射AVP能明顯降低LPS引起的痛覺敏感性升高反應，即提高痛覺閾值，這種降低痛覺敏感性持續時間與AVP翻轉LPS性發熱持續時間一致，證明AVP在退熱的同時有提高痛覺閾值的作用。但V1a受體阻斷劑對LPS發熱過程中伴有的痛覺敏感性無明顯影響，這可能是正常生理濃度AVP不影響LPS引起的痛覺閾值降低反應。

LPS通過激活單核和巨噬細胞產生IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2等致炎性介質，而引起發熱和痛覺敏感性增加現象[1-3]。文獻報道，AVP能抑制內毒素誘導的血細胞內生致熱原生成和抑制LPS誘導的IL-1β與PGE2生成[14-16]。為了進一步研究AVP的退熱和降低痛覺敏感性是否與其抑制致炎性細胞因子有關，我們測定了外周給予AVP對血清中IL-1β和PGE2水平的影響。實驗結果顯示，AVP翻轉LPS發熱大鼠Tc下降到最低點和大鼠熱痛縮爪反應潛伏期最長時點一致，血清中IL-1β和PGE2的水平均明顯低于LPS發熱動物的濃度，表明AVP退熱作用和降低痛覺敏感性與其能抑制血液中IL-1β和PGE2的濃度有關。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Arginine vasopressin reverses fever induced by lipopolysaccharide in rats and its effect on hyperalgesia

LI Bo-ping1, 2, MENG Li1, LUO Rong1, XU Jian-hui1, YANG Yong-lu1

(1KeyLaboratoryofThermoregulationandInflammationofSichuanHigherEducationInstitutes,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China;2SchoolofQiboMedicine,LongdongCollege,Qingyang745000,China.E-mail:ylyang9@sohu.com)

AIM: To investigate the effect of peripheral administration of arginine vasopressin (AVP) on lipopolysaccharide (LPS)-induced fever and hyperalgesia in rats and its relationship with interleukine-1β (IL-1β) and prostaglandin E2(PGE2).METHODS: The core temperature (Tc), brown adipose tissue (BAT) temperature and activity were measured by telemetry in adult male Sprague-Dawley rats at an ambient temperature of 23 ℃ during a 12 h light/12 h dark photoperiod (lights on at 06:00 and lights off at 18:00). The rats were intraperitoneally injected with LPS (50 μg/kg), AVP (10 μg/kg) or V1a vasopressin receptor antagonist (V1a antagonist, 30 μg/kg) at 10:00 or 11:30. Hyperalgesia was assessed by measuring the latency to withdraw a hindpaw from radiant heat (Hargreaves test). The concentrations of IL-1β and PGE2in the serum were tested by ELISA. RESULTS: Intraperitoneal administration of LPS induced periods of biphasic fever accompanied by hyperalgesia. AVP reversed LPS-induced fever, and decreased the hyperalgesia and BAT thermogenesis. Peripheral administration of V1a antagonist enhanced the fever produced by LPS, but did not affect the hyperalgesia. AVP significantly attenuated LPS-induced IL-1β and PGE2production. CONCLUSION: Peripheral administration of AVP reverses LPS-induced fever and decreases hyperalgesia by reduction of BAT thermogenesis and inhibition of IL-1β and PGE2. Endogenous AVP attenuates the fever induced by LPS, but does not affect the nociceptive thresholds.

Arginine vasopressin; Fever; Lipopolysaccharide; Hyperalgesia

1000- 4718(2017)04- 0635- 05

2017- 01- 03

2017- 01- 20

國家自然科學基金資助項目(No. 30870901)；成都醫學院科研基金資助項目(No. CYZ09-005)

R33-33； R364.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.010

△通訊作者 Tel: 028-62739330; E-mail: ylyang9@sohu.com