SLeX對肝癌HepG2細胞遷移和侵襲的影響*

武文娟， 崔 燦， 康品方， 石玉榮， 耿英華

(1蚌埠醫學院生化與分子生物學教研室，安徽 蚌埠 233030； 2徐州市中心醫院檢驗科，江蘇 徐州 221009；蚌埠醫學院第一附屬醫院 3心血管科， 4血液科，安徽 蚌埠 233004)

SLeX對肝癌HepG2細胞遷移和侵襲的影響*

武文娟1△， 崔 燦2， 康品方3， 石玉榮1， 耿英華4

(1蚌埠醫學院生化與分子生物學教研室，安徽 蚌埠 233030；2徐州市中心醫院檢驗科，江蘇 徐州 221009；蚌埠醫學院第一附屬醫院3心血管科，4血液科，安徽 蚌埠 233004)

目的： 探討唾液酸化路易斯寡糖X(sialyl Lewis X， SLeX)在肝癌HepG2細胞中的表達及其對HepG2細胞遷移能力和侵襲能力的影響。方法: 實時熒光定量PCR和Western blot法檢測α1,3-巖藻糖基轉移酶VII (α1, 3-fucosyltransferase VII， FUT7)在HepG2細胞和L-02細胞中的表達，Western blot及免疫細胞化學染色檢測SLeX在HepG2細胞和L-02細胞中表達，應用Transwell小室檢測SLeX單克隆抗體封閉后HepG2細胞侵襲和遷移能力的改變。結果: FUT7和SLeX在HepG2細胞中表達，而在L-02細胞中無表達； 0.05、0.5和5 mg/L的SLeX單克隆抗體封閉后，HepG2細胞的遷移率逐漸下降，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，侵襲穿膜細胞數明顯少于對照組(P<0.05)；SLeX單克隆抗體封閉組間兩兩比較遷移率與侵襲細胞數的差異均有統計學意義(P<0.05)。結論: SLeX在肝癌HepG2細胞中高表達，與HepG2細胞遷移能力和侵襲能力密切相關。

唾液酸化路易斯寡糖X； 肝細胞癌； HepG2細胞； 細胞遷移； 細胞侵襲

腫瘤細胞和內皮細胞之間的相互作用是一個重要的過程 ，它與腫瘤血管生成和血行轉移密切相關，是惡性腫瘤治療失敗的常見原因之一。在此過程中腫瘤細胞與內皮細胞之間的黏附非常重要，有多種黏附分子參與，細胞黏附分子的表達異常或功能喪失在腫瘤的轉移過程中有重要作用。唾液酸化路易斯X(sialy Lewis X，SLeX)屬于細胞黏附分子家族，作為E-選擇素、P-選擇素和L-選擇素的配體，可以介導腫瘤細胞與內皮細胞的黏附作用[1]，使腫瘤細胞穿過血管內皮細胞的基底膜，促使癌細胞轉移和擴散。SLeX在多種腫瘤細胞過表達[2]，參與并介導腫瘤細胞的血行轉移，可能作為腫瘤預后的一個標志物。為了探討降低或封閉SLeX的表達是否能減少腫瘤細胞的侵襲和轉移，本文檢測了SLeX及參與SLeX合成的關鍵酶 α1,3-巖藻糖基轉移酶VII(α1, 3-fucosyltransferase VII，FUT7)在肝癌細胞株HepG2及正常肝細胞株L-02中表達差異，并用SLeX單克隆抗體封閉SLeX，觀察其對HepG2細胞遷移能力和侵襲能力的影響。

材 料 和 方 法

1 主要材料和試劑

肝癌細胞株HepG2及正常肝細胞株L-02 由本實驗診斷中心凍存；DMEM高糖培養基為Gibco產品；胰酶為Life Technologies產品；新生牛血清購自杭州四季青生物制品公司； TRIzol和DEPC購自Invitrogen；PCR試劑盒購自天根公司；Transwell小室為Corning產品；MTT和二甲亞砜(DMSO)購自Sigma；Matrigel基質蛋白和鼠抗人SLeX單克隆抗體為BD產品；FUT7羊抗人多克隆抗體和HRP標記的羊抗鼠IgG購自Santa Cruz。

2 主要方法

2.1 細胞培養 復蘇凍存的肝癌細胞株HepG2和正常肝細胞株L-02，37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下用含10%滅活小牛血清的DMEM高糖培養基培養，每隔2～3 d傳代1次。取對數生長期細胞用于實驗。

2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測FUT7的mRNA表達 對數生長期HepG2細胞和L-02細胞經胰酶消化，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，進行熒光定量PCR檢測。FUT7的上游引物序列為5’-CCACGATCACCATCCTTG-3’，下游引物序列為5’-AGGCTTCGGTTGGCACTC-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3’，下游引物序列為5’-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3’。擴增條件為：95 ℃ 3 min； 94 ℃ 20 s、58.9 ℃ 20 s、68 ℃ 20 s，共40 個循環。GAPDH作為內參照，采用2-ΔΔCt方法分析檢測結果，實驗重復3次。

2.3 Western blot法檢測細胞蛋白水平 對數生長期HepG2細胞、L-02細胞用胰酶消化，加裂解液裂解細胞，提取總蛋白。10% SDS-PAGE電泳分離并轉膜，5%脫脂牛奶封閉孵育2 h，加入FUT7/SLeX的 I 抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜后用TBST漂洗3次； II 抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h，TBST漂洗3次，ECL顯色，Bio-Rad凝膠成像儀檢測條帶并進行灰度值分析。

2.4 免疫組織化學染色法檢測SLeX表達 處理好的細胞爬片采用免疫組織化學二步法染色觀察HepG2細胞及L-02細胞中SLeX的表達。二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，以細胞(和)細胞核出現淡黃色至棕褐色顆粒為染色陽性。顯微鏡下隨機選取5個視野(×400)，計數100個細胞中的陽性細胞數并計分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。顯色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕色或棕褐色為3分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積作為每種細胞的積分：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

2.5 MTT法檢測細胞存活率 取對數期的HepG2細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞，分別加入終濃度為0.05、0.5、5 mg/L的SLeX抗體，同時設對照組和空白調零組，分別培養12 h、24 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，離心棄上清，加入100 μL DMSO，振蕩混勻5 min ，在酶標儀上檢測490 nm波長下各孔吸光度(A)值，按以下公式計算細胞存活率(%)=(A抗體-A空白)/(A對照-A空白)×100%。每組設3個復孔，實驗重復3次。

2.6 Transwell細胞遷移實驗 調整對數生長期的HepG2細胞濃度為2×108/L，按實驗分組分別加入終濃度為0、0.05、0.5和5 mg/L的SLeX抗體，于24孔板中培養，加入的SLeX抗體可以封閉HepG2細胞的SLeX。SLeX抗體封閉HepG2細胞培養2 h后，用無血清DMEM培養基制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×107/L加入Transwell小室的上室， 每孔500 μL，下室加入含10% 胎牛血清的DMEM培養液1 000 μL，每孔3個復孔。置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2孵箱中培養12 h后，棉簽擦去小室上層未遷移的細胞，自然風干，再用瑞氏-吉姆薩復合染液染5～8 min，甲醇固定5 min，蒸餾水沖洗后自然風干；倒置顯微鏡下每個Transwell小室選取5個視野觀察進行細胞計數并拍照。以對照組遷移細胞數為參照，計算各組細胞遷移率(%)=實驗組遷移細胞數/對照組遷移細胞數×100%。

2.7 Matrigel侵襲實驗 Transwell小室底部膜的內表面預先均勻鋪制人工基底膜Matrigel，其余操作同“Transwell細胞遷移實驗”。

3 統計學處理

所有實驗數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，SPSS 19.0統計軟件分析處理，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 FUT7 mRNA在L-02細胞及HepG2細胞中的表達

實時熒光定量PCR法檢測結果表明FUT7的mRNA在肝癌細胞細胞株HepG2中的表達遠遠高于人正常肝細胞株L-02中的表達，差異有統計學顯著性，見圖1。

2 Western blot檢測L-02細胞及HepG2細胞中FUT7和SLeX的表達水平

Western blot結果顯示，HepG2細胞株中有特異性FUT7和SLeX的表達，而L-02細胞株中基本無特異性條帶，統計分析結果表明FUT7和SLeX在肝癌細胞HepG2中的表達顯著高于在正常肝細胞L-02中的表達(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The mRNA expression of FUT7 in L-02 cells and HepG2 cells detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsL-02.

圖1 L-02及HepG2細胞中FUT7的mRNA表達

Figure 2.The protein expression of FUT7 and SLeX in L-02 cells and HepG2 cells analyzed by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsL-02.

圖2 Western blot 檢測L-02細胞及HepG2細胞中FUT7和SLeX的蛋白表達

3 免疫組織化學染色結果

HepG2細胞的細胞膜、細胞質、細胞核中均呈深棕色，積分顯示為強陽性，而L-02細胞無論細胞膜、細胞質、細胞核中均呈藍色，無棕黃色顆粒，積分為0分，見圖3。這表明SLeX在HepG2細胞中為強陽性表達而在L-02細胞中無表達。

4 MTT法檢測SLeX抗體對HepG2細胞存活率的影響

用0.05、0.5和5 mg/L SLeX抗體處理HepG2細胞12 h和24 h后，MTT實驗結果顯示，與對照組相比，HepG2細胞的存活率與SLeX抗體的作用濃度和作用時間的差異均無統計學顯著性，見圖4。

Figure 3.The protein expression of SLeX in L-02 cells and HepG2 cells detected by immunocytochemical staining (×400).

圖3 免疫細胞化學染色檢測L-02和HepG2細胞中SLeX蛋白的表達

Figure 4.The viability of the HepG2 cells with different treatments. Mean±SD.n=3.

圖4 HepG2細胞經不同因素作用后的存活率變化

5 SLeX對HepG2細胞遷移能力的影響

采用不同濃度SLeX抗體封閉HepG2細胞后，計數穿膜細胞數并計算細胞的遷移率，研究細胞遷移能力的改變。實驗結果顯示，在沒有SLeX抗體封閉情況下設HepG2細胞遷移率為100%，當分別用0.05、0.5和5 mg/L的 SLeX抗體封閉后，HepG2細胞的遷移率隨著SLeX抗體濃度的增加，穿膜細胞數量逐漸降低，遷移率逐漸下降，與對照組相比差異有統計學顯著性(P<0.05)，且遷移率與SLeX抗體濃度有顯著負相關(r=-0.987，P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The migration ability of the HepG2 cells treated with different doses of SLeX antibody. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L.

圖5 SLeX抗體作用于HepG2細胞后的遷移情況

6 SLeX對HepG2細胞侵襲能力的影響

不同濃度SLeX抗體封閉HepG2細胞后，3個抗體封閉組降解Matrigel膠侵襲穿膜的細胞數量隨SLeX抗體濃度的增加而逐漸下降，抑制作用呈劑量依賴性。經統計學分析，0.05、0.5和5 mg/L的 SLeX抗體封閉組侵襲穿膜細胞數明顯少于對照組(P<0.05)，SLeX抗體封閉組之間兩兩比較差異均有統計學顯著性(P<0.05)，穿膜細胞數與SLeX抗體濃度呈顯著負相關(r=-0.966，P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The effects of SLeX antibody on the invation of HepG2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L.

圖6 不同濃度SLeX抗體封閉對HepG2細胞侵襲能力的影響

討 論

腫瘤細胞的血行轉移涉及多個步驟，腫瘤細胞與血管內皮細胞的特異性黏附是其中的關鍵步驟之一，是腫瘤細胞向遠處轉移、定居的先決條件，黏附不僅是腫瘤細胞定向轉移生長的基礎，同時抑制宿主免疫應答，有利于腫瘤免疫逃逸。細胞膜上存在的黏附分子是介導細胞與細胞之間黏附的必要條件，SLeX 是黏附分子之一，其作為選擇素的配體與選擇素相互黏附和作用,在腫瘤細胞與血管內皮細胞黏附中起關鍵作用。

SLeX是Lewis X 抗原的唾液酸基衍生物，由半乳糖、葡萄糖、唾液酸、N-乙酰基和巖藻糖5個分子結合而成。正常情況下，SLeX 主要表達于人單核細胞和粒細胞表面。近年研究表明，它是糖化的腫瘤相關抗原，結腸癌、 前列腺癌、 肺癌等多種腫瘤細胞表面均有表達，可使腫瘤細胞與靶器官內皮細胞緊密黏附，誘導腫瘤細胞變形，促進腫瘤細胞趨化運動，從而導致轉移[3]。Okuno 等[4]研究表明高表達SLeX的結直腸癌細胞可以減少肝竇中淋巴細胞介導的殺傷作用，促進腫瘤細胞更易轉移到肝臟。結直腸癌組織中SLeX表達的增加與腫瘤的復發有一定的聯系，生存分析亦顯示高SLeX表達的患者存活率較差[5]。鄧武堅等[6]用免疫組織化學方法檢測肝癌組織中SLeX的陽性表達率為 64.1%，且與患者生存期、門脈癌栓、術前肝外轉移、衛星灶、術后3月內復發密切相關。Gunawardena 等[7]研究證實頭頸部鱗狀細胞癌患者中SLeX 表達陽性的預后較差，阻斷腫瘤細胞與內皮細胞黏附可減少腫瘤的淋巴結轉移和遠處轉移。

FUT7 是SLeX合成過程中的關鍵酶，FUT7的活性可以直接影響SLeX的表達量。用 pEGFP-C1-FUT7轉染人乳腺癌細胞MDA-MB-231，觀察 FUT7及其產物 SLeX表達的改變，結果發現穩轉組細胞FUT7及其產物 SLeX的表達量明顯高于轉染空質粒組及未轉染組[8]。過表達FUT7可以上調SLeX的合成[9]。我們的研究中發現，FUT7在肝癌細胞細胞株HepG2中有表達，而在人正常肝細胞株L-02中表達量極低，Western blot及免疫細胞化學染色結果均顯示SLeX在HepG2細胞中表達而在L-02細胞中未見表達。實驗結果進一步證實FUT7是SLeX合成過程中的關鍵酶，正常肝細胞無SLeX表達，所以無遷移和侵襲能力，而肝癌細胞中有SLeX表達，可能與其遷移和侵襲能力有關。

肝癌細胞中的SLeX表達是否與其遷移和侵襲能力有關？崔紅霞等[8]通過過表達FUT7促使SLeX合成增加，增強SLeX介導的人乳腺癌MDA-MB-231細胞的黏附能力和遷移能力。Brown 等[10]通過抑制SLeX 的生物合成，達到了抑制肺癌細胞的血行轉移的目的。Kawamura等[11]通過引入Sda 碳水化合物結構到胃癌細胞株KATO III和結腸癌細胞株HT29中，降低SLeX 和SLea的表達，從而抑制了胃腸道腫瘤細胞的轉移。McFerrin 等[12]實驗證實人骨髓間充質基質細胞表達SLeX并可黏附于血管內皮細胞，用SLeX抗體封閉SLeX表達后降低了人骨髓間充質基質細胞在小動脈內的滾動和黏附。Borentain等[13]研究表明抑制E-選擇素的表達可以抑制SLeX與E-選擇素間的相互作用，從而抑制純合子裸鼠內高表達SLeX的HepG2細胞腫瘤的生長，對低表達SLeX的HuH7細胞腫瘤則無作用。抑制肝癌細胞表達SLeX從而抑制腫瘤生長的機制可能是通過抑制新生血管生成實現的[13]。Naoya等[14]研究顯示CD82通過下調ST3GAL4使SLeX表達減少，從而降低腫瘤細胞的血管黏附，抑制轉移。我們用SLeX單克隆抗體封閉HepG2細胞證實：加入SLeX單克隆抗體后，細胞生長沒有受到抑制，但細胞的遷移能力、侵襲能力均隨著SLeX抗體濃度的增加而減弱且差異具有顯著性，說明利用SLeX 的單克隆抗體與SLeX 結合，可以減弱HepG2細胞的遷移、侵襲能力，從而抑制肝癌的轉移。由此可見腫瘤細胞的血行轉移與SLeX表達量的高低密切相關，所以通過降低或封閉SLeX表達，阻斷SLeX和選擇素的相互作用，有望能有效抑制腫瘤細胞轉移。針對SLeX和選擇素的相互作用，抗腫瘤藥物的作用方式主要分為以下幾類：SLeX 的單克隆抗體與SLeX 結合、降低SLeX 合成中關鍵酶的活性、抑制選擇素的表達、抑制SLeX和選擇素的接觸等。本實驗研究結果表明用SLeX單克隆抗體與SLeX 結合，降低了HepG2細胞的遷移能力、侵襲能力，可能成為肝癌的治療方向之一。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of SLeX on invasion and migration of HepG2 cells

WU Wen-juan1, CUI Can2, KANG Pin-fang3, SHI Yu-rong1, GENG Ying-hua4

(1DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BengbuMedicalCollege,Bengbu233030,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,XuzhouCentralHospital,Xuzhou221009,China;3DepartmentofCardiovascularMedicine,4DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China.E-mail:wuwj_2012@126.com)

AIM: To investigate the expression and effects of sialyl Lewis X (SLeX) on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells. METHODS: The expression of α1,3-fucosyltransferase VII (FUT7) in HepG2 cells and L-02 cells was detected by RT-qPCR and Western blot. The SLeX expression in HepG2 cells and L-02 cells was determined by Western blot and immunocytochemical staining. The invasion and migration abilities of the treated cells were evaluated by Transwell assay. RESULTS: The expression of FUT7 and SLeX in the HepG2 cells, but not in the L-02 cells, was observed. The invasion rates of the HepG2 cells treated with SLeX monoclonal antibody at 0.05, 0.5 and 5 mg/L were significantly decreased as compared with control group (P<0.05). The migration ability of the HepG2 cells treated with SLeX monoclonal antibody at 0.05, 0.5 and 5 mg/L was also significantly reduced as compared with control group (P<0.05). The invasion rate and migratory cell number were significantly different between any 2 groups in the HepG2 cells treated with SLeX monoclonal antibody at 0.05, 0.5 and 5 mg/L (P<0.05). CONCLUSION: HepG2 cells express SLeX. SLeX is closely related to the migration and invasion abilities of the HepG2 cells.

Sialyl Lewis X; Hepatocellular carcinoma; HepG2 cells; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2017)04- 0688- 06

2016- 07- 28

2016- 12- 13

安徽省教育廳省自然科學基金資助項目(No. KJ2011B098； No. KJ2014A162; No. KJ2017A234)； 國家級大學生創新訓練計劃(No. 201310367041)

R735.7； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.018

△通訊作者 Tel： 0552-3175909； E-mail: wuwj_2012@126.com