MicroRNA-126與胃癌患者放化綜合治療效果的關系及其對胃癌SGC-7901細胞的放射增敏作用

田曉剛， 趙 林， 張春林， 任錦霞， 趙鳳菊， 楊文翠， 茍彩霞

(甘肅省腫瘤醫院放療一病區，甘肅 蘭州 730050)

MicroRNA-126與胃癌患者放化綜合治療效果的關系及其對胃癌SGC-7901細胞的放射增敏作用

田曉剛， 趙 林△， 張春林， 任錦霞， 趙鳳菊， 楊文翠， 茍彩霞

(甘肅省腫瘤醫院放療一病區，甘肅 蘭州 730050)

目的： 研究microRNA-126與胃癌患者放化綜合治療療效的關系及其對胃癌細胞的放射增敏效果。方法: 選取2014年6月～2015年6月間我院收治的晚期胃癌患者60例為研究對象，其中男性32例，女性28例，年齡37～65歲，平均年齡(51±7)歲。所有患者均接受放化綜合治療。收集患者的胃癌病理組織標本，同時于治療結束時采集靜脈血標本。采用國際實體瘤療效評價標準(RECIST)評價患者的近期療效，根據療效將患者分為治療敏感組和非敏感組。實時熒光定量PCR檢測各組患者組織及血漿中microRNA-126的表達變化。體外培養胃癌SGC-7901細胞并轉染microRNA-126 mimic;平板集落形成實驗分析microRNA-126 mimic轉染對SGC-7901細胞放射敏感性的影響;流式細胞術檢測轉染microRNA-126 mimic對SGC-7901細胞凋亡率的影響。結果: 根據RECIST，共28例患者對治療敏感，32例患者對治療不敏感。與敏感組患者相比，不敏感組患者血漿和胃癌組織中的microRNA-126相對水平較低，相對于敏感組的倍數分別為0.72±0.04和0.48±0.03，差異具有統計學意義(P<0.05)。MicroRNA-126 mimic轉染后SGC-7901細胞的SF2值和D0值減小(P<0.05)，增敏比為1.74。流式細胞術分析結果發現，microRNA-126 mimic轉染可以誘導SGC-7901細胞凋亡，并增加射線引起的細胞凋亡。結論: 較低的microRNA-126提示胃癌患者放化綜合治療療效不佳;microRNA-126具有增加胃癌細胞放射敏感性的作用。

胃癌； 放療； 放化綜合治療； MicroRNA-126

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，位居全球惡性腫瘤死亡原因的第2位，為我國惡性腫瘤死亡率的首位，同時伴有較高的發病率[1]。手術切除是治療胃癌的有效方式，但胃癌早期癥狀不典型，加之受醫療條件、經濟條件以及醫療觀念的影響，在我國大部分患者在確診時已經處于中晚期，存在遠處轉移，喪失了手術的最佳時機，即使接受根治性手術，術后的局部復發率依然是臨床亟待解決的問題[2]。近年來，隨著放療技術，特別是三維適形放療技術的發展，放療已經成為重要的胃癌輔助治療手段。對于進展期存在遠處轉移的胃癌患者，放療可以增加局部控制率，降低術后復發率，特別是放療聯合化療的綜合治療，可以有效改善胃癌患者的遠期生存率和生活質量[3-4]。但是胃癌對放療的敏感性終究有限，加之不同個體對放射性的敏感性存在差異，相同劑量下，一些患者可能療效明顯，一些患者可能療效較差。雖然理論上增加放射劑量可以增加療效，但脊髓及腹腔其它重要器官對放射線的耐受有限，因此不能靠單純增加放療劑量來解決問題。這種情況下，放療增敏研究成為臨床研究的熱門課題，越來越多的研究試圖通過藥物和分子生物學手段增加腫瘤細胞對放療的敏感性，以獲得更好的治療效果[5]。

MicroRNA是一類18～21 nt長度的非編碼RNA，具有調控細胞生長和凋亡的作用。大量研究表明，腫瘤的發生發展過程中伴隨著microRNA的水平變化，并影響腫瘤的放療或化療效果[6-7]。前期研究已經證實胃癌患者存在microRNA-126的低表達；microRNA-126表達越低，胃癌的侵襲能力越強，提示microRNA-126可能具有抑制胃癌細胞增殖的作用[8]。因此microRNA-126可能成為胃癌治療的潛在靶點，但是microRNA-126是否與胃癌患者的放療療效有關，是否能夠作為胃癌放療增敏的潛在靶點，還有待研究。因此本研究旨在探討胃癌患者循環microRNA-126及胃癌組織microRNA-126水平與放化綜合治療的關系，并在體外觀察干預microRNA-126水平對胃癌細胞放療敏感性的影響。

材 料 和 方 法

1 研究對象

選取2014年6月～2015年6月間我院收治的經病理證實的晚期胃癌患者60例為研究對象，其中男性32例，女性28例，年齡37～65歲，平均年齡(51±7)歲。分期采用UICC/AJCC標準，其中Ⅲ期42例，Ⅳ期18例。病理類型高分化腺癌28例，低分化腺癌15例，中分化腺癌10例，黏液腺癌7例。所有納入研究的患者病歷資料完整，均沒有接受手術治療，無放化療禁忌癥，卡氏評分70分以上，治療方案為放化綜合治療。所有患者對研究內容知情同意，本研究方案由院醫學倫理委員會批準同意。

2 主要試劑

MicroRNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；TaqMan? MicroRNA反轉錄試劑盒購自Life Technologies；GoTaq? qPCR 試劑盒購自北京普洛麥格生物有限公司；microRNA-16、snRNA內參照序列及microRNA-126 mimic及對照序列購自Qiagen；DMEM培養基及胎牛血清購自Thermo；Annexin V-FITC購自Sigma。

3 主要方法

3.1 放化綜合治療方案 放療采取常規圖像引導放射治療，采用6 MV X射線，放射劑量為50～60 Gy/ 30 f，每周5次。常規實施。化療方案于放療第1天實施，方案為口服替吉奧膠囊60 mg·m-2·d-1，每日2次、早晚餐后口服，連續服藥21 d為1個周期，服用4個周期。

3.2 近期療效評價標準 近期療效評估采用國際實體瘤療效評價標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)。根據病灶測量的結果，將所有患者分為完全緩解(complete remission，CR)：所有目標病灶完全消失，至少維持4周；部分緩解(partial remission，PR)：基線病灶最大徑之和減少30%以上，至少維持4周；病變穩定(stable disease，SD)：基線病灶最大徑之和有所減少但未達PR，或有增加，但未達病變進展(progression of disease，PD)，無新病灶出現，持續4周以上； PD為基線病灶最大徑之和增大20%以上或出現新病灶。

3.3 實時熒光定量PCR檢測microRNA-126的水平 收集患者病理學組織標本，并于治療結束后采集患者靜脈血分離血漿標本。MicroRNA快速提取試劑盒提取組織標本以及血漿標本中的microRNA，提取方法按照廠商說明書進行。使用TaqMan? MicroRNA反轉錄試劑盒將獲取的microRNA反轉為cDNA，反轉錄體系和條件按照說明書提供的方案進行。接著使用GoTaq? qPCR 試劑盒實施熒光定量PCR，反應體系和條件按照說明書提供的方案進行。血漿microRNA檢測數據使用microRNA-16 作為內參照，組織microRNA檢測數據使用U6 SnRNA為內參照。以2-ΔΔCt表示miR-126相對表達水平，ΔCt=Ct目標-Ct內參照。

3.4 胃癌細胞株培養 人胃癌SGC-7901細胞株獲自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基，細胞消化使用0.25%胰酶。培養條件為37 ℃、5% CO2。隨后實驗均取處于對數生長期的細胞進行實驗。

3.5 MicroRNA-126 mimic的轉染 取對數期培養細胞，制備細胞懸液，以每孔1×105個細胞的密度接種于6孔板，當細胞匯合度達到75%左右時，使用LipofectamineTM2000轉染試劑盒將microRNA-126 mimic轉入細胞，microRNA-126 mimic的工作濃度為50 nmol/L，相同方法轉染無關microRNA陰性對照(microRNA negative control，microRNA NC)作為陰性對照。繼續培養48 h，RT-qPCR驗證轉染效果。

3.6 平板集落形成實驗 取對數期培養細胞，分為3組：未經任何轉染的SGC-7901細胞、轉染micro-RNA-126 mimic的SGC-7901細胞以及轉染micro-RNA NC的SGC-7901細胞。3組細胞分別暴露于0、1、2、4、6和8 Gy劑量，隨后接種于培養皿中，各組細胞的接種數取決于照射劑量，0、1、2、4、6和8 Gy劑量對應的接種數分別為200、200、500、2 000、5 000和20 000個。每組各劑量設置3個平行對照。繼續培養14 d，每4 d換液 1次。培養時間達到后，棄去培養皿中的培養液，PBS清洗后，使用100%甲醇固定30 min，吉姆薩染色后進行細胞集落計數。計算集落形成率(D0)和細胞存活分數(survival fraction，SF)。D0=0 Gy培養皿中的集落數/0 Gy培養皿中的細胞接種數×100%。SF=某劑量照射后的培養皿內的集落數/(該劑量的接種數×D0)。根據多靶單擊模型擬合存活曲線，計算各組D0、SF2(2 Gy劑量對應的SF)以及放射增敏比(sensitizer enhancement ratio，SER)。SER=未經轉染組的D0/轉染組D0。

3.7 流式細胞術分析microRNA-126對細胞凋亡的影響 取對數期SGC-7901細胞，分為6組：無轉染且未經射線處理的SGC-7901細胞；轉染microRNA-126 mimic但不經射線處理的SGC-7901細胞；轉染microRNA NC但不經射線處理的SGC-7901細胞；無轉染但有4 Gy射線處理的SGC-7901細胞；轉染microRNA-126 mimic且經4 Gy射線處理的SGC-7901細胞；轉染microRNA NC且經射線處理的SGC-7901細胞。培養48 h后收集細胞。重懸浮細胞后，采用Annexin V-FITC試劑盒檢測各組細胞的凋亡率：依次加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，混勻后室溫避光孵育15 min上機檢測。

4 統計學處理

統計學分析采用SPSS 17.0軟件，正態分布數據以均數±標準差(mean±SD)表示,正態分布數據兩組間的差異使用t檢驗分析，多組間的比較采用單因素方差分析。非正態分布數據之間的差異采用Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 臨床預后情況

根據RECIST，共有10例患者被評估CR，18例患者被評估為PR，20例患者為SD，其余12例為PD，定義CR+PR患者為對治療敏感的患者(敏感組，n=28)，定義SD+PD的患者為非敏感患者(非敏感組，n=32)。2組間的一般臨床資料如年齡、性別、病理類型及分期的差異均無統計學意義。

2 MicroRNA-126的表達水平與患者預后有關

如圖1所示，對放化綜合治療療效不敏感的患者血漿microRNA-126的表達水平較低，相對于敏感組的(72±4)%，差異具有統計學意義(P<0.05)。同時，對放化綜合治療療效不敏感的患者胃癌組織的microRNA-126的表達水平也較低，相對于敏感組的(48±3)%，差異具有統計學意義(P<0.05)。上述結果提示較低的microRNA-126水平意味著對放化綜合治療不敏感。

3 MicroRNA-126 mimic轉染對SGC-7901細胞放射敏感性的影響

如圖2所示，轉染microRNA-126 mimic后，SGC-7901細胞內的microRNA-126水平顯著上調，與未經轉染的細胞和轉染陰性對照的細胞相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。轉染microRNA NC不會改變SGC-7901細胞的miroRNA-126。未轉染的SGC-7901細胞，轉染microRNA-126 mimic的SGC-7901細胞以及轉染microRNA NC的SGC-7901細胞再經過射線照射并培養后的相關參數見表1。相比未經任何轉染的細胞、轉染microRNA-126后，細胞經過射線照射后的SF2值減小(P<0.05)，D0值減小(P<0.05)。經過計算后SER為1.74，提示microRNA-126 mimic轉染具有放射增敏作用。但是數據顯示，轉染microRNA NC并不影響SGC-7901細胞的放射敏感性。各組細胞經不同劑量照射后的生存曲線見圖3，轉染microRNA-126 mimic組細胞的存活情況與未經轉染細胞及轉染microRNA NC的細胞相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。

Figure 1.MicroRNA-126 exression in gastric carcinoma tissue (A) and plasma (B) from patients. Mean±SD.*P<0.05vssensitive group.

圖1 2組患者胃癌組織和血漿microRNA-126表達水平的比較

Figure 2.MicroRNA-126 level changes after microRNA-126 mimic transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnon-transfection group.

圖2 轉染microRNA-126 mimic后SGC-7901細胞細胞內microRNA-126水平的變化

表1 各組細胞的放射生物學參數

Table 1.Radiation parameters in each group (Mean±SD.n=3)

GroupSF2D0SERNon-transfection0.75±0.014.09±0.21MicroRNA-126mimic0.51±0.05*2.34±0.19*1.74±0.09*MicroRNANC0.70±0.044.15±0.211.01±0.08

*P<0.05vsother groups.

Figure 3.Survival curves after radiation in each group.

圖3 各組細胞不同劑量照射后的生存曲線

4 MicroRNA-126 mimic轉染可以增加SGC-7901的凋亡率

如圖4所示，microRNA-126 mimic組與untransfection組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。4Gy處理的microRNA-126 mimic組細胞凋亡率較未照射組升高，同時也較4Gy照射而未轉染組高，差異具有統計學意義(P<0.05)。該結果提示microRNA-126 mimic可能通過誘導細胞凋亡的作用而發揮放射增敏作用。

討 論

胃癌已經成為威脅人類生命健康的重要惡性腫瘤。手術、放療和化療是胃癌治療的傳統方法，這3種方案的綜合應用的臨床效果已經得到了肯定。既往認為胃癌對放療不敏感，因此放療在很長一段時間都作為胃癌的姑息治療手段。隨著三維適形放療等技術以及放療設備的改善，以及根除術后輔助放療效果的證實，胃癌的放療逐漸受到重視，地位受到確定。術后輔助放療的效果明確，患者可以通過術后放化聯合治療在無病生存和總生存率方面持續受益[9-10]。盡管如此，胃癌放療的效果仍然不是很理想。因為對于大多數腫瘤來說，都對放療存在一定的耐受和抵抗，如果加大放療劑量，又會造成周圍重要組織的損傷。因此，在放療過程中，需要利用各種手段降低腫瘤細胞對射線的抵抗性和耐受性，增加其敏感性，比如輻射增敏劑的應用。目前，關于胃癌的放療增敏藥物，研究較多的是丙戊酸鈉。研究認為丙戊酸鈉聯合放療可誘導SGC-7901細胞細胞周期阻滯和細胞凋亡,增加SGC-7901細胞對放療的敏感性。另外報道的一些藥物還有甲基蓮心堿、特異性環氧合酶抑制劑以及魚藤素等。這些藥物放療增敏的機制不盡相同，但總結起來，實現放療增敏的機制主要如下：(1)減弱腫瘤細胞受到輻射損傷后的修復能力，如抑制DNA修復能力，或抑制亞致死性損傷修復的能力[11]；(2)增加射線對腫瘤的原發性損傷[12]；(3)周期調節作用。該機制的較為復雜，研究也較為熱門。對細胞周期的調節主要體現在，放療增敏將細胞周期阻滯在對射線最敏感的階段，如G1期向S期過渡的階段及M期；也可通過作用于細胞周期檢查點來解除周期阻滯，讓DNA受損的細胞在修復完成前就進入下一周期，從而導致細胞死亡[11]；(4)通過凋亡調控因子引起腫瘤細胞凋亡；(5)影響一些信號通路，比如Ras/MEK/ERK通路及PI3K/AKT/mTOR通路等[13]。以上述機制為基礎，不難推測，任何具有調控細胞周期、細胞凋亡和信號通路作用的藥物和分子均有可能運用于放療增敏。

Figure 4.Apoptosis rate in each group detected by flow cytometry. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsnon-transfection or microRNA NC group;#P<0.05vsmicroRNA-126 mimic.

圖4 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

MicroRNA為短鏈非編碼RNA，通過與靶基因特定區域的結合，可以降解靶基因，從而使靶基因的表達降低，實現轉錄后調控作用。因此某一microRNA分子可能通過若干靶基因形成復雜的調控網絡，從而影響細胞生長的調節。特別是在腫瘤中，大量研究已經證實microRNA可以調控腫瘤細胞的生長、周期以及凋亡，因此可用于腫瘤的診斷、評估和治療[14-15]。MicroRNA對細胞周期、凋亡調控的特性，也決定microRNA必然具有在放療增敏中發揮作用的潛力。本研究中，我們發現對放化綜合治療不敏感的患者存在microRNA-126的低表達，進一步通過細胞實驗，我們得以證實，microRNA-126確實與腫瘤細胞的放療敏感性有關，microRNA-126具有放療增敏作用。之前的一些研究也證實了microRNA在腫瘤中的放療增敏機制，如陳鑫等[16]發現microRNA-21可能引起食管癌細胞對放療的抵抗，抑制microRNA-21可能具有放療增敏的效果。至于microRNA發揮放療增敏的具體機制如何，目前尚不完全清楚。如上所述，microRNA形成的調控網絡是復雜的，因此目前關于microRNA放療增敏機制的研究闡明的都是局部機制。有研究證明抑制microRNA-211可以實現結直腸癌細胞的放療增敏，因為microRNA-211可能降低抑癌基因[17]的表達，而抑制microRNA-211后，PTEN的水平恢復，從而促進了放療時的細胞凋亡。本研究未能闡明microRNA-126發揮放療增敏的機制是通過何種靶基因，這有待于在后期研究中去探討。

總之，我們認為microRNA-126水平與胃癌患者的放療效果有關，可以作為增加胃癌放療敏感性的潛在靶點。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Relationship between microRNA-126 and curative effect of chemoradiotherapy in patients with gastric cancer， and enhancement effect of microRNA-126 on radiosensitivity of SGC-7901 cells

TIAN Xiao-gang, ZHAO Lin, ZHANG Chun-lin, REN Jin-xia, ZHAO Feng-ju, YANG Wen-cui, GOU Cai-xia

(TheFirstWardofDepartmentofRadiotherapy,GansuProvincialCancerHospital,Lanzhou730050,China.E-mail:liuybres@126.com)

AIM: To investigate the influences of microRNA-126 on the curative effect of chemoradiotherapy and radiosensitivity of SGC-7901 cells. METHODS: The patients of gastric cancer (n=60) were selected in this study including 32 males and 28 females with the average age of (51±7) years. All patients received similar chemoradiotherapy strategy. The tissue and blood samples were collected during treatment. The short-term curative effect was evaluated by the Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST), and the patients were divided into sensitive group and insensitive group. The microRNA-126 levels were detected by RT-qPCR. The SGC-7901 cells were maintainedinvitroand transfected with microRNA-126 mimic. The plate colony formation assay was used to determine the enhancement effect of microRNA-126 on radiosensitivity of the SGC-7901 cells. The apoptotic rate of the SGC-7901 cells induced by microRNA-126 was analyzed by flow cytometry. RESULTS: According to the RECIST, 28 cases were defined as sensitive patients and 32 cases were the insensitive patients. Compared with the sensitive patients, the microRNA-126 levels both in blood and tissue samples were lowered in the insensitive patients, and the relative fold changes were 0.72±0.04 and 0.48±0.03, respectively (P<0.05). After transfection with microRNA-126 minic, the SF2and D0in the SGC-7901 cells were decreased with the SER of 1.74. Furthermore, microRNA-126 induced apoptosis of SGC-7901 cells and enhanced their radiosensitivity. CONCLUSION: The patients with low microRNA-126 level may suffer a poor curative effect of chemoradiotherapy on the gastric cancer. MicroRNA-126 has an enhancement effect on the radiosensitivity to the SGC-7901 cells.

Gastric cancer; Radiotherapy; Chemoradiotherapy; MicroRNA-126

1000- 4718(2017)04- 0705- 06

2016- 12- 07

2017- 02- 13

R363; R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.021

△通訊作者 Tel： 13838287197； E-mail: liuybres@126.com