槲芪散可通過激活Hedgehog信號通路抑制大鼠肝癌前病變的形成*

李若菲， 白云飛， 王蕓姣， 杜尊贖， 韓文祺， 王學江， 江 瑛

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院， 北京 100069)

槲芪散可通過激活Hedgehog信號通路抑制大鼠肝癌前病變的形成*

李若菲， 白云飛， 王蕓姣， 杜尊贖， 韓文祺， 王學江， 江 瑛△

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院， 北京 100069)

目的： 探討槲芪散是否通過調控Hedgehog信號通路抑制大鼠肝癌前病變的機制。方法: 采用改良的Solt-Farber二步法復制大鼠肝癌前病變模型，于肝大部切除術后3 d開始給予槲芪散(8 g/kg)灌胃治療，4周后收集血清和肝臟標本。分別采用HE染色、免疫組織化學、免疫熒光染色、Western blot、實時熒光定量PCR等方法，觀察肝臟病理變化，檢測肝組織谷胱甘肽S-轉移酶π(glutathioneS-transferase-π，GST-π)、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、OV6、白蛋白(albumin， ALB)、Hedgehog信號分子Shh、Smo、Gli2及下游靶分子cyclin D、cyclin E的表達水平；利用比色法檢測血清丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和γ-谷氨酰轉移酶(gamma-glutamyltransferase，GGT)水平；給予Hedgehog信號通路抑制劑環(huán)杷明觀察槲芪散在體外對肝卵圓細胞的影響。結果: 與模型組比較，槲芪散可降低肝癌前病變大鼠血清ALT、AST和GGT水平，減輕肝癌前病變大鼠肝臟的病理變化，降低肝癌前病變標志物GST-π和AFP的表達；槲芪散可促使肝卵圓細胞標志物OV6和肝細胞標志物ALB的表達；槲芪散可激活肝臟Hedgehog信號通路，增加Shh、Smo、Gli2及其下游靶分子cyclin D、cyclin E的表達。結論: 中藥復方槲芪散可通過激活Hedgehog信號通路促進肝前體細胞增殖和誘導肝前體細胞向肝細胞分化，抑制肝癌前病變的形成，促進肝臟修復。

肝癌前病變； Hedgehog信號通路； 肝前體細胞； 槲芪散

原發(fā)性肝癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國位居所有惡性腫瘤中的第3位。由于肝癌起病隱匿、進展迅速、惡性程度高、易轉移和復發(fā)等特點，肝癌的死亡率在我國已躍居所有惡性腫瘤中第2位[1]。目前認為肝癌的發(fā)生和發(fā)展是一種長期的、多因素影響的、多基因參與的、癌細胞與微環(huán)境和機體代謝免疫等因素間相互作用的復雜連續(xù)過程。肝癌前病變是肝癌發(fā)生過程的必經階段，由肝癌前病變進展為肝癌的發(fā)生機制至今仍不清楚。因此探討肝癌形成和進展的可能機制以及尋找相關的干預措施成為肝癌防治研究的重要課題之一。Hedgehog信號通路是一條高度保守的信號轉導通路，具有調控前體細胞的自我更新、增殖及分化的功能，不僅在機體內環(huán)境的穩(wěn)定和組織修復中發(fā)揮重要作用，而且與惡性腫瘤的侵襲和轉移[2-3]密切相關。中藥復方槲芪散(Huqi San，HQS)系錢英教授在臨床應用多年的經驗方，具有逆轉肝纖維化和抑制肝癌前病變的功效[4]，但其具體作用機制尚不十分清楚。本研究旨在探討槲芪散是否通過調控Hedgehog信號通路抑制大鼠肝癌前病變的機制，為槲芪散的進一步臨床應用提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物

雄性 Wistar大鼠45只，6周齡，體重120～140 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，于首都醫(yī)科大學實驗動物中心飼養(yǎng)，動物合格號為SCXK(京 2012-00011)。采用數(shù)字表法將大鼠隨機分為3組(每組15只)：對照(control)組、模型(model)組及槲芪散(HQS)組。采用改良的Solt-Farber二步法[5-6]復制大鼠肝癌前病變模型,即給予大鼠腹腔一次性注射二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN; 200 mg/kg)作為啟動劑，2周后皮下植入二乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene，2-AAF)進入選擇性促進程序，于第3周行肝大部切除術，治療組于肝大部切除術后3 d開始連續(xù)給予槲芪散(8 g/kg)灌胃治療，對照組和模型組給予等量生理鹽水，4周后，在10%的水合氯醛腹腔麻醉下，手術快速收集肝臟標本，并分別固定于4%甲醛和凍存于-80 ℃冰箱備用。

2 主要試劑

DEN購自Sigma；2-AAF購自Innovative Research；兔抗鼠谷胱甘肽S-轉移酶π(glutathioneS-transferase-π，GST-π)多克隆抗體購自MBL；兔抗鼠甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)多克隆抗體購自Biomedicine；兔抗鼠Shh、Smo和Gli2多克隆抗體均購自Santa Cruz；兔抗鼠cyclin D和cyclin E多克隆抗體均購自Cell Signaling Technology；Smo抑制劑環(huán)杷明(cyclopamine)購自Selleck；檢測丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase， ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和γ-谷氨酰轉移酶(gamma-glutamyltransferase,GGT)的試劑盒購自Roche；免疫組化試劑盒購自中杉金橋公司；RT-qPCR試劑盒購自Promega；引物根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

3 實驗方法

3.1 HE染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蘇木素染色5～10 min，伊紅染色1 min，脫水、透明、中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察并攝片。

3.2 免疫組織化學染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，微波修復抗原，3%H2O2處理10 min以封閉內源性過氧化物酶； BSA封閉1 h。滴加I抗(GST-π和AFP)，4℃濕盒過夜。加HRP標記的II抗，37 ℃孵育1 h， DAB顯色，顯微鏡下觀察以確定顯色時間，蘇木素復染核。脫水、透明、中性樹脂封片，光學顯微鏡觀察并攝片。

黍子的施肥宜早不宜遲，為了保證幼苗養(yǎng)分供應，要注意施足種肥，每畝尿素3-5斤。黍子追肥是一項有效的增產措施，第一次追肥在撥節(jié)前配合澆水進行，畝追尿素10-15斤，可促進幼苗生長強壯。孕穗期追第二次肥以10斤為宜，這次追肥能促進穗大粒多，籽粒飽滿。

3.3 免疫熒光染色 冰凍切片于丙酮固定10 min(4 ℃)，1% BSA 封閉30 min，孵育 I 抗(OV6和Gli2)，置于濕盒中4 ℃過夜,滴加熒光標記的Ⅱ抗(FITC和Cy3)1 h， DAPI復染細胞核， 抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察并攝片。

3.4 Western blot法檢測GST-π、AFP、cyclin D、cyclin E、Shh、Smo、Gli2和ALB的蛋白水平 用含蛋白酶抑制劑的裂解液裂解組織，利用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白定量，按約50 μg的蛋白量上樣，經SDS-PAGE后，低溫恒壓電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，I 抗4 ℃孵育過夜, 加入HRP標記的 II 抗，室溫下孵育1 h，ECL化學發(fā)光，ImageJ進行定量分析。

3.5 RT-qPCR實驗 采用TRIzol提取肝組織總RNA，利用Promega反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，用實時熒光定量PCR檢測Shh、Smo、Gli2基因和內參照18S的表達水平。Shh的上游引物為5’-TCTCGAGACCCAACTCCGAT-3’,下游引物為5’-TAACCTTGCCTGCTCTTGCT-3’;Smo的上游引物為5’-ATGCGTGTTTCTTTGTGGGC-3’,下游引物為5’-ACACAGGATAGGGTCTCGCT-3’;Gli2的上游引物為5’-AACATGAGCCCTTCTGCTCC-3’,下游引物為5’-TGCCAGACCTCACTTCGTTC-3’；18S的上游引物為5’-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3’，下游引物為5’-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3’。PCR條件為:95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s；共40循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算mRNA表達。

3.6 全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST和GGT水平 大鼠血清ALT、AST和GGT水平的檢測采用Roche的試劑盒(IFCC酶比色法)在Cobas C311 全自動生化分析儀上進行，由首都醫(yī)科大學臨床檢驗中心完成檢測。

3.7 細胞培養(yǎng) 大鼠肝卵圓細胞系WB-F344由首都醫(yī)科大學友誼醫(yī)院尤紅教授饋贈。WB-F344 細胞貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2孵箱中進行培養(yǎng)，每2～3 d傳代。細胞依據(jù)處理方式不同分為WB-F344細胞對照組、HQS藥物血清組、cyclopamine組和HQS+cyclopamine組。細胞培養(yǎng)用HQS藥物血清終濃度為15%，作用于細胞72 h；cyclopamine終濃度為5 mmol/L, 作用于細胞48 h。

4 統(tǒng)計學處理

計量數(shù)據(jù)以SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 大鼠肝癌前病變的病理變化觀察

肉眼觀察，與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟顏色略淺，表面粗糙，可見許多灰白色直徑1～3 mm的細小顆粒，再生肝葉飽滿邊緣鈍；與模型組比較，槲芪散組肝臟病變明顯減輕，表面較光滑，再生肝葉飽滿體積較大。鏡下觀察，模型組肝組織結構紊亂，可見肝細胞變性和壞死，匯管區(qū)小膽管增生，沿小膽管外側可見核呈圓形或卵圓形、胞漿較少的卵圓細胞增生，并可見異型增生的嗜酸細胞灶、嗜堿細胞灶和透明細胞灶，異型增生灶細胞密集成團，體積較肝細胞小，細胞核漿比增大，與文獻報道[5]結果一致；而槲芪散組可見大部分肝小葉結構近乎完整，匯管區(qū)小膽管顯著增生，部分肝細胞可見脂肪變性，但細胞異型增生灶顯著減少，見圖1。

Figure 1.The histopathological observation of the liver tissues in the rats. A: bulk specimen; B: HE staining (×100).

圖1 各組大鼠肝臟病理變化

2 大鼠血清ALT、AST和GGT的變化

與正常對照組比較,模型組大鼠血ALT、AST和GGT水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，槲芪散組ALT、AST和GGT水平明顯下降(P<0.05)，見圖2。

3 大鼠肝組織GST-π和AFP蛋白表達水平的變化

與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟癌前病變標志物GST-π及肝癌標志物AFP的表達水平明顯增加，陽性病灶多呈圓形或類圓形分布，主要定位于細胞漿中(P<0.01)；與模型組比較，而槲芪散組大鼠肝組織GST-π及AFP的表達水平明顯降低，陽性表達灶的強度和面積明顯減少(P<0.05),見圖3。上述結果表明槲芪散抑制大鼠肝癌前病變的形成。

Figure 2.The activity of ALT, AST and GGT in the rat serum. Mean±SD.n=15.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖2 各組大鼠血清ALT、AST和GGT的水平

Figure 3.The protein expression of GST-π (A) and AFP (B) in the rat liver tissues measured by IHC staining (×200) and Western blot. Mean±SD.n=15.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖3 各組大鼠肝組織GST-π和AFP蛋白的表達

4 大鼠肝組織Hedgehog信號分子mRNA及蛋白表達水平的變化

與正常對照組比較，模型組Shh、Smo和Gli2表達增高(P<0.05)；與模型組比較，槲芪散治療后，Shh、Smo和Gli2表達進一步增高(P<0.05)，表明槲芪散可能促使肝癌前病變大鼠肝臟Hedgehog信號通路的持續(xù)激活從而參與組織損傷修復，見圖4。

5 大鼠肝組織cyclin D和cyclin E蛋白表達水平的變化

與正常對照組比較，模型組cyclin D和cyclin E表達升高(P<0.05)，提示肝癌前病變大鼠肝臟細胞增生活躍；與模型組比較，槲芪散組cyclin D和cyclinE表達進一步升高(P<0.05)，表明槲芪散可能通過促使肝癌前病變大鼠的肝臟細胞增殖以促進損傷修復，從而抑制肝癌前病變形成，見圖5。

Figure 4.The mRNA (A) and protein (B) expression of Hedgehog signaling molecules in the rat liver tissues. Mean±SD.n=15.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖4 各組肝組織Hedgehog信號通路分子mRNA及蛋白的表達

Figure 5.The protein expression of cyclin D and cyclin E in the rat liver tissues. Mean±SD.n=15.*P<0.05vsmodel group;#P<0.05vsHQS group.

圖5 各組大鼠肝組織cyclin D和cyclin E蛋白的表達

6 大鼠肝前體細胞Gli2蛋白表達水平的變化

與正常對照組比較，模型組出現(xiàn)大鼠肝卵圓細胞標志物OV6與Gli2雙標陽性區(qū)，表明肝癌前病變大鼠肝前體細胞增生活躍；與模型組比較，槲芪散組OV6與Gli2雙標陽性區(qū)顯著增多，表明槲芪散可能通過活化的Hedgehog信號通路促進肝癌前病變大鼠肝前體細胞的增殖以發(fā)揮其保護作用，見圖6。

Figure 6.The co-localization of OV6 and Gli2 proteins in the rat liver tissues (immunofluorescence staining, ×200).

圖6 各組肝組織中OV6和Gli2共定位的熒光顯微鏡觀察

7 大鼠肝組織ALB蛋白表達水平的變化

與正常對照組比較，模型組ALB表達降低(P<0.05)，表明肝癌前病變大鼠成熟肝細胞的不足；與模型組比較，槲芪散組ALB表達明顯增高(P<0.05)，表明槲芪散可促進肝癌前病變的大鼠肝前體細胞向肝細胞的分化，見圖7。

Figure 7.The protein expression of ALB in the rat liver tissues. Mean±SD.n=15.#P<0.05vsmodel group.

圖7 各組肝組織ALB蛋白的表達

8 大鼠肝卵圓細胞系WB-F344中Gli2、cyclin D和cyclin E蛋白表達水平的變化

與WB-F344細胞對照組比較，HQS組的Gli2、cyclin D和cyclin E表達增高(P<0.05)；與cyclopamine組比較，HQS+cyclopamine組的Gli2、cyclin D和cyclin E表達降低(P<0.01)，表明槲芪散可促使大鼠卵圓細胞的Hedgehog信號通路激活，見圖8。

討 論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一。盡管臨床研究已取得了諸多進展，但肝癌的總體療效并不盡如人意，其主要原因與其發(fā)病隱匿、進展快、預后兇險有關。目前，普遍認為肝癌的發(fā)生是一個多因素、多基因共同參與的過程，可分為啟動、促進和演進3個階段[7]，此過程初期可逆但后期不可逆。啟動階段通常由病毒、化學致癌物等引起，雖經歷時間短，但此時肝細胞已出現(xiàn)了GGT及GST-π等很多酶學改變；促進階段時間較長，此時已啟動的肝細胞和肝前體細胞進一步增生，可形成異型增生灶，在致癌因素的持續(xù)作用下，形成癌前期病變細胞；演進階段是指少部分癌前期病變細胞在特定因素作用下繼續(xù)異型增生，使其細胞形態(tài)、超微結構及表面標志物等方面逐漸具有癌細胞的特點，進而演變成肝癌。癌前病變是癌變進展中啟動和促進階段，此時絕大部分細胞可以被“重建”，只有少部分細胞在特定因素作用下進一步癌變最終發(fā)展為癌，因此通常認為癌前病變階段是可逆的，成為阻斷癌變的理想靶點[8]。中藥槲芪散是國家級名老中醫(yī)錢英教授在臨床沿用多年的、用于治療肝纖維化和肝癌前病變的經驗方[4,9],由黃芪、郁金、丹參等8位中藥組成，其以調補肝脾腎、扶正為主；行氣活血、通絡祛邪為輔；并具清熱祛濕、解毒疏肝、利膽化痰的作用。我們課題組前期的動物實驗研究業(yè)已證實槲芪散具有抑制大鼠肝癌前病變形成的作用，其作用機制與槲芪散調控端粒酶活性[10]、抑制c-myc[4]、誘導肝癌細胞凋亡[11]有關。但是槲芪散是否會影響肝前體細胞增殖和分化以及與Hedgehog信號分子的關系并不清楚。

Figure 8.The protein expression of Gli2, cyclin D and cyclin E in the oval cells (WB-F344 cell line). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vscyclopamine group.

圖8 在卵圓細胞中Gli2、cyclin D和cyclin E蛋白的表達

本實驗利用改良的的Solt-Farber二步法[5-6]復制的大鼠肝癌前病變模型中，化學致癌物DEN系誘癌過程的啟動劑，而2-AAF作為促癌劑并通過抑制嚴重肝損傷后的肝細胞分裂增生和促進肝卵圓細胞的增生和活化的機制形成大鼠肝癌前病變。GST-π是肝臟的胚胎性酶，在正常成年大鼠肝臟基本無活性，在癌前病變時，肝細胞的去分化和卵圓細胞的異常分化和增生均可促使GST-π生成增多，成為肝細胞癌前病變的特征和標志，是實驗性肝癌研究中檢測癌前病變、觀察癌變程度的常用指標[11-12]。AFP則常作為未成熟細胞或肝癌細胞的標志。ALT、AST和GGT是評價肝臟功能的常用指標，當肝臟損傷時，其血清水平明顯升高。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，槲芪散可抑制肝癌前病變大鼠血清ALT、AST和GGT的升高，并且明顯減輕模型組大鼠肝臟病理變化，抑制異型增生灶形成，降低肝癌前病變標志物GST-π和AFP的表達，表明槲芪散可明顯抑制肝癌前病變的進展。

已知Hedgehog信號通路具有調控細胞生長、增殖和分化的功能，是胚胎發(fā)育過程中參與調控組織、器官生長、發(fā)育的一條重要的信號通路，與組織損傷修復和再生及惡性腫瘤的發(fā)展及侵襲和轉移密切相關[2, 13]。Hedgehog信號通路主要由Shh、Ihh、Dhh配體、Patched(Ptc)受體、Smo跨膜蛋白、核轉錄因子Gli構成。當Hedgehog信號被激活時，Hedgehog配體與Ptc結合后，解除了Ptc對Smo的抑制，Smo將信號向胞內傳遞，繼而激活核轉錄因子Gli，從而誘導c-myc、cyclin D、cyclin E等調控細胞增殖的下游靶基因的轉錄。已有文獻報道， Hedgehog信號分子在肝癌組織和許多肝癌細胞株高表達，Gli2蛋白表達與肝癌的病理分級及侵襲轉移有明顯的相關性[2, 14]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，肝癌前病變大鼠肝臟Hedgehog信號通路激活，提示Hedgehog信號通路的活化也參與了大鼠肝癌前病變的形成。

最近的研究證實，Hedgehog信號通路亦可調控肝前體細胞的增殖和分化參與肝再生和肝損傷后的修復過程[15-16]，Ochoa等[17]的研究發(fā)現(xiàn)予小鼠70%肝大部切除術后，肝臟的再生修復可通過激活Hedgehog信號通路，促進肝前體細胞的累積和增殖以及肝細胞和膽管上皮細胞的增殖來完成的。而其促使肝前體細胞增殖的機制與Hedgehog信號分子配體Shh抑制細胞凋亡和促進細胞增殖有關。而肝前體細胞與Hedgehog信號通路活性之間的關系同樣也在臨床研究中得到了證實，在原發(fā)性膽汁性肝硬化和酒精性脂肪性肝病患者均發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路的激活，并同時伴有肝前體細胞的增殖和活化[18]。肝卵圓細胞是大鼠的肝前體細胞，來源于赫氏管，屬于肝內膽管系統(tǒng)源性的多潛能分化細胞群，在肝細胞嚴重受損或分裂增生受抑制時卵圓細胞具有向肝細胞和膽管上皮細胞多向分化的潛能[19]，發(fā)揮修復受損肝臟的作用。而當致癌因素存在時，卵圓細胞也可演變?yōu)榘┣捌诓∽兗毎笳呖煞只癁楦渭毎部裳葑優(yōu)楦伟┘毎鸞20-21]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，中藥槲芪散促使肝癌前病變大鼠的肝臟及肝卵圓細胞的Hedgehog信號通路活化及其下游靶分子cyclin D和cyclin E升高，促使卵圓細胞標志物OV6和成熟肝細胞標志物ALB升高，表明中藥槲芪散阻斷大鼠肝癌前病變的機制可能與其促使Hedgehog信號通路進一步活化、促進肝卵圓細胞增殖和向肝細胞分化而促使肝臟修復有關。體外實驗的研究結果證實槲芪散可直接促進Hedgehog信號通路的活化和肝卵圓細胞的增殖。

綜上所述，本研究結果表明中藥復方槲芪散可通過激活Hedgehog信號通路促進卵圓細胞增殖和向肝細胞分化，進而抑制大鼠肝癌前病變的形成。本研究為槲芪散的臨床應用研究提供了實驗依據(jù)，但其活化Hedgehog信號通路的具體機制尚待進一步的研究。

[1] 陳萬青， 鄭榮壽， 張思維， 等. 2012年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]. 中國腫瘤, 2016, 25(1):1-8.

[2] Omenetti A, Diehl AM. The adventures of Sonic hedgehog in development and repair. II. Sonic hedgehog and liver development, inflammation, and cancer[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2008, 294(3):G595-G598.

[3] Mcmillan R, Matsui W. Molecular pathways: the hedgehog signaling pathway in cancer[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(18):4883-4888.

[4] Li X, Shi ZM, Feng P, et al. Effect of Qi-protecting powder (Huqi San) on expression of c-jun, c-fos and c-myc in diethylnitrosamine-mediated hepatocarcinogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2007, 13(31):4192-4198.

[5] Solt D, Farber E. New principle for the analysis of chemical carcinogenesis[J]. Nature, 1976, 263:701-703.

[6] Luo Q, Siconolfi-Baez L, Annamaneni P, et al. Altered protein expression at early-stage rat hepatic neoplasia[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2007, 292(5): G1272-G1282.

[7] Farber E. The multistep nature of cancer development [J]. Cancer Res, 1984, 44(10):4217-4223.

[8] Sangro B, Herraiz M, Prieto J. Gene therapy of neoplastic liver diseases[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2003, 35(2):135-148.

[9] Jiang Y, Wang C, Li YY, et al. Mistletoe alkaloid fractions alleviates carbon tetrachloride-induced liver fibrosis through inhibition of hepatic stellate cell activation via TGF-β/Smad interference[J]. J Ethnopharmacol, 2014, 158(Pt A):230-238.

[10]劉樹紅， 呂 喆， 李 霞， 等. 槲芪散及其君藥槲寄生提取物對人肝癌細胞生長和端粒酶活性的影響[J]. 中藥藥理與臨床, 2007, 230(3):62-65.

[11]董 坤， 豐 平， 江 瑛， 等. 槲寄生堿和多糖對肝癌細胞增生和凋亡的影響[J]. 首都醫(yī)科大學學報, 2009, 30(1):80-84.

[12]Soma Y, Satoh K, Sato K. Purification and subunit-structural and immunological characterization of five glutathioneS-transferases in human liver, and the acidic form as a hepatic tumor marker[J]. Biochim Biophys Acta, 1986, 869(3):247-258.

[13]Ruiz i Altaba A, Snchez P, Dahmane N. Gli and hedgehog in cancer: tumours,embryos and stem cells[J]. Nat Rev Cancer, 2002, 2(5):361-372.

[14]Wang YH, Sui XM, Sui YN, et al. BRD4 induces cell migration and invasion in HCC cells through MMP-2 and MMP-9 activation mediated by the Sonic hedgehog signaling pathway[J]. Oncol Lett, 2015, 10(4):2227-2232.

[15]金 海，劉慧玲，李學俊，等. 大鼠部分肝切除術后Hedgehog信號分子的表達[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(1):90-93.

[16]Choi SS, Omenetti A, Syn WK, et al. The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2011, 43(2):238-244.

[17]Ochoa B, Syn WK, Delgado I, et al. Hedgehog signaling is critical for normal liver regeneration after partial hepatectomy in mice[J]. Hepatology, 2010, 51(5):1712-1723.

[18]Jung Y, Brown KD, Witek RP, et al. Accumulation of hedgehog-responsive progenitors parallels alcoholic liver disease severity in mice and humans[J]. Gastroenterology, 2008, 134(5):1532-1543.

[19]Strick-Marchand H, Morosan S, Charneau P, et al. Bipotential mouse embryonic liver stem cell lines contribute to liver regeneration and differentiate as bile ducts and hepatocytes[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(22):8360-8365.

[20]Aterman E. The stem cell of the liver: a selective review[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 1992, 118(2):87-115.

[21]Sell S, Dunsford HA. Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma[J]. Am J Pathol, 1989, 134(6):1347-1363.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Huqi San inhibits prehepatocarcinoma in rats probably through activating Hedgehog signaling pathway

LI Ruo-fei, BAI Yun-fei, WANG Yun-jiao, DU Zun-shu, HAN Wen-qi, WANG Xue-jiang, JIANG Ying

(CollegeofBasicMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China.E-mail:jiangy@ccmu.edu.cn)

AIM: To explore the influence of Huqi San on the Hedgehog signaling pathway in rats with prehe-patocarcinoma. METHODS: The model of prehepatocarcinoma in the rats was established by a modified solt-farber method. The rats were intragastric administrated with Huqi San solution for 3 d after subtotal hepatectomy. Four weeks after administration of the Huqi San solution, the hepatic damage was observed by histopathological analysis. The protein expression of glutathioneS-transferase-π (GST-π), alpha-fetoprotein (AFP), OV6, albumin (ALB) and glioma-associated oncogene homolog 2 (Gli2) was detected by immunohistochemistry and immunofluorescence staining. The expression of Sonic hedgehog (Shh), Smoothened (Smo), Gli2, cyclin D and cyclin E at mRNA and protein levels in the rats was determined by RT-qPCR and Western blot, respectively. The serum levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and gamma-glutamyltransferase (GGT) were assayed using diagnostic kits. RESULTS: Compared with model group, Huqi San decreased the serum levels of ALT, AST and GGT, and alleviated the pathological changes in prehepatocarcinoma rats. Huqi San inhibited the protein expression of GST-π and AFP (P<0.05) in the prehepatocarcinoma rats. Huqi San also promoted the protein expression of OV6 and ALB (P<0.05). Furthermore, Huqi San activated Hedgehog signaling pathway and its downstream targeting molecules such as Shh, Smo, Gli2, cyclin D and cyclin E. In addition, the resultsinvitroshowed that Huqi San may activate Hedgehog signaling pathway and promoted oval cell proliferation. CONCLUSION: Huqi San not only promotes hepatic progenitor cell proliferation, but also induces hepatic progenitor cell differentiation and inhibits prehepatocarcinoma in the rats probably via activating Hedgehog signaling pathway.

Prehepatocarcinoma; Hedgehog signaling pathway; Hepatic progenitor cells; Huqi San

1000- 4718(2017)04- 0661- 08

2016- 12- 07

2017- 01- 12

北京市自然科學基金資助項目(No. 7102013); 北京市中醫(yī)藥科技一般規(guī)劃項目(No. JJ2013-02)； 北京市教委面上項目(No. KM20160025004)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.014

△通訊作者 Tel: 010-83911687; E-mail: jiangy@ccmu.edu.cn