LMP1經TRADD促進鼻咽癌SP18細胞增殖*

肖 娟， 張先鋒， 劉重元， 羅招陽， 朱建思， 張 玲， 張志偉△

(南華大學 1附屬第二醫院耳鼻喉科， 2醫學院腫瘤研究所，腫瘤細胞與分子病理學湖南省重點實驗室， 3醫學院臨床醫學卓越醫師班，湖南 衡陽 421001)

LMP1經TRADD促進鼻咽癌SP18細胞增殖*

肖 娟1， 張先鋒1， 劉重元2， 羅招陽2， 朱建思2， 張 玲3， 張志偉2△

(南華大學1附屬第二醫院耳鼻喉科，2醫學院腫瘤研究所，腫瘤細胞與分子病理學湖南省重點實驗室，3醫學院臨床醫學卓越醫師班，湖南 衡陽 421001)

目的： 探討潛伏性膜蛋白1(LMP1)羧基末端活化區2(CTAR2)的腫瘤壞死因子受體相關死亡結構域(TRADD)在鼻咽癌SP18細胞增殖中的作用及機制。方法: 首先建立表達LMP1及CTAR2突變型LMP1(LMP1TRADD)的SP18細胞系。其次采用細胞生長曲線、平皿集落形成實驗、軟瓊脂集落實驗和流式細胞術觀察LMP1TRADD對SP18細胞增殖的影響。然后選用基因芯片檢測SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD細胞間的差異表達基因。結果: 細胞生長曲線、軟瓊脂集落和平皿集落形成實驗結果均顯示，SP18-LMP1細胞生長與集落形成能力均較SP18-LMP1TRADD細胞強(P<0.01)。流式細胞術檢測結果顯示，SP18-LMP1細胞的增殖指數較SP18-LMP1TRADD細胞高(P<0.01)。篩選出63個增殖相關基因，其中SP18-LMP1TRADD細胞中上調的基因33個，下調的基因30個。結論: TRADD活性區是LMP1促進SP18細胞增殖的重要功能活性位點。LMP1可能通過TRADD提高細胞增殖指數，誘導SP18細胞增殖。

鼻咽癌； 潛伏性膜蛋白1； 腫瘤壞死因子受體相關死亡結構域； 基因芯片； 細胞增殖

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是東南亞及我國南方(廣東、湖南、廣西和香港等)地區最常見的惡性腫瘤之一[1]。曾益新等[2]報道建立了鼻咽癌干細胞樣SP細胞系，具有極強的生存能力，被認為是鼻咽癌發生和復發的主要原因之一[3]。潛伏性膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)被認為是EB病毒重要的致瘤蛋白[4-5]。LMP1胞漿區包括3個羧基末端活化區(carboxy-terminal activating region，CTAR)，分別為CTAR1、CTAR2和CTAR3[6-8]，其中CTAR2包含腫瘤壞死因子受體相關死亡結構域(tumour necrosis factor receptor-associated death domain，TRADD)，是羧基末端重要的活性轉化位點[9]。然而，LMP1在鼻咽癌發生與發展中的作用及機制仍不十分清楚，本研究旨在探討LMP1在鼻咽癌SP細胞增殖中的作用及機制，為進一步闡明EB病毒在鼻咽癌發病中的作用提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

鼻咽癌SP18細胞由中山大學腫瘤研究所惠贈，用含5%小牛血清(購自杭州四季青公司)的RPMI-1640(Gibco)培養。pLNSX-LMP1和pLNSX-LMP1TRADD[6-9]逆轉錄病毒質粒由中南大學腫瘤研究所惠贈。

2 方法

2.1 表達LMP1和LMP1TRADD細胞的建立 接種合適濃度SP18細胞種于6孔板培養，用收集的RV-LMP1和RV-LMP1TRADD逆轉錄病毒與8 mg/L聚凝胺37 ℃孵育(感染)SP18細胞2次(每次作用3～4 h，每次間隔8～12 h)，800 mg/L G418篩選2～3周，匯合克隆擴大培養，建成穩定傳代的轉染細胞系(SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD)，然后，采用免疫熒光檢測SP18細胞中LMP1和LMP1TRADD蛋白的表達。

2.2 免疫熒光觀察 取SP18-LMP1細胞和SP18-LMP1TRADD細胞，制備細胞爬片，用甲醇與丙酮(1∶1)固定、洗片、干燥后，用抗 LMP1的 I 抗(1∶500)標記1 h(37 ℃)，洗片后用FITC標記的羊抗鼠 II 抗標計1 h(37 ℃)，洗滌后甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 繪制生長曲線 取對數生長期SP18-LMP1細胞和SP18-LMP1TRADD細胞(2×103)接種于24孔板，每組實驗設3個平行孔，每天計數細胞數，每次重復3次，取平均值代表細胞數，總共檢測6 d，將細胞數繪制在坐標紙上，即得出細胞的生長曲線。

2.4 平板集落形成實驗 取對數生長期的SP18-LMP1細胞和SP18-LMP1TRADD細胞，制成細胞懸液，按每孔300個細胞接種于24孔板中，靜置培養2周。取出培養皿，用PBS漂洗2次，甲醇固定15 min后，0.4%結晶紫染色，肉眼直接計數集落數，或在顯微鏡下計數大于50個細胞的集落。然后，按公式計算集落形成率：集落形成率(%)=集落數/接種細胞數×100%。

2.5 軟瓊脂集落實驗 用RPMI-1640培養基、0.6%瓊脂糖配制底層瓊脂，取1.5 mL均勻鋪于6孔板內，4 ℃放置10 min，另外用細胞(每孔2×103個細胞)、RPMI-1640培養基、0.3%瓊脂糖配制頂層瓊脂，將頂層瓊脂鋪于底層瓊脂上，37 ℃、5% CO2溫箱內連續培養2周后，計數集落數。實驗分SP18-LMP1細胞和SP18-LMP1TRADD細胞2組，每組3個平行孔，集落形成率計數：于倒置顯微鏡下觀察集落(≥50個細胞為1個集落)的數目和大小，計算出細胞集落形成率：集落形成率(%)=集落數/接種細胞數×100%。

2.6 流式細胞術檢測細胞周期 取對數生長期SP18-LMP1細胞和SP18-LMP1TRADD細胞，長至80%融合時，分別收集細胞，制成單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，用4 ℃ PBS溶液重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，重復1次；將收集的細胞用4 ℃ 75%乙醇固定細胞，置冰盒中送檢。樣本上機前作如下處理： 將乙醇固定的細胞離心洗滌，去上清，搖勻； 加RNA酶50 μL(濃度為0.5 g/L)，37 ℃水浴30 min； 加碘化丙啶50 μL，濃度為1 g/L，振蕩混勻，避光置冰箱30 min； 300目尼龍網濾過，上機檢測，計數10 000個細胞，進行細胞周期檢測。然后計算細胞的增殖指數(proliferation index, PI)，PI (%)=(S+G2)/(G1+S+G2)×100%。

2.7 基因芯片檢測 取對數生長期的SP18-LMP1細胞和SP18-LMP1TRADD細胞，長至80%融合時，PBS漂洗2次，加入1 mL的TRIzol于培養瓶中(1×109/L個細胞)，反復吹打，混勻后收集，送上海伯豪生物技術有限公司進行基因芯片檢測，比較 SP18-LMP1細胞和SP18-LMP1TRADD細胞的差異表達基因。采用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強度，將實驗結果轉換成數字型數據保存，并對原始數據進行分析，列出倍數≥ 2(上調基因)或 ≤ 0.5(下調基因)的差異表達基因。

3 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件處理所有的數據，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，細胞克隆和集落數及細胞增殖指數采用秩和檢驗，細胞周期采用2檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 建立表達LMP1和LMP1TRADD的SP18細胞系

逆轉錄病毒感染SP18細胞后，G418篩選匯合克隆，免疫熒光檢測LMP1的表達，結果顯示LMP1和LMP1TRADD在SP18細胞漿和胞膜表達，建立了穩定表達LMP1及LMP1TRADD的SP18細胞系，即SP18-LMP1細胞和SP18-LMP1TRADD細胞，用于后續實驗(圖1)。

Figure 1.The expression of LMP1TRADDin the SP18 cells detected by the method of immunofluorescence (×400).

圖1 免疫熒光觀察LMP1TRADD在SP18細胞中的表達

2 LMP1TRADD對SP18細胞生長的影響

繪制出生長曲線，觀察LMP1TRADD對SP18細胞生長的影響。結果顯示SP18-LMP1細胞生長較SP18-LMP1TRADD細胞生長快(P<0.05)，提示TRADD區是LMP1促進SP18細胞增殖的重要功能活性區，見圖2。

Figure 2.The growth curves of SP18-LMP1 cells and SP18-LMP1TRADDcells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSP18-LMP1TRADDcells.

圖2 SP18-LMP1與SP18-LMP1TRADD細胞的生長曲線

3 LMP1TRADD對SP18細胞集落形成的影響

平皿集落形成實驗觀察LMP1TRADD對SP18細胞集落形成的影響。結果顯示，SP18-LMP1較SP18-LMP1TRADD細胞的集落數多，體積大(表1)，說明LMP1具有促SP18細胞增殖能力，而LMP1TRADD促SP18細胞增殖的能力降低(P<0.05)，提示TRADD區是LMP1促進SP18細胞增殖的重要功能活性區。

4 LMP1TRADD對SP18細胞集落形成的影響

軟瓊脂集落形成實驗觀察LMP1TRADD對SP18細胞集落形成的影響，結果顯示，SP18-LMP1細胞較SP18-LMP1TRADD細胞的集落數多，體積大(表1)，說明LMP1TRADD促SP18細胞生長增殖的能力較LMP1降低(P<0.05)，同樣提示TRADD區是LMP1促進SP18細胞增殖的重要功能活性區。

表1 SP18-LMP1與SP18-LMP1TRADD細胞集落形成數的比較

Table 1.The comparison of forming colony numbers between SP18-LMP1 cells and SP18-LMP1TRADDcells (Mean±SD.n=3)

CellsColonynumberFocinumberSP18-LMP1186±38964±149SP18-LMP1TRADD 126±26* 672±118*

*P<0.05vsSP18-LMP1 cells.

5 LMP1TRADD對SP18細胞增殖指數的影響

用流式細胞術檢測了SP18-LMP1細胞和SP18-LMP1TRADD細胞的周期分布。結果表明SP18-LMP1細胞的S期和G2期百分率較SP18-LMP1TRADD細胞明顯增多，而G1期減少，細胞增殖指數增高(表2)，提示LMP1通過TRADD活性區影響細胞的增殖指數，促進SP18細胞增殖。

表2 SP18-LMP1細胞與SP18-LMP1TRADD細胞的細胞周期分布及細胞增殖指數的比較

Table 2.The proliferation index and distribution of cell cycle of SP18-LMP1 cells and SP18-LMP1TRADDcells (Mean±SD.n=3)

CellsG1(%)SandG2(%)Proliferationindex(%)SP18-LMP112.6±1.287.4±2.887.4SP18-LMP1TRADD30.8±1.569.2±2.2*69.2*

*P<0.05vsSP18-LMP1 cells.

6 SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD細胞差異基因的篩選

采用Agilent基因芯片分析，篩選獲得SP18-LMP1 細胞和 SP18-LMP1TRADD細胞間差異倍數大于2或小于0.5的增殖相關基因63個，在SP18- LMP1TRADD細胞中上調基因33個，下調基因30個，具體見表3。

討 論

鼻咽癌SP18細胞曾被報道具有干細胞樣特性[2]。LMP1是EB病毒基因組編碼的具有促細胞癌變和轉移作用的重要致瘤蛋白，由386個氨基酸(amino acids，aa)殘基組成的跨膜糖蛋白，包括親水性氨基端胞漿區、6個不同的疏水性跨膜區和親水性羧基端胞漿區3個功能活性區結構域[6-8]，其中CTAR2位于351～386 aa，能與TRADD蛋白結合介導高水平NF-κB及AP-1的活化[8-9]。LMP1具有類似CD40的自動聚合活化功能，在細胞內活化多條信號通路中的致瘤蛋白[4-5]。我們的結果顯示CTAR2的TRADD活性區突變后(LMP1TRADD)，SP18-LMP1TRADD細胞生長速度較SP18-LMP1細胞減緩，且增殖能力降低，以及細胞的增殖指數也降低，說明TRADD活性區是LMP1羧基末端促SP18細胞增殖的重要功能活性位點。為了解TRADD活性區影響SP18細胞增殖的作用機制，本研究采用Agilent基因芯片檢測出63個TRADD活性區參與調節的相關基因，這些基因涉及CYP1A1和NGFR等，它們可能參與調節SP18細胞的增殖。

表3 LMP1-TRADD活性區調節SP18細胞的增殖相關基因

Table 3 (continued)

“↑” showed up-regulated genes in SP18-LMP1TRADDcells; “↓” showed down-regulated genes.

細胞色素P450家族1(cytochrome P450 family 1，CYP1)是與多種內、外源性化合物代謝相關的CYP450酶，已知有2個亞型，即CYP1A與CYP1B。其中CYP1A又可分為CYP1A1和CYP1A2[10]。CYP1A1是細胞色素P450家族主要的代謝酶之一，能通過氧化、還原和水解作用，改變體內化學物質的功能或使其分解[11]。CYP1A1主要位于肝外組織，參與多種類固醇激素、藥物和部分前致癌物的代謝，體內、外多因素可誘導其表達[12]。有研究報道，CYP1A1參與雌二醇代謝的部分代謝產物能促進乳腺癌的發生與發展[13]。本研究推測LMP1-TRADD活性區參與CYP1A1的表達可能與其誘導細胞的增殖，以及參與鼻咽癌的發生有關。

神經生長因子受體(nerve growth factor receptor，NGFR)在體內分布十分廣泛，存在于神經嵴和交感神經的感覺神經細胞膜上[14]。有研究報道，在一些非神經細胞的胞膜上，也存在NGFR[15]。NGFR主要有2種[16]，一為高親和力的受體TrkA；另一為低親和力的受體p75NGFR。有文獻報道，TrkA可促進乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌的生長、侵襲和轉移，其在組織中表達呈陽性，提示患者可能預后不良[17]。有研究報道，p75NGFR可抑制乳腺癌、前列腺癌等的生長、侵襲和轉移，其在組織中陽性表達患者預后良好[18]。在膀胱癌和前列腺癌中研究發現，p75NGFR通過抑制細胞增殖和促進調亡，抑制腫瘤及其轉移[19]。本研究發現，SP18-LMP1細胞中NGFR表達下調，而SP18-LMP1TRADD細胞中表達上調，提示TRADD活性區抑制NGFR的表達。由于NGFR這2種受體的功能作用完全不同，因此推測LMP1參與下調NGFR的表達可能與p75NGFR有關，至于具體機制有待以后的進一步研究。

總之，本研究鑒定了63個TRADD活性區調節的鼻咽癌SP18細胞增殖相關基因。至于LMP1如何調控這些基因的表達，以及這些基因如何影響鼻咽癌SP18細胞的增殖，及相互之間的具體調節網絡，仍有待以后的深入研究。

[1] Chen ZT, Liang ZG, Zhu XD. A review: proteomics in nasopharyngeal carcinoma [J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(7):15497-15530.

[2] Wang J, Guo LP, Chen LZ, et al. Identification of cancer stem cell-like side population cells in human nasopharyngeal carcinoma cell line[J]. Cancer Res, 2007, 67(8): 3716-3724.

[3] Wei P, Niu M, Pan S, et al. Cancer stem-like cell: a novel target for nasopharyngeal carcinoma therapy[J]. Stem Cell Res Ther, 2014, 5(2):44.

[4] 肖 娟， 張志偉， 伍石華， 等. LMP1 羧基端活化區3對鼻咽癌干細胞SP18 遷移與侵襲的影響[J]. 生物化學與生物物理進展, 2015, 42(1): 65-72.

[5] 趙 強， 張志偉， 劉重元， 等. LMP1調節鼻咽上皮與鼻咽癌組織中P27與RPLP0蛋白的表達[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(10):1830-1834.

[6] 張志偉， 趙 強， 劉重元， 等. LMP1-CTAR3調節CK19與Vimentin蛋白在鼻咽上皮與鼻咽癌中的表達意義[J]. 診斷病理學雜志,2012,19(4):302-304.

[7] 張志偉， 劉潔瓊， 余艷輝， 等. EB病毒LMP1促鼻咽上皮細胞增殖的蛋白分子鑒定[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(2):287-292.

[8] Zhang Q, Zhang ZW, Wang CK, et al. Proteome analysis of the transformation potential of the Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein 1 in nasopharyngeal epithelial cells NP69[J]. Mol Cell Biochem, 2008, 314(1-2): 73-83.

[9] 張志偉， 張 瓊， 余艷輝， 等. EB病毒LMP1-CTAR3對NP69細胞增殖和蛋白表達的影響[J]. 生物化學與生物物理進展, 2009, 36(5): 580-586.

[10]Raccor BS, Kaspera R. Extra-hepatic isozymes from the CYP1 and CYP2 families as potential chemotherapeutic targets[J]. Curr Top Med Chem, 2013, 13(12):1441-1453.

[11]Cui J, Li S. Inhibitors and prodrugs targeting CYP1: a novel approach in cancer prevention and therapy[J]. Curr Med Chem,2014, 21(5):519-552.

[12]Nebert DW, Shi Z, Gálvez-Peralta M, et al. Oral benzo[a]pyrene: understanding pharmacokinetics, detoxication, and consequences--Cyp1 knockout mouse lines as a paradigm[J]. Mol Pharmacol, 2013, 84(3):304-313.

[13]Androutsopoulos VP, Papakyriakou A, Vourloumis D, et al. Dietary flavonoids in cancer therapy and prevention: substrates and inhibitors of cytochrome P450 CYP1 enzymes[J]. Pharmacol Ther, 2010, 126(1):9-20.

[14]Micera A, Lambiase A, Stampachiacchiere B, et al. Nerve growth factor and tissue repair remodeling: trkANGFRand p75NTR, two receptors one fate[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2007, 18(3-4):245-256.

[15]Ishii A, Muramatsu T, Lee JM, et al. Expression of p75NGFR, a proliferative and basal cell marker, in the buccal mucosa epithelium during re-epithelialization[J]. Acta Histochem Cytochem, 2014, 47(4):145-153.

[16]Balzamino BO, Biamonte F, Esposito G, et al. Characterization of NGF, trkANGFR, and p75NTRin retina of mice lacking reelin glycoprotein[J]. Int J Cell Biol, 2014, 2014:725928.

[17]Yang Z, Chen H, Huo L, et al. Epigenetic inactivation and tumor-suppressor behavior of NGFR in human colorectal cancer[J]. Mol Cancer Res, 2015, 13(1):107-119.

[18]Chan MM, Tahan SR. Low-affinity nerve growth factor receptor (P75 NGFR) as a marker of perineural invasion in malignant melanomas[J]. J Cutan Pathol, 2010, 37(3):336-343.

[19]Wang W, Zhao H, Zhang S, et al. Patterns of expression and function of the p75NGFRprotein in pancreatic cancer cells and tumours[J]. Eur J Surg Oncol, 2009, 35(8):826-832.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

XIAO Juan1, ZHANG Xian-feng1, LIU Zhong-yuan2, LUO Zhao-yang2, ZHU Jian-si2,ZHANG Ling3, ZHANG Zhi-wei2

(1DepartmentofOtorhinolaryngology,TheSecondAffiliatedHospital，2CancerInstituteofMedicalCollege,KeyLaboratoryofCancerCellularandMolecularPathologyinHunanProvince，3ClinicalMedicineExcellentProgramforUndergraduateofMedicalCollege,UniversityofSouthernChina,Hengyang421001,China.E-mail:nhdxzzw@qq.com)

AIM: To investigate the effects of TNF receptor-associated death domains (TRADD) of latent membrane protein 1 (LMP1) on the proliferation of nasopharyngeal cancer SP18 cells. METHODS: The SP18-LMP1 cells and SP18-LMP1TRADDcells, which expressed LMP1 and LMP1TRADDproteins, respectively, were established. The proliferation of SP18 cells affected by LMP1TRADDwas detected by cell counting to analyze the cell growth curve, and by colony formation assay, soft agar formation assay, and flow cytometry. Moreover, the expression profile of differential genes between SP18-LMP1 cells and SP18-LMP1TRADDcells was analyzed by gene chips. RESULTS: The cell growth curve, and the results of colony formation and soft agar formation displayed that the growth velocity and colony forming ability of SP18-LMP1 cells were stronger than those of SP18-LMP1TRADDcells (P<0.01). The results of flow cytometry analysis showed that the proliferation index of SP18-LMP1 cells was higher than that of SP18-LMP1TRADDcells (P<0.01). Sixty-three differentially expressed genes associated with cell proliferation were screened out, in which 33 genes were up-regulated and 30 were down-regulated in the SP18-LMP1TRADDcells. CONCLUSION: TRADD active region is an important functional site of LMP1 to promote the proliferation of SP18 cells. LMP1 may improve the cell proliferation index and induce the proliferation of SP18 cells through TRADD.

Nasopharyngeal carcinoma; Latent membrane protein 1; TNF receptor-associated death domains; Gene chips; Cell proliferation

1000- 4718(2017)04- 0682- 06

2016- 04- 21

2017- 01- 10

湖南省自然科學衡陽聯合基金資助項目(No. 12JJ9033)；湖南省自然科學基金資助項目(No. 13JJ3079)；湖南省科技廳項目(No. 2013SK3118； No. 2014SK3081)；湖南省高校創新平臺基金資助項目(No. 10K052; No. 12K094; No. 13K083)；湖南省教育廳課題(No. 11C1112; No. 12C0340)；湖南省衛生廳項目(No. B2014-163；No. B2013-048)

R318.0

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.017

Proliferation of nasopharyngeal carcinoma SP18 cells promoted by latent membrane protein 1 through TNF receptor-associated death domains

△通訊作者 Tel: 0734-8281075； E-mail: nhdxzzw@qq.com