地高辛對人胃癌SGC7901細胞生長和凋亡的影響*

陳紅蓮， 劉 輝， 袁 磊， 王建國

(漯河醫學高等專科學校醫學生物工程重點實驗室， 河南 漯河 462002)

地高辛對人胃癌SGC7901細胞生長和凋亡的影響*

陳紅蓮， 劉 輝， 袁 磊， 王建國△

(漯河醫學高等專科學校醫學生物工程重點實驗室， 河南 漯河 462002)

目的： 探究地高辛對人胃癌SGC7901細胞生長和凋亡的影響，并探討其分子機制。方法: 選取人胃癌細胞SGC7901作為研究對象，采用CCK-8法檢測地高辛的細胞毒作用并測定IC50，采用流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期，采用Western blot法檢測c-Src、p-c-Src(Tyr416)、Akt、p-Akt(Ser473)、ERK1/2和p-ERK1/2(Tyr204)的蛋白水平，采用RT-PCR法檢測c-Src的mRNA表達水平。結果: 隨著地高辛濃度逐漸升高，自50 nmol/L開始，SGC7901細胞的存活率逐漸降低(P<0.05)，當地高辛濃度達到500 nmol/L時SGC7901細胞的存活率降至最低(P<0.05)，地高辛作用24 h的IC50為191.45 nmol/L；200 nmol/L地高辛作用SGC7901細胞24 h后，與對照組相比，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)， G0/G1期細胞比例明顯升高(P<0.05)，c-Src、ERK1/2和Akt蛋白的磷酸化水平顯著下降(P<0.05)，c-Src的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)，細胞遷移率降低(P<0.05)。結論: 地高辛可在體外誘導人胃癌細胞SGC7901的凋亡和G0/G1期阻滯，這可能與其下調c-Src基因表達以及抑制ERK1/2和Akt蛋白磷酸化有關。

地高辛； 細胞凋亡； 細胞周期； c-Src； SGC7901細胞

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一。全世界每年新增胃癌患者約95.2萬例，其中近一半發生在我國[1]。胃癌死亡率位居惡性腫瘤第3位，每年約72.3萬人死于胃癌[1]。目前手術切除仍是治療胃癌的主要手段，盡管在圍手術期進行放化療有助于提高治療效果，但仍有50%以上的患者會出現復發和轉移[2]，5年總生存率不足20%[3]。因此，尋找抑瘤效果好、毒副作用少的藥物，對于延長胃癌患者的生存期具有重要意義。地高辛是一種從毛花洋地黃中提純制得的強心苷，可選擇性抑制心肌細胞膜Na+/K+-ATP酶活性，通常用于治療充血性心力衰竭和某些室上性心律失常。近年來多項研究表明，地高辛對多種惡性腫瘤如肺癌[4]、肝癌[5]、乳腺癌[6]和卵巢癌[7]等具有顯著的抑制作用。原癌基因c-Src在多種腫瘤中如肝癌、胰腺癌、胃癌、口腔癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌等[8]呈高表達，活化的c-Src可通過激活磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，即Akt)通路、絲裂原激活蛋白激酶的激酶[mitogen-activated protein kinase (MAPK) kinase，MEK]/細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路和黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)/樁蛋白(paxillin)、p130CAS通路等途徑抑制腫瘤細胞凋亡，促進增殖、遷移和侵襲[9]。目前關于地高辛對胃癌的抑制作用及其分子機制尚不明確。在本研究中，我們以人胃癌SGC7901細胞為研究對象，在體外觀察地高辛對SGC7901細胞增殖和凋亡的影響，并初步探究其分子生物學機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌SGC7901細胞購于上海中科院細胞庫；RPMI-1640培養基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自HyClone；Transwell小室購自Corning；地高辛購自Sigma；TRIzol試劑、RIPA裂解液、CCK-8試劑盒、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；反轉錄PCR試劑盒和PCR引物購自大連寶生物公司；兔抗人c-Src、p-c-Src(Tyr416)、Akt、p-Akt(Ser473)、ERK1/2、p-ERK1/2(Tyr204)、β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體購自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1 細胞培養 人胃癌SGC7901細胞在含10% FBS的RPM1-1640培養液中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中常規培養。當細胞融合度達到80%時，以0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

2.2 藥物處理 將地高辛溶于DMSO配制成500 μmol/L的儲備液，分裝后于-20 ℃保存。實驗時用細胞培養液分別稀釋成10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和500 nmol/L的工作液，DMSO終濃度為0.1%，對照組細胞使用含有0.1% DMSO的細胞培養液。

2.3 CCK-8法檢測細胞活力 取對數生長期的SGC7901細胞，制成密度為1×108/L的細胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h。吸去原培養液，各孔分別加入200 μL含有不同濃度地高辛的工作液，每組設5個復孔，同時設調零孔和對照孔，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h。每孔加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃培養1 h，用酶標儀檢測各孔450 nm波長吸光度A值。細胞存活率=(加藥孔A值/對照孔A值)×100%。采用SPSS 16.0軟件Probit回歸模型計算地高辛對SGC7901細胞的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.4 流式細胞術檢測細胞周期 取對數生長期的SGC7901細胞，制成密度為1×109/L的細胞懸液，以每孔2 mL接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h。吸去原培養液，加入2 mL含有200 nmol/L 地高辛的工作液，同時設對照組，每組設3個復孔，繼續培養24 h。收集各孔細胞，用冷PBS洗滌細胞2次，加入1 mL 70%冰乙醇于4 ℃固定24 h。1 000 r/min離心5 min，棄上清，再用冷PBS洗滌細胞2次，加入PI染色液，4 ℃避光染色30 min，用流式細胞儀(BriCyte E6, 購自中國邁瑞公司)檢測。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞處理方法同上。收集各孔細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，用預冷的結合緩沖液重懸細胞，加入Annexin V-FITC輕輕混勻后于室溫避光孵育15 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸細胞于預冷的結合緩沖液中，加入PI染色液輕輕混勻后于4 ℃避光保存，用流式細胞儀檢測。

2.6 RT-PCR檢測c-Src的mRNA表達 參照TRIzol說明書抽提上述各組細胞總RNA，取2 μg總RNA進行反轉錄，反轉錄條件為42 ℃ 60 min、70 ℃ 15 min，所得反轉錄反應液于-20 ℃凍存備用。取2 μL上述反轉錄反應液進行PCR，PCR反應條件為94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環。引物采用Primer Premier 5.0軟件設計，經PubMed BLAST驗證。c-Src(278 bp)的上游引物為5′-CTACTCCAAACACGCCGATG-3′，下游引物為5′-GCTTCTCATGCCTCAGCTTC-3′；GAPDH(276 bp)的上游引物為5′-CCTGACCTGCCGTCTAGAAA-3′，下游引物為5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTG-3′。PCR結果采用瓊脂糖凝膠電泳成像，使用ImageJ 1.45S軟件進行條帶灰度值分析。

2.7 Transwell遷移實驗 將Transwell小室置于24孔板中，取濃度為2.5×108/L的各組細胞懸液200 μL加入上室內，在24孔板中加入600 μL含10% FBS的RPMI-1640培養基，培養24 h后取出小室，用棉簽擦去上室內的細胞，PBS 洗滌2次，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS 洗滌2次。顯微鏡下隨機挑選6個視野拍照計數，取其平均值。實驗重復3次。遷移率(migration rate)=藥物組遷移細胞數/對照組遷移細胞數×100%。

2.8 Western blot檢測蛋白水平 用RIPA裂解各組細胞提取總蛋白，用BCA法定量后，取25 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜，用封閉液(5% BSA/TBST)封閉1 h，加入抗c-Src、p-c-Src(Tyr416)、Akt、p-Akt(Ser473)、ERK1/2、p-ERK1/2(Tyr204)和β-actin的I抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入 II 抗(1∶1 000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進行發光反應，暗室X膠片顯影，拍照，使用ImageJ 1.45S軟件進行灰度分析。

3 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05為差別有統計學意義。

結 果

1 地高辛對SGC7901細胞活力的影響

CCK-8法檢測細胞活力的結果顯示，自50 nmol/L開始，隨著地高辛濃度逐漸升高，SGC7901細胞存活率逐漸降低(P<0.05)，當地高辛濃度達到500 nmol/L時SGC7901細胞存活率降至最低(P<0.05)，這表明地高辛可明顯減少SGC7901細胞的存活率，且呈劑量依賴性。地高辛作用24 h的IC50為191.45 nmol/L,見圖1。

2 地高辛對SGC7901細胞周期的影響

流式細胞術檢測結果顯示，經200 nmol/L地高辛作用24 h的SGC7901細胞G0/G1期細胞的比例達到81.63%±3.33%，顯著高于對照組(P<0.05)，S期和G2/M期細胞比例顯著降低(P<0.05),見圖2。這表明地高辛可誘導SGC7901細胞發生G0/G1期阻滯。

Figure 1.The effect of digoxin on the viability of SGC7901 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 nmol/L.

圖1 地高辛對SGC7901細胞活性的影響

Figure 2.The effect of digoxin on the cell cycle of SGC7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 地高辛對SGC7901細胞周期的影響

3 地高辛對SGC7901細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，經200 nmol/L地高辛作用24 h的SGC7901細胞凋亡率高達36.33%±4.11%，顯著高于對照組(P<0.05)，見圖3。這表明地高辛可誘導SGC7901細胞發生凋亡。

4 地高辛對c-Src和p-c-Src蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示，經200 nmol/L地高辛作用24 h后，SGC7901細胞中c-Src蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，同時磷酸化c-Src的蛋白水平也顯著降低(P<0.05),見圖4。這表明地高辛既可下調c-Src蛋白表達還可抑制其磷酸化。

Figure 3.The effect of digoxin on the apoptosis of SGC7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 地高辛對SGC7901細胞凋亡的影響

Figure 4.The effect of digoxin on the protein levels of p-c-Src and c-Src in SGC7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 地高辛對SGC7901細胞p-c-Src和c-Src蛋白水平的影響

5 地高辛對c-Src mRNA表達的影響

RT-PCR實驗結果顯示，與對照組相比，經200 nmol/L地高辛作用24 h后，SGC7901細胞中c-Src的mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)，見圖5。這表明地高辛可抑制SGC7901細胞c-Src的mRNA表達水平。

Figure 5.Effect of digoxin on the mRNA level of c-Src in SGC7901 cells. GAPDH: 276 bp; c-Src: 278 bp. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 地高辛對SGC7901細胞中c-Src mRNA水平的影響

6 地高辛對SGC7901細胞遷移的影響

Transwell遷移實驗結果顯示，與對照組相比，地高辛(200 nmol/L)組SGC7901細胞遷移率明顯降低(P<0.05)，見圖6。這表明地高辛可抑制SGC7901細胞遷移。

Figure 6.The effect of digoxin on the migration of SGC7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6 地高辛對SGC7901細胞遷移的影響

7 地高辛對ERK1/2和Akt蛋白磷酸化的影響

Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，地高辛(200 nmol/L)組SGC7901細胞中的ERK1/2和Akt蛋白磷酸化水平均顯著下降(P<0.05)，見圖7。這表明地高辛可抑制SGC7901細胞ERK1/2和Akt蛋白的磷酸化。

Figure 7.The effect of digoxin on the phosphorylation of ERK1/2 and Akt in SGC7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖7 地高辛對SGC7901細胞中ERK1/2和Akt蛋白磷酸化的影響

討 論

強心苷是一類選擇性作用于心臟，加強心肌收縮力的藥物，廣泛分布于各種植物中，地高辛是其中最具代表性的一種。近年來地高辛的抗腫瘤作用受到越來越多的關注。在體外，地高辛可抑制非小細胞肺癌、卵巢癌和胰腺癌細胞增殖[4, 7, 10]，促進肝癌和視網膜母細胞瘤細胞凋亡[5, 11]，抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲[6]。動物實驗也證實，地高辛可抑制SCID小鼠體內乳腺癌原位移植瘤的生長和肺轉移[12]。在本研究中我們發現，隨著地高辛濃度的逐漸升高，從50 nmol/L開始人胃癌SGC7901細胞活力不斷降低，這表明地高辛對人胃癌SGC7901細胞可產生細胞毒作用，且具有劑量依賴性。采用流式細胞術進一步分析發現，地高辛可誘導人胃癌SGC7901細胞發生凋亡并阻滯細胞于G0/G1期。

Lin等[4]研究發現，地高辛可通過抑制c-Src活化抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。c-Src是由原癌基因c-Src編碼，分子量約為60 kD，具有酪氨酸激酶活性的癌蛋白。c-Src羧基端Tyr530磷酸化可使c-Src各結構域之間的結合趨于緊密，導致c-Src失活；而Tyr530去磷酸化會促使c-Src的Tyr416發生自磷酸化，進而使c-Src完全活化[8]。有研究證實，抑制c-Src激酶活性可促進胃癌細胞凋亡[13]，而激活c-Src則可促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[14-15]。在本研究結果表明，地高辛可顯著抑制胃癌SGC7901細胞中c-Src蛋白磷酸化，并同時下調了c-Src蛋白的表達水平，從而減弱胃癌SGC7901細胞的遷移能力。為進一步探究地高辛對c-Src蛋白表達的調控機制，我們采用RT-PCR法檢測了地高辛對c-Src mRNA水平的影響，結果顯示，地高辛可抑制c-Src的mRNA表達。這表明地高辛可抑制SGC7901細胞中c-Src基因表達，然而其分子機制仍需進一步探究。

MEK/ERK和PI3K/Akt信號通路在調控胃癌細胞凋亡和增殖中發揮著關鍵作用。Sogabe等[15]研究證實，MEK抑制劑在體外可誘導胃癌細胞凋亡，在體內可抑制胃癌移植瘤的生長。Lin等[16]研究發現，Ras/Raf/MEK/ERK信號通路失活會使胃癌細胞內P53和P21的蛋白表達水平上調，導致細胞凋亡和細胞周期阻滯。此外，多項研究也表明，抑制PI3K/Akt信號通路也同樣能夠抑制胃癌細胞增殖和促進細胞凋亡[17-19]。在本研究中，我們發現地高辛可同時顯著抑制胃癌SGC7901細胞中ERK1/2和Akt蛋白的磷酸化。綜合以上研究，我們推測地高辛可能通過抑制ERK1/2和Akt信號通路誘導胃癌SGC7901細胞發生凋亡和G0/G1期阻滯。

ERK1/2和Akt作為c-Src的下游信號分子已被多項研究證實。c-Src可通過激活PI3K/Akt、MEK/ERK和FAK/paxillin、p130CAS等下游信號通路調控腫瘤細胞的存活、增殖、遷移和侵襲等生物學行為[9]。Ke等[20]研究發現，c-Src可通過激活PI3K/Akt信號通路誘導鼻咽癌細胞發生上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)促進細胞侵襲。c-Src也可通過激活ERK1/2信號通路降低非小細胞肺癌對吉非替尼的敏感性[21]。Okamoto等[22]研究證實，在胃癌細胞中抑制c-Src激酶活性可同時抑制ERK1/2和Akt蛋白磷酸化，進而誘導細胞凋亡和G1期阻滯。但地高辛是否通過下調c-Src的表達以抑制胃癌SGC7901細胞中ERK1/2和Akt蛋白磷酸化還有待進一步探究。

綜上所述，本研究結果表明，地高辛可在體外誘導人胃癌SGC7901細胞凋亡和G0/G1期阻滯，這可能與其下調c-Src基因表達以及抑制ERK1/2和Akt蛋白磷酸化有關。然而地高辛在體內對胃癌是否仍然具有顯著的抑制作用尚待進一步闡明，因此，本課題組將通過動物實驗繼續深入探究地高辛在活體內對肺癌抑制作用的有效性與安全性。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of digoxin on apoptosis and growth in human gastric carcinoma SGC7901 cells

CHEN Hong-lian, LIU Hui, YUAN Lei, WANG Jian-guo

(KeyLaboratoryofMedicalBioengineering,LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China.E-mail:lhyzchenhl@sina.com)

AIM: To investigate the effect of digoxin on apoptosis and growth in human gastric carcinoma SGC7901 cells and its possible mechanism. METHODS: SGC7901 cells were incubated in the medium containing digoxin at different concentrations for 24 h. CCK-8 assay was employed to detect the anti-tumor effect of digoxin on SGC7901 cells, and IC50value of digoxin was calculated. Flow cytometry was used to determine the apoptosis and the cell cycle. Western blot was used to analyze the protein levels of c-Src, p-c-Src(Tyr416), Akt, p-Akt(Ser473), ERK1/2 and p-ERK1/2 (Tyr204). The mRNA expression of c-Src was by RT-PCR. RESULTS: As the concentration of digoxin increased, the cell viability was reduced gradually starting at 50 nmol/L digoxin treatment (P<0.05). The cell viability was reduced to the lowest extent by exposure to 500 nmol/L digoxin (P<0.05). The IC50value of digoxin was 191.45 nmol/L for 24 h. After treatment with 200 nmol/L digoxin for 24 h, the apoptotic rate and the proportion of G0/G1phase were significantly increased (P<0.05), the phosphorylated levels of c-Src, ERK1/2 and Akt declined (P<0.05), the mRNA and protein levels of c-Src were down-regulated (P<0.05) and the ability of migration was weaker (P<0.05) than that in control group.CONCLUSION: Digoxin may suppress the growth and induce the apoptosis of human gastric carcinoma SGC7901 cells by inhibiting the expression of c-Srcgene and down-regulating the phosphorylated levels of ERK1/2 and Akt.

Digoxin; Apoptosis; Cell cycle; c-Src; SGC7901 cells

1000- 4718(2017)04- 0676- 06

2016- 10- 12

2016- 12- 15

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(No. 142300410061)

R730.23; R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.016

△通訊作者 Tel： 0395-2939990； E-mail： wr0395@sina.com