腎上腺髓質素對高肺血流大鼠肺組織氧化應激的調節作用*

劉麗平， 龐璐璐， 齊建光△， 高 揚， 白 薇， 金紅芳， 杜軍保

(1北京大學第一醫院兒科， 北京 100034； 2山西省兒童醫院呼吸科， 山西 太原 030013)

腎上腺髓質素對高肺血流大鼠肺組織氧化應激的調節作用*

劉麗平1, 2， 龐璐璐1， 齊建光1△， 高 揚1， 白 薇1， 金紅芳1， 杜軍保1

(1北京大學第一醫院兒科， 北京 100034；2山西省兒童醫院呼吸科， 山西 太原 030013)

目的： 研究腎上腺髓質素(ADM)對高肺血流性肺動脈高壓大鼠肺組織氧化應激的調節作用及其機制。方法: 健康雄性SD大鼠隨機分為對照組、分流組和分流+ADM組。對后2組大鼠行腹主動脈-下腔靜脈分流術。8周后，對分流+ADM組大鼠皮下埋微量滲透泵持續予ADM 1.5 μg·kg-1·h-1。繼續飼養2周后，右心導管法測定平均肺動脈壓(mPAP)和右心室/(左心室+室間隔)重量比值，檢測肺中、小肌型動脈相對中膜厚度(RMT)，比色法測定肺組織勻漿丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，Western blot法檢測肺組織還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶4(NOX4)的表達。結果: 與對照組相比，分流組大鼠的mPAP、右心室肥厚程度以及肺中、小肌型動脈RMT均明顯增加，肺組織MDA 含量明顯升高，T-AOC、SOD活性和GSH-Px活性均明顯降低，肺組織NOX4表達明顯升高。ADM使肺動脈壓力明顯回降，右心室肥厚程度減輕，肺血管結構改變緩解，肺組織MDA 含量明顯下降，T-AOC、SOD活性和GSH-Px活性明顯升高，肺組織NOX4表達明顯降低。結論: ADM能夠抑制大鼠高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構形成中的氧化應激反應，作用機制可能與其下調肺組織NOX4表達以及增強抗氧化活性有關。

肺動脈高壓； 高肺血流； 氧化應激； 腎上腺髓質素

氧化應激是指機體內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產生過多和(或)機體抗氧化能力減弱，ROS清除不足，導致ROS在體內聚集增多并引起細胞氧化損傷的病理過程。肺組織微陣列基因表達分析結果表明在原發性和繼發性肺動脈高壓患者存在氧化應激狀態[1-2]，在低氧、野百合堿誘導、高肺血流等多種肺動脈高壓動物模型中均有ROS產生增多[3-5]，抗氧化治療可抑制肺動脈高壓和肺血管結構重構的形成[6]，提示氧化應激參與了肺動脈高壓的發生和肺血管重構的發生。腎上腺髓質素(adrenomedullin，ADM)是一種心血管保護活性多肽，參與了肺動脈高壓的發生發展[7-9]。我們既往的研究顯示，ADM能夠緩解高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構的形成[10]。既往有研究顯示ADM對心血管系統氧化應激具有重要的調節作用[11-12]。然而，氧化應激是否參與了ADM對高肺血流性肺動脈高壓的調節機制目前尚不清楚。本研究對大鼠行腹主動脈-下腔靜脈分流術制備高肺血流性肺動脈高壓的大鼠模型，通過觀察長期應用ADM對高肺血流大鼠血流動力學、肺形態學和肺組織氧化應激的調節作用，探索ADM對高肺血流性肺動脈高壓大鼠肺組織氧化應激的調節作用。

材 料 和 方 法

1 動物和主要材料

健康雄性SD大鼠22只，體重(160±10) g，清潔級，購自軍事醫學科學院(清潔級, 合格證號為SCXK-2007-004)。微量滲透泵2002型購自ALZE。ADM購自Phoenix。

2 方法

2.1 動物模型及給藥方法 將22只大鼠隨機分為 對照組(n=7)、分流組(n=8)及分流+ADM組(n=7)。分流組和分流+ADM 組大鼠行腹主動脈-下腔靜脈分流術[13]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3～4 mL/kg麻醉后，取仰臥位固定于手術臺上。腹部正中切口，沿腹主動脈左側壁分開后腹膜，顯露腹主動脈及下腔靜脈，用小哈巴狗鉗于左腎動脈起始部下方將腹主動脈夾閉。以腹主動脈的左腎動脈起始部至其末端段的下2/3處之左側壁為穿刺點，用12號一次性針頭以45°角穿透腹主動脈壁進入相鄰的下腔靜脈內，撤出針頭，再用9-0線縫合腹主動脈壁的穿刺口。之后移開小哈巴狗鉗，若觀察到下腔靜脈顏色由暗變紅，血流有波動，證實分流手術成功。用4號絲線分別連續縫合腹膜、肌層和皮膚。對照組僅開腹暴露腹主動脈及下腔靜脈，不做分流術。大鼠飼養8周后，對分流+ADM組大鼠，于背部皮下做一長約1 cm切口，埋置微量滲透泵，持續皮下給藥2周，劑量為1.5 μg·kg-1·h-1。各組大鼠飼養條件相同。

2.2 血流動力學指標測定 實驗10周后(第70天)以右心導管法測定肺動脈壓力[14]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3～4 mL/kg麻醉。分離大鼠右側頸外靜脈，將聚乙烯導管一端插入右側頸外靜脈，經上腔靜脈、右心房、右心室進入肺動脈，另一端經壓力傳感器與多導生理記錄儀(成都泰盟科技有限公司)相連，描記肺動脈壓力曲線，記錄平均肺動脈壓(mean pulmonary artery hypertension，mPAP)。游離大鼠心臟后，剪去左、右心房及脂肪血管等組織，將右心室(right ventricle，RV)和左心室(left ventricle，LV)+室間隔(interventricular septum，SP)剝離，吸干水分稱重，計算RV/(LV+SP)比值，為右心室肥厚指標。

2.3 肺血管顯微形態學指標的觀察 大鼠開胸取相同部位肺葉固定于4%甲醛緩沖液，乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，切片。以醛復紅染色彈力纖維。肌型動脈在光鏡下具有完整的內外2層彈力層。應用CMIAS 圖像處理與分析系統(Leica)計算肺中、小肌型動脈的相對中膜厚度(relative medial thickness，RMT)，每只大鼠測量6～10個肺中型(外徑50～150 μm)和小型(15～50 μm)肌型動脈的RMT，然后求其均值作為該大鼠的RMT值。

2.4 肺組織氧化應激指標的測定 采用南京建成比色法試劑盒測定大鼠肺組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、總抗氧化能力(total antioxidative capacity，T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及谷胱甘肽過氧化物酶(gluta-thione peroxidase，GSH-Px)的活性，操作嚴格按說明書進行。

2.5 Western blot方法測定肺組織細胞膜NOX4含量 應用碧云天細胞膜細胞漿分離提取試劑盒，提取大鼠肺組織細胞膜蛋白。以120 μg上樣，進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，濕轉法將蛋白質從SDS-PAGE凝膠中轉移至NC膜，在含5%脫脂奶粉的TBST中封閉1 h，加入I抗(NOX4，1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，加入II抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，1∶10 000稀釋)1 h，TBST漂洗，ECL發光反應，X線膠片曝光后觀察結果，用凝膠成像系統(Alpha Innotech)對曝光后條帶的灰度值進行分析，并用細胞膜Na+-K+-ATP酶作為內參照。

3 統計學處理

結果用均數±標準差(mean±SD)表示。應用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。多組間均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠血流動力學指標的變化

分流組大鼠mPAP和RV/(LV+SP)較對照組均明顯升高(P<0.01)。分流+ADM組大鼠mPAP和RV/(LV+SP)較分流組均明顯降低(P<0.05),見表1。

2 大鼠肺血管顯微形態學指標的變化

分流組大鼠中、小型肺肌型動脈RMT較對照組明顯升高(P<0.01)。分流+ADM組大鼠中、小型肺肌型動脈RMT較分流組明顯降低(P<0.01)，見圖1、表1。

Figure 1.Microphotograph of the rat pulmonary artery (aldehyde fuchsin staining, ×200). The media of pulmonary artery was thicker in rats of shunt group than that of control group. ADM decreased the medial thickness of pulmonary artery in shunt rats.

圖1 大鼠肺動脈顯微結構

表1 大鼠血流動力學及肺組織形態學指標

Table 1.Haemodynamic index and pulmonary vascular micro-structure in rats (Mean±SD)

GroupnmPAP(mmHg)RV/(LV+RV) Relativemedialthickness(%)MedianPASmallPAControl714.7±2.50.22±0.035.1±1.07.6±1.4Shunt824.7±4.0**0.32±0.05**8.6±1.4**13.0±1.9**Shunt+ADM716.0±2.4##0.27±0.03#7.1±0.8#10.4±2.2#

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsshunt group.

3 大鼠肺組織氧化應激指標的變化

分流組大鼠肺組織MDA含量較對照組明顯升高(P<0.01)，分流+ADM組大鼠肺組織MDA含量較分流組明顯降低(P<0.05)，見表2。

分流組大鼠肺組織T-AOC、SOD活性和GSH-Px活性較對照組明顯降低(P<0.05)。ADM使分流大鼠上述指標明顯升高(P<0.05)，見表2。

4 肺組織胞膜NOX4表達變化

分流組大鼠肺組織胞膜NOX4表達較對照組明顯升高。ADM使NOX4表達明顯降低，見圖2。

表2 大鼠肺組織氧化應激指標

Table 2.Oxidative stress index in the rat lung tissues (Mean±SD)

GroupnMDA(μmol/L)T-AOC(U/mg)SODactivity(U/mg)GSH-Pxactivity(U/mg)Control73.75±1.091.50±0.3838.6±8.330.0±6.1Shunt86.47±1.91**1.01±0.37*26.6±6.3**20.9±6.6**Shunt+ADM74.75±1.22#1.40±0.27#36.0±5.3#28.4±4.6#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsshunt group.

討 論

ADM是1993年發現的一種小分子血管活性肽，具有擴張血管降低血壓、抑制血管平滑肌細胞遷移和增殖、排鉀、利尿及對抗腎素血管緊張素系統等多種生物學作用。ADM及其受體系統在肺內廣泛分布，參與了肺血管功能的調節。我們以及國內外多項研究表明，ADM及其受體的變化參與了肺動脈高壓和肺血管結構重構的發生[7-9]。新近本課題組[10]通過皮下埋置微量滲透泵的方法，對腹主動脈-下腔靜脈分流所致高肺血流大鼠給予外源性ADM，結果發現長期應用外源性ADM能夠抑制高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構。以上研究均提示ADM 及其受體系統可能參與了對高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構的調節。但是ADM調節高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構的機制尚未完全清楚。

Figure 2.Membrane NOX4 expression in the rat lung tissues determined by Western blot. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsshunt group.

圖2 Western blot檢測大鼠肺組織細胞膜NOX4的表達

多項研究表明氧化應激參與了肺動脈高壓的發病機制，ROS增多和抗氧化能力下降在肺動脈高壓和肺血管結構重構的發生發展中起了重要作用[1-6]。Bowers等[1]報道在特發性肺動脈高壓患者病變的肺血管部位DNA氧化損傷標志物(8-羥基鳥苷)表達增多，同時肺組織SOD表達和活性下降，提示在肺動脈高壓患者存在肺血管氧化損傷。動物實驗顯示抗氧化治療則可緩解低氧小鼠肺動脈高壓和肺血管結構重構的發生，提示氧化應激參與了肺動脈高壓的發生[6]。我們的研究顯示，大鼠腹主動脈-下腔靜脈分流術后8周，在肺動脈高壓和肺血管結構重構的同時，肺組織中自由基導致脂質過氧化的終產物MDA含量也明顯升高，提示氧化應激也參與了高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構的形成。

有研究表明ADM對心血管系統氧化應激具有重要的調節作用。在醛固酮依賴的惡性高血壓大鼠，ADM可通過抑制NADPH通路，緩解心臟氧化應激，減少左心室膠原蛋白沉積[11]。Liu等[12]利用離體培養的大鼠主動脈平滑肌細胞，觀察到ADM可呈劑量依賴性地減少Ang-Ⅱ誘導的主動脈平滑肌細胞ROS產生增多，提示ADM可抑制血管壁氧化應激的產生。本實驗結果發現，通過皮下埋放微量滲透泵的方法持續給予分流大鼠ADM，在使肺動脈壓力明顯降低和肺血管結構改變明顯緩解的同時，肺組織MDA含量也明顯降低，提示ADM干預高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構的作用可能與抑制肺內氧化應激的產生有關。

血管壁內ROS主要由NADPH氧化酶途徑產生。研究顯示，肺動脈高壓時NAPDH氧化酶活性和含量升高[5，15]，ROS產生增多。ROS通過損傷內皮細胞、促進肺動脈平滑肌增殖和肺血管外膠原沉積導致肺血管結構重構。NOX4是NADPH氧化酶細胞膜亞基的重要組成部分，在血管壁內皮細胞，平滑肌細胞和外膜成纖維細胞中均有表達，尤其中層平滑肌細胞中表達最顯著[16-17]。有研究表明，在肺動脈高壓的動物模型中，NOX4表達增多，刺激ROS的產生，導致ecSOD的失活，并通過激活NF-κB和上調cyclin D1的表達導致血管重構[18]。應用NOX4抑制劑GKT137831和減輕低氧誘導的肺血管壁細胞增殖[19]。ADM抑制高肺血流性肺動脈高壓大鼠氧化應激的作用機制是否與其對ROS產生的影響有關，我們對此進行了研究，結果發現高肺血流性肺動脈高壓組大鼠肺組織NOX4表達上調，而ADM使高肺血流大鼠肺組織NOX4表達下調，提示ADM可能通過抑制肺組織NOX4表達、抑制NADPH氧化酶，進一步抑制大鼠ROS產生、抑制肺組織氧化應激，從而緩解高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構。

正常機體內存在SOD、GSH-Px等酶促抗氧化系統和維生素E等非酶促抗氧化系統來維持機體ROS產生和消除的平衡。SOD等可通過酶促反應將ROS還原成O2和水，從而緩解氧化應激狀態。GSH則可在GSH-Px作用下將脂質過氧化物和H2O2還原成脂醇和水，同時生成GSSG。因此SOD、GSH-Px活性，以及GSH/GSSG比值常被作為評估機體抗氧化能力的指標。研究表明應用SOD類似物或肺組織SOD過表達可減輕低氧誘導的肺血管結構重構[6，20]。在本實驗中，我們觀察到高肺血流性肺動脈高壓大鼠肺組織T-AOC降低，SOD和GSH-Px活性下調，ADM則使上述改變緩解，提示ADM可能通過激活SOD、GSH-Px等酶促抗氧化系統，促進ROS的消除，進一步抑制大鼠肺組織氧化應激，從而緩解高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構。

總之，ADM可能通過減少高肺血流大鼠ROS產生，增強抗氧化能力，進一步減輕肺組織氧化應激損傷，從而緩解高肺血流性肺動脈高壓和肺血管結構重構。這為臨床肺動脈高壓的防治提供了一條新的思路。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Regulatory effect of adrenomedulin on pulmonary tissue oxidative stress in rats with pulmonary hypertension induced by high pulmonary blood flow

LIU Li-ping1, 2, PANG Lu-lu1, QI Jian-guang1, GAO Yang1, BAI Wei1, JIN Hong-fang1, DU Jun-bao1

(1DepartmentofPediatrics,FirstHospitalofPekingUniversity,Beijing100034,China;2DepartmentofPulmonology,ChildrenHospitalofShanxi,Taiyuan030013,China.E-mail:qjg2006@126.com)

AIM: To explore the regulatory effect of adrenomedullin (ADM) on pulmonary oxidative stress in the rats with pulmonary hypertension induced by high blood flow. METHODS: Healthy male SD rats (n=22) were randomly divided into control group, shunt group and shunt with ADM group. Abdominal aorta and inferior vena cava shunting was produced in the rats in shunt group and shunt with ADM group. After 8 weeks, ADM (1.5 μg·kg-1·h-1) was administered into the rats in shunt with ADM group subcutaneously by mini-osmotic pump for 2 weeks. Mean pulmonary artery pressure (mPAP) was evaluated by a right cardiac catheterization procedure. The ratio of right ventricular mass to left ventricular plus interventricular septal mass [RV/(LV+SP)] and relative medial thickness (RMT) in pulmonary muscularized arteries were calculated. The content of malonaldehyde (MDA), total antioxidative capacity (T-AOC), and activity of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in lung tissues were detected by colorimetry. The expression of NADPH oxidase 4 (NOX4) in the lung tissue was analyzed by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the mPAP, RV/(LV+SP) and RMT in pulmonary muscularized arteries in shunt group were all significantly increased. The content of MDA and the expression of NOX4 in the lung tissues were significantly increased. The T-AOC, and activity of SOD and GSH-Px in the lung tissues were significantly decreased. However, mPAP, RV/(LV+SP) and RMT in pulmonary muscularized arteries in shunt with ADM group were significantly decreased as compared with shunt group. Meanwhile, ADM decreased the content of MDA and the expression of NOX4 in the lung tissues, but increased the T-AOC, and activity of SOD and GSH-Px in the lung tissue of shunt rats. CONCLUSION: ADM inhibits oxidative stress response in the development of pulmonary hypertension and pulmonary vascular structural remodeling induced by high pulmonary blood flow in the rats by down-regulating the NOX4 expression and strengthening the anti-oxidation response.

Pulmonary hypertension; High pulmonary blood flow; Oxidase stress; Adrenomedullin

1000- 4718(2017)04- 0735- 05

2016- 07- 18

2017- 01- 16

國家自然科學基金資助項目(No. 30973226)

R393

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.026

△通訊作者 Tel: 010-83573238; E-mail: qjg2006@126.com