miR-let-7d通過(guò)調(diào)控核受體PPARγ促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲*

鐘加滕， 郭志剛， 蘇 蔚

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 3第一附屬醫(yī)院病理科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

miR-let-7d通過(guò)調(diào)控核受體PPARγ促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲*

鐘加滕1， 郭志剛2， 蘇 蔚3△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，3第一附屬醫(yī)院病理科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的： 探討miR-let-7d對(duì)肺癌細(xì)胞核受體過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的調(diào)控及對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。方法: 用生物信息學(xué)分析與PPARγ相關(guān)的microRNA，通過(guò)質(zhì)粒報(bào)告基因驗(yàn)證miR-let-7d的作用靶點(diǎn)；利用Western blot法篩選出PPARγ表達(dá)水平低的肺癌細(xì)胞株；通過(guò)雙螢光素酶標(biāo)記和Western blot法驗(yàn)證miR-let-7d對(duì)肺癌細(xì)胞中PPARγ表達(dá)的調(diào)控作用；通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-let-7d對(duì)肺癌細(xì)胞增殖能力的調(diào)控作用；通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-let-7d對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的作用。結(jié)果: 生物信息學(xué)的分析結(jié)果證明miR-let-7d可以調(diào)控核受體PPARγ的蛋白表達(dá)；在核受體PPARγ的3’UTR包含2個(gè)功能性的miR-let-7d結(jié)合位點(diǎn)；PPARγ是miR-let-7d的直接靶點(diǎn)，miR-let-7d可在蛋白和mRNA水平直接調(diào)控PPARγ的表達(dá)；miR-let-7d inhibitor通過(guò)升高PPARγ的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。結(jié)論: miR-let-7d能夠通過(guò)靶向增加具有抑癌作用的核受體PPARγ的表達(dá)水平，抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

肺癌； 微小RNA-let-7d； 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見(jiàn)也是危害性最大的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率近年來(lái)不斷上升，具有趨向年輕化的走勢(shì)。盡管有聯(lián)合化療、手術(shù)等治療方案，肺癌患者的5年生存率仍然很低[1]。肺癌細(xì)胞的病理組織形態(tài)及生物學(xué)特性具有高度多變的異質(zhì)性，也為肺癌的診治增加了難度[2-3]。因此，研究參與組成肺癌分子的經(jīng)典信號(hào)通路，探討其作用機(jī)制，尋找疾病預(yù)后指針的分子標(biāo)志物，在深入研究其和腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的基礎(chǔ)上，研發(fā)相應(yīng)的個(gè)性化治療方案，是肺癌研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是II型核受體超家族成員之一。PPARs包括PPARα、PPARβ和PPARγ 3個(gè)亞型，PPARs需要依賴配體激活的方式去調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，必須結(jié)合相應(yīng)的配體才能發(fā)揮作用，通過(guò)與靶基因元件相識(shí)別，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，參與細(xì)胞的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ存在于很多類型的腫瘤細(xì)胞中，PPARγ的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。很多前沿實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，某些PPARγ的配體(如格列酮類藥物、前列腺素代謝物)對(duì)肺癌、膀胱癌、直腸癌、胰腺癌、胃癌等多種組織器官來(lái)源的惡性腫瘤發(fā)揮顯著的抗癌作用[5-8]。因此PPARγ被認(rèn)為是腫瘤靶向治療的新方向，可以通過(guò)研究PPARγ的配體研發(fā)新的藥物。

miR-let-7d是最先被研究的微小RNA(microRNA，miRNA，miR)之一，長(zhǎng)度大約為21 nt，5P端序列為3’-UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-5’，3P端序列為3’-CCACACAACCUACUACCUCAUU-5’。miR-let-7d在卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌等多種類型的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[9-12]。miR-let-7d可與原癌基因如RAS、MYC等結(jié)合，抑制腫瘤的進(jìn)展，所以miR-let-7d扮演一個(gè)抑癌基因的角色[13]。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析miR-let-7d和PPARγ的關(guān)系，認(rèn)為miR-let-7d可以調(diào)控PPARγ的表達(dá)水平，通過(guò)螢光素酶標(biāo)記驗(yàn)證PPARγ是miR-let-7d的直接靶點(diǎn)，然后利用miR-let-7d mimic過(guò)表達(dá)miR-let-7d的表達(dá)，觀察PPARγ的表達(dá)水平，以及肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的變化，探討miR-let-7d肺癌的增殖和侵襲能力的影響。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株與主要試劑

人肺癌細(xì)胞株A549、Bcl-2、M14、SPCA1和NCL-H446肺癌細(xì)胞株購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞研究所。胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco；抗PPARγ兔單克隆抗體購(gòu)自Abcam；質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪基因；Transwell小室購(gòu)自Millipore；Matrigel購(gòu)自BD。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 首先合成PCR引物，將反應(yīng)混合液加熱至94～98 ℃保持20～30 s，反應(yīng)溫度降至50～65 ℃時(shí)，引物與互補(bǔ)的序列形成氫鍵。退火溫度72 ℃，維持20～40 s，繼續(xù)降低至68 ℃，PCR進(jìn)行30～35個(gè)循環(huán)，68～74 ℃延伸5～10 min，使DNA全部反應(yīng)完畢。通過(guò)PCR結(jié)果對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2 Western blot法檢測(cè)PPARγ蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入loading buffer后煮沸蛋白。采用10% SDS-PAGE分離蛋白(每孔加入30 μg蛋白樣品)。使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶1 000 TBST稀釋 I 抗(PPARγ)，4 ℃過(guò)夜；加入1∶5 000稀釋的羊抗兔 II 抗，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PPARγ表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 所有試劑及器材均置于冰上預(yù)冷，將小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel 50 μL(0.2 g/L)的Transwell小室置于24孔板內(nèi)，37 ℃孵育15 min，使膠凝固；消化、離心、計(jì)數(shù)細(xì)胞后，按照2.5×104/L用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；按照每孔200 μL，將細(xì)胞懸液加入Transwell上室，同時(shí)在Transwell下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μL，放入37 ℃孵箱培養(yǎng)；甲醛固定，結(jié)晶紫染色15 min，然后用棉簽輕輕擦拭內(nèi)膜上的細(xì)胞。顯微鏡下計(jì)數(shù)4個(gè)高倍視野(×40)下穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PPARγ表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖能力的影響 根據(jù)腫瘤細(xì)胞可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)的特性，使用常規(guī)培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液。加入5 mL無(wú)菌PBS溶液，輕輕吹散洗滌細(xì)胞沉淀并再次離心。反復(fù)洗滌3次后加入培養(yǎng)基，制備成單細(xì)胞懸液。測(cè)定腫瘤細(xì)胞濃度并調(diào)整為1×106/L，將單細(xì)胞懸液均勻接種在無(wú)菌6孔板內(nèi)，進(jìn)行平板集落培養(yǎng)。每3 d更換培養(yǎng)基1次，14 d后觀察細(xì)胞集落形成情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 生物信息學(xué)分析針對(duì)PPARγ的microRNA情況

為了探究是否存在能調(diào)節(jié) PPARγ表達(dá)的 microRNA，首先從 GenBank中調(diào)取了 PPARγ的編碼基因PSRRA(NM_004761)的 mRNA 序列。針對(duì)該基因 3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)，用3種最常用的 microRNA 位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件(TargetScan[14]、PicTar[15]和 miRanda[16])對(duì)其進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)以下的4條 mircoRNA：hsa-miR-125b、hsa-miR-37、hsa-miR-135a 和 hsa-miR-let-7d 在3種軟件的評(píng)分系統(tǒng)中均獲得了較高分值，極具與PPARγ 3’-UTR 發(fā)生功能性結(jié)合的潛力，因而用于后續(xù)研究。

運(yùn)用 Western blot 技術(shù)檢測(cè)4條microRNA(hsa-miR-125b、hsa-miR-37、hsa-miR-135a和hsa-miR-let-7d)對(duì)PPARγ表達(dá)水平的影響。將以上 microRNA mimic轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞株A549，結(jié)果顯示只有 hsa-miR-let-7d能夠顯著抑制 PPARγ蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effects of microRNA mimic transfection on the protein expression of PPARγ in the A549 cells. Mean±SD.n=10.

圖1 不同micro mRNA mimic 轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)的影響

2 核受體PPARγ的3’-UTR包含2個(gè)功能性miR-let-7d結(jié)合位點(diǎn)

生物信息學(xué)的分析結(jié)果顯示，在PPARγ的3’-UTR 有2個(gè)潛在的miR-let-7d結(jié)合位點(diǎn)，暫將其命名為位點(diǎn)A和位點(diǎn)B。使用PPARγ質(zhì)粒報(bào)告基因活性分析進(jìn)一步鑒定這2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的功能，顯示miR-let-7d能顯著降低含野生型全長(zhǎng)PPARγ 3’-UTR 報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性，而其中任意一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的缺失都在一定程度上削弱miR-let-7d對(duì)報(bào)告基因活性的抑制作用，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)位點(diǎn)B缺失時(shí)，miR-let-7d對(duì)報(bào)告基因的抑制率從57%降低到35%左右；當(dāng)位點(diǎn)A缺失時(shí)，抑制率從57%下降到18%；如果2個(gè)位點(diǎn)都缺失，miR-let-7d不再對(duì)報(bào)告基因的活性產(chǎn)生任何影響。這提示3’-UTR 同時(shí)擁有2個(gè)功能性的 miR-let-7d識(shí)別位點(diǎn)，雖然兩者與miR-let-7d的親和力具有差別(位點(diǎn)A在 miR-let-7d介導(dǎo)的報(bào)告基因活性抑制中起著主要作用)，但兩者能以效應(yīng)疊加的方式共同介導(dǎo) miR-let-7d 對(duì)含PPARγ 3’-UTR 的報(bào)告基因活性的抑制。

Figure 2.Reporter activity assays to identify the exact miR-let-7d binding sites in PPARγ 3′-UTR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsnegative control.

圖2 報(bào)告基因活性分析鑒定PPARγ 3’-UTR中miR-let-7d的精確結(jié)合位點(diǎn)

3 不同肺癌細(xì)胞株P(guān)PARγ和miR-let-7d的表達(dá)情況

為了探討肺癌中miR-let-7d 和PPARγ表達(dá)水平的聯(lián)系，檢測(cè)不同肺癌細(xì)胞株(Bcl-2、A549、M14、SPC-A1和NCL-H446)PPARγ表達(dá)水平的差異。如圖3所示，所有肺癌細(xì)胞株都有PPARγ表達(dá)缺失的情況。其中A549細(xì)胞株P(guān)PARγ的表達(dá)缺失水平最嚴(yán)重。miR-let-7d和PPARγ在表達(dá)水平上存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，提示miR-let-7d在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)可能是導(dǎo)致PPARγ表達(dá)增高的主要原因。

4 miR-let-7d對(duì)肺癌細(xì)胞PPARγ表達(dá)的調(diào)控作用

如圖4A、B所示，向PPARγ表達(dá)水平最低的肺癌細(xì)胞株A549轉(zhuǎn)染miR-let-7d mimic能同時(shí)在mRNA和蛋白水平下調(diào)PPARγ的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-let-7d inhibitor可以在mRNA和蛋白水平上調(diào)PPARγ的表達(dá)，提示miR-let-7d不僅能夠促進(jìn)PPARγ mRNA 的降解，還能阻礙PPARγ蛋白的翻譯。雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PPARγ是miR-let-7d的直接靶點(diǎn)，見(jiàn)圖4C。考慮到肺癌細(xì)胞也同時(shí)表達(dá)PPARγ家族的另一成員 PPARα，兩者無(wú)論在結(jié)構(gòu)還是在功能上都有一定的相似性[17]，且生物信息學(xué)預(yù)測(cè)在 PPARα的3’-UTR 也含有 miR-let-7d的結(jié)合位點(diǎn)，因此本研究也檢測(cè)了 miR-let-7d對(duì) PPARα表達(dá)的影響。結(jié)果表明，miR-let-7d對(duì)PPARα的表達(dá)并無(wú)影響，見(jiàn)圖 4D。

5 敲減miR-let-7d的表達(dá)可以調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖

如圖5所示，轉(zhuǎn)染miR-let-7d inhibitor后，細(xì)胞集落形成的數(shù)目明顯減少，集落直徑距離降低，即細(xì)胞增殖能力下降。此結(jié)果提示miR-let-7d可以通過(guò)調(diào)控PPARγ的表達(dá)水平影響肺癌細(xì)胞的增殖能力。

Figure 3.The expression of PPARγ in different lung cancer cell lines. Mean±SD.n=10.

圖3 不同肺癌細(xì)胞株中PPARγ的表達(dá)情況

Figure 4.The regulatory effects of miR-let-7d on PPARγ expression in the lung cancer cells. A: miR-let-7d mimic down-regulated the mRNA and protein expression of PPARγ; B: miR-let-7d inhibitor up-regulated the mRNA and protein expression of PPARγ; C: dual luciferase-labeled PPARγ was a direct target of miR-let-7d; D: miR-let-7d did not regulate the expression level of PPARα. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNC.

圖4 miR-let-7d對(duì)肺癌細(xì)胞中PPARγ表達(dá)的調(diào)控作用

Figure 5.Knockdown of miR-let-7d expression inhibited lung cancer cell proliferation (×40). Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNC.

圖5 敲減miR-let-7d的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖

6 敲減miR-let-7d的表達(dá)可以調(diào)控肺癌細(xì)胞的侵襲

Transwell實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)轉(zhuǎn)染miR-let-7d inhibitor后，穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示miR-let-7d可以通過(guò)調(diào)控PPARγ的表達(dá)水平影響肺癌細(xì)胞的侵襲能力，見(jiàn)圖6。

Figure 6.Knockdown of miR-let-7d expression inhibited the invasion ability of lung cancer cells (×40). Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNC.

圖6 敲減miR-let-7d的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力

討 論

隨著分子靶向治療的進(jìn)展，臨床研究和分子生物學(xué)研究都提示PPARγ在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。低表達(dá)PPARγ提示病程較晚，治療效果不佳。而促進(jìn)PPARγ的表達(dá)則能明顯抑制惡性腫瘤的增殖和侵襲。因此探討PPARγ在肺癌中表達(dá)調(diào)控和作用機(jī)制，可以有效幫助我們了解PPARγ與肺癌進(jìn)展之間的聯(lián)系，并利用調(diào)控PPARγ的表達(dá)水平來(lái)預(yù)測(cè)肺癌的進(jìn)展速度。

MicroRNA調(diào)節(jié)是基因表達(dá)調(diào)控中最為重要的一種調(diào)節(jié)方式。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)PPARγ與microRNA 相關(guān)性的調(diào)查報(bào)告，我們推測(cè)PARRγ的表達(dá)同時(shí)會(huì)受到 microRNA 的調(diào)節(jié)。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn) miR-let-7d可以通過(guò)結(jié)合2個(gè)位于 PPARγ 3’-UTR上高度保守的序列，調(diào)控PPARγ的 mRNA和蛋白水平，而且這種調(diào)節(jié)作用只針對(duì)于PPARγ，對(duì)該家族其它成員沒(méi)有調(diào)控作用。

miR-let是最早發(fā)現(xiàn)的microRNA家族之一，miR-let-7d是其家族中的一員，分化成熟后的組織器官中表達(dá)相對(duì)較高[18]。在許多類型的惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)的狀況，很多腫瘤研究都認(rèn)為miR-let-7d扮演著抑癌基因的作用。相對(duì)于正常組織，在多種腫瘤細(xì)胞系和臨床組織樣本中均檢測(cè)到其表達(dá)降低[9-12]。而對(duì)其功能的研究提示，miR-let-7d在很多腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用。然而，在肺癌細(xì)胞中miR-let-7d的表達(dá)水平和基因調(diào)控效應(yīng)還是不清楚的。我們的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在不同類型的的肺癌細(xì)胞株中miR-let-7d都普遍存在表達(dá)下調(diào)的情況。更為重要的是，其表達(dá)水平與其調(diào)控的新型肺癌生物標(biāo)志物PPARγ的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。這提示PPARγ在肺癌中的過(guò)表達(dá)很有可能與miR-let-7d 抑癌基因的表達(dá)下降有一定關(guān)系。當(dāng)然，我們所使用的肺癌細(xì)胞株的數(shù)量和種類是不齊全的，不能代表所有類型的肺癌病例。因此，我們后續(xù)研究工作是通過(guò)明確的分子分型的病理組織標(biāo)本來(lái)研究miR-let-7d和PPARγ的具體關(guān)系和機(jī)制。

PPARγ是核激素受體超家族成員之一，PPARs與維甲酸類受體形成蛋白復(fù)合物與靶點(diǎn)結(jié)合，從而抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)PPARs與配體結(jié)合被激活后，繼續(xù)激活輔酶蛋白，然后啟動(dòng)子上游額過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(peroxisome proliferator response element，PPRE)相結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，并介導(dǎo)不同類型的生物學(xué)作用[19]。PPARγ在多種類型的腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)。Dong 等[20]研究表明，PPARγ 在胰腺癌PANC1細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)水平，格列酮類藥物可以在體內(nèi)有效減緩胰腺癌的發(fā)展。另外，有研究表明PPARγ激動(dòng)劑HODE可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[21]。此外，上調(diào)PPARγ表達(dá)可通過(guò)抑制Smad通路介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[22]。PPARγ在肺癌細(xì)胞的侵襲中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，而其發(fā)揮這一效應(yīng)的具體機(jī)制可能是，PPARγ能與JAK-STAT3相互作用組成復(fù)合體，誘導(dǎo)STAT3信號(hào)通路成員STAT3的磷酸化。經(jīng)PPARγ誘導(dǎo)表達(dá)的STAT3可以通過(guò)自分泌的方式，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲[23]。眾多研究表明PPARγ在體內(nèi)扮演一個(gè)抑癌作用的因子，且對(duì)多種類型的腫瘤普遍適用，但是其具體的作用機(jī)制尚未有報(bào)道詳細(xì)闡明，需要進(jìn)一步的探討。

綜上所述，本研究證實(shí)，miR-let-7d這個(gè)具有抑癌活性的microRNA能夠通過(guò)靶向增加在肺癌演進(jìn)中扮演重要抑癌角色的核受體PPARγ的表達(dá)，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。這一研究成果一方面豐富了關(guān)于PPARγ表達(dá)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)；另一方面也揭示了miR-let-7d在以PPARγ為靶點(diǎn)的抗擊肺癌治療中具有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

miR-let-7d regulates lung cancer cell proliferation and invasion abilities through nuclear receptor PPARγ

ZHONG Jia-teng1, GUO Zhi-gang2, SU Wei3

(1DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,2MorphologicalLaboratory,SchoolofBasicMedicalSciences,3DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail:hnswei@163.com)

AIM: To investigate the phenomenon that miR-let-7d regulates the proliferation and invasion abilities of the lung cancer cells through nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptors γ (PPARγ). METHODS: The relation between PPARγ and microRNA was analyzed by bioinformatics. The plasmid reporter assay was used to verify that PPARγ was the target of miR-let-7d. The lung cancer cell line with low expression of PPARγ was selected from different lung cancer cell lines by Western blot. The regulatory role of miR-let-7d in the lung cancer cells was determined by dual luciferase labeling and Western blot. The effect of miR-let-7d on the proliferation ability of lung cancer cells was detected by colony formation assay, the effect of miR-let-7d on the invasive ability of lung cancer cells was detected by Transwell invasion assay. RESULTS: The results of bioinformatic analysis showed that miR-let-7d regulated the expression of PPARγ, and the 3’UTR of PPARγ contained 2 functional miR-let-7d binding sites, indicating that PPARγ is a direct target of miR-let-7d. miR-let-7d was able to directly regulate the expression of PPARγ at mRNA and protein levels. Transfection of miR-let-7d inhibitor promoted the proliferation and invasion abilities of lung cancer cells by increasing the expression of PPARγ. CONCLUSION: miR-let-7d increases the expression of tumor suppressor PPARγ to inhibit the proliferation and invasive abilities of lung cancer cells.

Lung cancer； MicroRNA-let-7d； Peroxisome proliferator-activated receptors γ

1000- 4718(2017)04- 0699- 06

2016- 11- 08

2017- 01- 12

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No. 505079)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No. xyyfy2015BS-006)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.020

△通訊作者 Tel: 0373-3029123； E-mail: hnswei@163.com