替米沙坦抑制U937細胞增殖及誘導凋亡*

雷亞梅， 范蕊芳， 許藝川， 賴文興， 林東軍

(中山大學附屬第三醫院血液科，廣東 廣州 510630)

替米沙坦抑制U937細胞增殖及誘導凋亡*

雷亞梅， 范蕊芳， 許藝川， 賴文興， 林東軍△

(中山大學附屬第三醫院血液科，廣東 廣州 510630)

目的： 探討替米沙坦對U937細胞株的生長抑制及凋亡誘導作用。方法: 分別以不同濃度的替米沙坦處理人類急性髓系白血病細胞U937；以CCK-8法檢測不同濃度替米沙坦對U937細胞的生長抑制作用；以集落形成實驗觀察不同濃度替米沙坦對U937細胞集落形成能力的影響；以Annexin V-PI雙染法及Hoechst 33342染色法檢測不同濃度替米沙坦作用前后U937細胞凋亡程度的變化；以流式細胞術檢測U937細胞表面抗原CD11b的陽性表達率，瑞氏染色后倒置顯微鏡進行細胞形態學觀察，了解U937細胞的分化情況；以Western blot法檢測不同濃度替米沙坦作用U937細胞后凋亡相關蛋白表達量的改變。結果: CCK-8實驗結果證實替米沙坦呈時間和劑量依賴性抑制U937細胞的生長；集落形成實驗顯示低劑量替米沙坦可以完全抑制U937細胞的集落形成能力；Annexin V-PI雙染法及Hoechst 33342法結果證實替米沙坦可以誘導U937細胞凋亡；細胞表面抗原流式檢測術及瑞氏染色結果證實替米沙坦可以促進部分U937細胞分化；Western blot實驗結果證實替米沙坦作用于U937細胞72 h后，促凋亡相關蛋白cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白的水平明顯增高。結論: 替米沙坦可以抑制細胞增殖以及誘導U937細胞部分分化，并通過caspase依賴的凋亡途徑觸發U937細胞凋亡。

替米沙坦； U937細胞； 細胞增殖； 細胞凋亡； 細胞分化

白血病作為一類發病機制尚不完全清楚的異質性惡性克隆性疾病，系幼稚白血病細胞大量增生浸潤并影響正常造血功能的造血系統惡性腫瘤，主要表現為貧血、出血、感染等臨床癥狀。近幾年來，各種因素導致白血病發病率顯著升高，雖然隨著化療藥物的不斷改進及分子靶向治療、造血干細胞移植術的逐漸開展，其生存率有所提高, 然而造血干細胞移植術由于配型嚴格、費用較高、并發癥多且風險較大等缺點限制了其廣泛開展, 因而積極探索新的抗癌藥物對白血病的臨床治療及病人生存質量顯得尤為重要。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)屬于核激素受體,是一種核轉錄因子，廣泛參與細胞的炎癥反應、增殖、凋亡、自噬、分化等生命活動進程[1]。PPARγ在多種細胞中都有豐富的表達，同樣在多種人類腫瘤細胞如腸癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞以及白血病細胞等均有豐富的表達。近幾年針對PPARγ及其配體在抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡及分化作用的研究逐漸增多，其抗癌性也越來越得到重視。

替米沙坦作為一種臨床上已廣泛應用的一線新型降壓藥物，具有高效性、長效性、低毒性等特點,廣泛應用于心血管疾病、糖尿病腎病、高血壓腎病的治療。它是一種特異性血管緊張素Ⅱ 1型受體阻斷劑，同時也被證明是一種潛在的選擇性PPARγ部分激動劑，主要通過阻斷腎素-血管緊張系統和激活PPARγ改善糖尿病合并高血壓患者的胰島素抵抗，用于治療高血壓合并糖尿病導致的腎臟、心臟、血管內皮細胞等功能的損害。 國內研究證明替米沙坦通過抑制內質網應激而減少鏈脲佐菌素誘導的糖尿病的發生[2]。近年來，多項研究表明替米沙坦對于很多實體瘤如肺腺癌、腎癌、結腸癌、前列腺癌、子宮內膜癌等腫瘤細胞具有明顯的抗腫瘤效應，該效應主要表現為抑制腫瘤細胞增殖[3-4]、阻滯腫瘤細胞的周期進展[5]、促進腫瘤細胞凋亡[6-7]、誘導細胞自噬等[8]。 最近有文獻報道，替米沙坦能誘導成人T淋巴細胞白血病凋亡和自噬[9]。但目前尚無替米沙坦對人白血病U937細胞影響的相關研究報道。本課題主要研究替米沙坦對白血病U937細胞株的作用，觀察其對U937細胞增殖、分化的影響，并探討替米沙坦誘導U937細胞凋亡的機制，為進一步臨床應用提供新的思路及理論依據。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

替米沙坦、鼠抗人CD11b-PE檢測盒購于Sigma；胎牛血清、RPMI-1640細胞培養液購于HyClone；CCK-8檢測試劑盒購于Dojindo；Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒購于BD；各種 I 抗及 II 抗購于CST；甲基纖維素為R&D產品；其它生化試劑為國產分析純產品或進口分裝產品。

2 主要方法

2.1 細胞培養 U937細胞株來源于中山大學血液病研究所，使用含有15%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養液，于5% CO2、37 °C飽和濕度條件培養箱中培養，取對數生長期的細胞進行實驗，并根據實驗需要分組。

2.2 CCK-8法檢測藥物對U937細胞活力的影響 取對數期生長的U937細胞接種于96孔細胞培養板上，接種密度為每孔1×104個細胞，分別予不同濃度(5、12.5、25、50、75、100、125和150 μmol/L)替米沙坦作用24 h、48 h和72 h，每濃度點設5個復孔，檢測前每孔加10 μL CCK-8溶液，室溫避光孵育3 h，后于酶標儀用450 nm 波長測定吸光度(A)。

2.3 甲基纖維素細胞集落形成實驗 將空白組和藥物處理后的U937細胞培養于甲基纖維素中，置于5% CO2、37 °C飽和濕度條件細胞培養箱中培養7 d，于顯微鏡下觀察U937細胞集落形成情況及計算集落形成率，并隨機拍照。

2.4 Annexin V-PI法檢測細胞凋亡 收集細胞，離心去上清液，預冷PBS潤洗細胞1次(1 000 r/min離心5 min)， 后100 μL 1×binding buffer 重懸細胞，避光環境中依次加入3 μL的Annexin V-FITC和3 μL的PI，微微振蕩，室溫避光條件下孵育15 min后加入200 μL 1×binding buffer，流式細胞儀檢測U937細胞凋亡率。

2.5 細胞凋亡的形態學觀察 收集細胞，離心去上清后PBS潤洗細胞2次。加入Hoechst 33342(10 mg/L)染液500 μL，混勻后置于37 ℃水浴鍋中孵育15 min。然后 PBS洗細胞3次，在熒光顯微鏡下用紫光激發，觀察細胞的細胞核變化，計數凋亡的細胞數，并隨機拍照。

2.6 細胞表面分化抗原 CD11b的檢測 分別予不同濃度(50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L)替米沙坦作用72 h后的U937細胞按試劑說明要求，分別加入鼠抗人CD11b-PE抗體10 μL，4 °C避光孵育30 min后，流式細胞術檢測U937細胞CD11b陽性表達率。

2.7 細胞形態觀察 收集不同處理的細胞，將細胞稀釋至5×106/L，將細胞滴入甩片機內的載玻片小孔中，以1 800 r/min離心6 min，將細胞甩至載玻片上，風干后用Wright’s染料染色，染A液1 min后，加入B液，混勻，染色5～8 min，在油鏡(IX41，Olympus)下觀察形態變化。

2.8 Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白 收集細胞后加入含有1 μL PSMF 的RIPA 裂解液100 μL，冰上裂解細胞30 min，4 ℃預冷離心機12 000 r/min 離心15 min，提取上清液即為細胞總蛋白，后BCA法檢測蛋白濃度。予12%的SDS-PAGE 凝膠電泳分離上述蛋白，并將其轉至PVDF膜上，TBST洗滌1次，麗春紅染色后切割目的條帶，后置于5%牛血清白蛋白封閉液中封閉1 h，加入抗體孵育4 °C過夜，TBST洗滌3次后加Ⅱ抗室溫孵育1 h。ECL(Thermo)顯影，凝膠成像系統(Bio-Rad)分析結果。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較分析用t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 替米沙坦對U937細胞增殖的影響

CCK-8實驗結果顯示，經5 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L、125 μmol/L 和150 μmol/L 終濃度的替米沙坦對U937細胞處理24 h后的細胞活力抑制率分別為(9.08±0.12)%、(14.01±0.13)%、(19.78±0.32)%、(24.06±0.13)%、(32.04±0.26)%、(44.76±0.24)%、(55.34±0.16)%和(60.27±0.38)%，IC50為109.16 μmol/L。替米沙坦對U937細胞活力的抑制作用呈濃度和時間依賴性。隨著替米沙坦終濃度的升高和作用時間的延長，對細胞生長的抑制能力增強。

甲基纖維素集落形成實驗結果顯示，經過7 d培養，未加藥組可見集落形成率為90.00%±4.52%，經5 μmol/L和12.5 μmol/L 處理過的細胞集落形成率分別為68.00%±3.20%和32.00%±3.75%，經25 μmol/L 處理后的細胞未見集落形成，表明低劑量的替米沙坦已經完全抑制了U937的集落形成能力(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.Telmisartan inhibited the proliferation of U937 cells. A: telmisartan inhibited the viability of U937 cells determined by CCK-8 assay; B: the U937 cells treated with telmisartan at various concentrations were incubated in methylcellulose culture for 7 d, and the colony formation capacity was completely suppressed. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1 替米沙坦抑制U937細胞的增殖

2 替米沙坦誘導U937細胞凋亡

Annexin V-PI染色流式細胞術分析結果顯示，與實驗組相比，50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 替米沙坦作用于U937細胞24 h的凋亡率分別為(7.08±0.18)%、(11.01±0.32)%和(21.98±0.33)%，48 h的凋亡率分別為(11.32±0.24)%、(19.80±1.00)%和(28.98±0.14)%，72 h的凋亡分別為(12.08±0.62)%、(26.54±0.56)%和(52.10±1.60)%。這表明替米沙坦對U937細胞凋亡誘導作用明顯，并且U937細胞凋亡率隨著替米沙坦濃度的增加和作用時間的延長而逐漸增加。Hoechst 33342法染色結果表明，50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 替米沙坦處理了72 h的U937細胞可以在顯微鏡下觀察到部分細胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染，凋亡率分別為(15.00±0.16)%、(35.00±1.21)%和(58.00±0.32)%，從形態學上驗證替米沙坦可以誘導U937細胞凋亡，見圖2。

3 替米沙坦對U937細胞分化的影響

用流式細胞術檢測替米沙坦誘導U937細胞72 h后CD11b的表達水平，結果表明0 mmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 替米沙坦作用后的CD11b表達率分別為0.313%±0.213%、12.90%±0.27%、16.10%±0.34%和30.80%±0.45%。Wright’s法染色后，于油鏡下觀察替米沙坦誘導72 h后U937細胞形態學變化，細胞形態圖像顯示部分U937細胞具有分化的細胞學形態，表現為核質比例升高、核仁減少或消失、核質疏松和和分葉增多，見圖3。

4 替米沙坦對cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白表達量的影響

Western blot 實驗結果顯示，U937細胞經過終濃度分別為50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 的替米沙坦處理72 h后，與對照組相比，caspase-3逐漸被活化，出現17 kD與19 kD活化片段，PARP 被活化的caspase-3裂解出現89 kD的剪切片段, caspase-3活化及PARP裂解的強度隨藥物濃度的增加而增強，表明替米沙坦通過caspase途徑誘導U937細胞凋亡，見圖4。

討 論

PPAR屬于核激素受體超家族的成員，是一種核轉錄因子[10]，共有 α、β和γ 3 個亞型，在多種細胞中均有豐富的表達，與細胞生長、增殖、分化、纖維化、脂類代謝、炎癥反應及免疫反應等密切相關[11]。PPARγ在多種人類腫瘤細胞如腸癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌以及白血病細胞等均有豐富的表達，隨著針對PPARγ及其配體在抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡作用的研究增多[12-14]，其抗癌性也越來越得到重視。多項研究證明PPARγ及其配體在多種腫瘤中發揮抗癌作用，如結腸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肝癌、白血病等[15-16]。最新研究表明，替米沙坦作為一種潛在的選擇性PPARγ部分激動劑，激活受體的效應可以達到完全激動劑匹格列酮和羅格列酮最高水平的25%～30%[17]。Li等[18]研究證明，替米沙坦可以通過上調PPARγ抑制肺腺癌A594細胞增殖。Pu等[19]證明替米沙坦通過上調PPARγ能誘導人卵巢癌細胞凋亡。

細胞凋亡受阻在腫瘤的發生、發展中起著重要作用。目前認為細胞外的凋亡誘導途徑分為caspase依賴和非caspase依賴的凋亡途徑[20]。Caspase是具有ICE/CED-3結構特征的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，在細胞凋亡過程中起關鍵作用。作為目前發現的caspase成員中與CED-3同源性最高者，caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末執行因子，它的激活可使細胞發生不可逆的凋亡[21]。Caspase-3與細胞膜空泡形成、核膜破裂、染色質聚集和邊聚及DNA斷裂等以及一些生化改變關系密切，在細胞凋亡啟動時，作用底物PARP被活化的caspase-3剪切，激活DNA內切酶，誘導細胞凋亡[22]。國外研究證明替米沙坦可以通過上調PPARγ顯著抑制腎癌細胞的生長并通過活化caspase-3誘導細胞凋亡[23]。本研究發現替米沙坦可以明顯抑制U937細胞增殖，并能誘導其凋亡，這種作用呈時間和劑量依賴性。Western blot結果顯示cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白水平隨著替米沙坦作用濃度的增加逐漸增加，推測替米沙坦活化凋亡蛋白酶caspase-3，活化的caspase-3進一步剪切PARP，通過caspase依賴的凋亡途徑誘導U937細胞凋亡，這是替米沙坦抗腫瘤可能機制之一。細胞分化障礙與惡性腫瘤的發生關系密切，研究證明許多藥物可以促進白血病細胞分化[24]。本課題通過對替米沙坦作用后U937細胞CD11b陽性表達率的測定及細胞形態學觀察，顯示替米沙坦一定程度上可以促進U937細胞分化。研究證明替米沙坦可以促進血管內皮祖細胞分化[25]，但目前國內外尚無替米沙坦對腫瘤細胞分化作用的研究報道。

本實驗初步證實替米沙坦可以抑制U937細胞增殖，促進其分化并誘導其凋亡，主要是通過活化caspase途徑來實現的。PPARγ在惡性血液腫瘤細胞中廣泛表達，PPARγ配體可以有效誘導白血病細胞凋亡和促進分化[26]。因此，替米沙坦對U937的增殖抑制作用可能與PPARγ的部分激活有關，但其具體機制需要進一步研究證明。

Figure 2.Telmisartan induced apoptosis in the U937 cells. A: the U937 cells treated with telmisartan were stained with Annexin V-PI and subjected to flow cytometry analysis; B: the U937 treated with different concentrations of telmisartan for 72 h were stained with Hoechst 33342 and observed under a fluorescence microscope (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2 替米沙坦誘導U937細胞凋亡

Figure 3.Telmisartan induced differentiation in the U937 cells. A: the U937 treated with different concentrations of telmisartan for 72 h were subjected to flow cytometry analysis to determine the expression of CD11b; B: the images of Wright’s staining of the cells were observed under microscope (×1 000). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖3 替米沙坦誘導U937細胞分化

Figure 4.The effect of telmisartan on the protein levels of the apoptosis-related proteins in the U937 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖4 替米沙坦對U937細胞內凋亡相關蛋白表達的影響

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Telmisartan inhibits proliferation and induces apoptosis in U937 cells

LEI Ya-mei, FAN Rui-fang, XU Yi-chuan, LAI Wen-xing, LIN Dong-jun

(DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:lindongjun0168@163.com)

AIM: To demonstrate the effects of telmisartan on the proliferation and apoptosis of U937 cells. METHODS: The proliferation ability of the U937 cells was assessed by CCK-8 assay and colony formation test with methylcellulose. The CD11b expression rate of the U937 cells was identified by flow cytometry. The apoptotic rate was analyzed by flow cytometry with Annexin V-PI double staining and Hoechst 33342 staining. The protein levels of cleaved PARP and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. RESULTS: The results of CCK-8 assay confirmed that the viability of U937 cells was inhibited by telmisartan. The colony formation capacity of U937 cells was also significantly inhibited by telmisartan. The differentiation of U937 cells was induced by telmisartan with the expression of CD11b. The results of flow cytometry analysis with Annexin V-PI double staining and Hoechst 33342 staining identified that the apoptosis of U937 cells was induced by telmisartan in dose-dependent and time-dependent manners with the up-regulation of cleaved PARP and cleaved caspase-3 proteins. CONCLUSION: Telmisartan inhibits the proliferation and induces the differentiation of U937 cells. Telmisartan also induces the apoptosis of U937 cells through the caspase pathway.

Telmisartan; U937 cells; Cell proliferation; Apoptosis; Cell differentiation

1000- 4718(2017)04- 0669- 07

2016- 11- 17

2017- 03- 03

廣東省科技計劃項目(No. 2013B021800079)

R965； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.015

△通訊作者 Tel: 020-85252777; E-mail: lindongjun0168@163.com