壓力超負荷大鼠心肌膠原代謝的動態變化*

呂仕超， 張軍平△， 李 萌， 吳美芳， 王 強， 王曉景， 徐 玲

(天津中醫藥大學 1第一附屬醫院老年病科， 2研究生院，天津 300193)

壓力超負荷大鼠心肌膠原代謝的動態變化*

呂仕超1， 張軍平1△， 李 萌2， 吳美芳2， 王 強2， 王曉景2， 徐 玲2

(天津中醫藥大學1第一附屬醫院老年病科，2研究生院，天津 300193)

目的： 探討壓力超負荷大鼠心肌膠原代謝的動態變化。方法: 采用腹主動脈縮窄法制備壓力超負荷大鼠模型，并以假手術組為對照，分別于術后第3周、4周、8周和12周取材，稱量大鼠體質量、心臟質量和左心室質量，計算心臟質量指數(heart mass index，HMI)和左心室質量指數(left ventricle mass index，LVMI)；心肌組織Masson染色觀察心肌膠原纖維沉積情況；樣本堿水解法檢測心肌組織羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量；ELISA法檢測血清Ⅰ型前膠原羧基端肽(procollagen typeⅠcarboxy-terminal peptide，PⅠCP)、Ⅲ型前膠原氨基端肽(procollagen typeⅢ amino-terminal peptide，PⅢNT)和Ⅰ型膠原C端肽(collagen C telopeptide typeⅠ，CTX-Ⅰ)水平。結果: 與假手術組相比，模型組大鼠心肌血管周圍及間質可見膠原纖維沉積，心肌膠原容積分數明顯增高(P<0.01)，且隨時間延長膠原沉積明顯增多；模型組大鼠HMI、LVMI和HYP均明顯增加(P<0.05)，且隨時間延長大鼠HYP有升高的趨勢；模型組大鼠血清PⅠCP濃度顯著升高，在第4、8和12周時差異有統計學意義(P<0.05)；模型組大鼠血清PⅢNP濃度顯著升高，CTX-Ⅰ濃度顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。結論: 壓力超負荷狀態下，心肌膠原代謝紊亂，且隨時間的延長心肌呈不同程度的纖維化表現。

腹主動脈縮窄； 壓力超負荷； 心肌膠原； 心肌纖維化

高血壓病是臨床最常見的慢性非傳染性疾病，其發病率、致殘率和死亡率居高不下，雖然高血壓的知曉率、治療率和控制率呈上升趨勢，但依舊處于較低水平[1]。我國高血壓病患者約2.7億，經常伴隨著心、腦、腎、血管、眼底等靶器官損傷，其中高血壓左室肥厚的患病率為20%～30%[2]。高血壓左室肥厚是心力衰竭、心律失常、心源性猝死等心血管事件的獨立危險因素，其核心病理改變是心肌纖維化。長期的壓力超負荷導致心肌膠原纖維過量沉積，膠原濃度顯著增加，各型膠原比例失調及排列紊亂，引起心臟功能和結構的改變，從而使得心血管事件的發生率增高。因此，預防/逆轉高血壓左室肥厚已成為心血管疾病領域研究的熱點問題之一。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

雄性Wistar大鼠，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號為SCXK(軍)2012-0004，SPF級，體重180～200 g。

2 主要試劑

戊巴比妥鈉和Masson三色染色液購自天津百浩生物科技有限公司；羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)測試盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠Ⅰ型前膠原羧基端肽(procollagen typeⅠcarboxy-terminal peptide，PⅠCP)酶聯免疫試劑盒、大鼠Ⅲ型前膠原氨基端肽(procollagen typeⅢamino-terminal peptide，PⅢNP)酶聯免疫試劑盒和大鼠Ⅰ型膠原C端肽(collagen C telopeptide typeⅠ，CTX-Ⅰ)酶聯免疫試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

3 方法

3.1 壓力超負荷大鼠模型的建立 采用腹主動脈縮窄法制備壓力超負荷大鼠模型[3]。Wistar大鼠適應性飼養3～5 d，術前12 h禁食，自由飲水。稱重后給予3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)，行腹腔內注射麻醉。大鼠角膜反射消失、肌力下降后，固定于手術臺，腹部正中3 cm×5 cm大小面積處剃毛備皮，并以碘伏消毒。在左肋弓下緣0.5 cm、腹部正中線左側0.5 cm處行2.0～2.5 cm縱切口，分層打開腹腔。用生理鹽水紗布將腸管推向腹腔右側，同時將胃體、脾臟向上輕推隔離，充分暴露腹主動脈段。在右腎動脈分支上0.5 cm處游離腹主動脈，平行放置7號針頭(直徑0.7 mm)，用4號手術縫線(直徑約0.3 mm)將腹主動脈和7號針頭一并結扎后，抽去針頭。將臟器復位，腹腔內滴入2×105U青霉素，逐層縫合腹肌和皮膚，術后連續3 d每天肌注青霉素2×105U抗感染。假手術組開腹后只掛線，不結扎，其它程序均與手術組相同。

3.2 標本采集與處理 分別于手術后第3周、4周、8周、12周按組取材。取材前再一次稱量大鼠體質量(body mass，BM)，用3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)行腹腔注射麻醉，麻醉后迅速從腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，收集血清，分裝。取血后，迅速開胸摘取心臟，于4 ℃生理鹽水中洗去血液，濾紙吸干，除去心臟周圍組織和大血管，稱取心臟質量(heart mass，HM)，計算心臟質量指數(heart mass index，HMI)：HMI =HM/BM。再剪去左右心房，右心室游離壁，保留左心室及室間隔，稱取左心室質量(left ventricle mass，LVM)，計算左心室質量指數(left ventricle mass index，LVMI)：LVMI= LVM/BM。最后將分離出來的部分心肌組織置于4%中性甲醛緩沖溶液中固定，把其余的組織標本迅速置于液氮中凍存備用。

3.3 心肌組織的Masson染色 將心肌組織在4%中性甲醛緩沖溶液中固定后，經過梯度乙醇脫水、透明、浸蠟和包埋等步驟，制成石蠟塊，進行連續冠狀切片，厚度5 μm。切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染核，1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗返藍，Masson復合染色液染色，1%磷鉬酸處理，苯胺藍染色液復染，1%冰醋酸水處理，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察結果。Masson染色后心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件，每張切片隨機選取5個視野測膠原面積，取其平均值作為該心肌組織膠原容積分數(collagen volume fraction, CVF)，CVF=心肌膠原纖維面積/圖像總面積。

3.4 心肌HYP測定 精確稱取30～100 mg液氮凍存的心肌組織，采用堿水解法測定HYP含量。以蒸餾水為空白管，以5 mg/L標準應用液為標準管，在550 nm處用比色法檢測每例樣本吸光度，按下式計算HYP含量：羥脯氨酸含量(mg/g)=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)×標準管含量(5 mg/L)×水解液總體積(10 mL)/組織濕重(mg)。

3.5 血清膠原代謝產物水平測定 以酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定血清PⅠCP、PⅢNP和CTX-Ⅰ水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明進行操作。

4 統計學處理

采用SPSS 11.5統計軟件，數據以均值±標準差(mean±SD)表示，統計方法采用兩獨立樣本t檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 心臟及左心室質量指數的變化

與假手術組相比，模型組大鼠HMI和LVMI均明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The changes of HMI and LVMI in rats. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vssham.

圖1 大鼠HMI和LVMI變化

2 心肌組織的病理變化

假手術組大鼠心肌血管周圍有少量的膠原纖維存在，間質無明顯膠原纖維；腹主動脈縮窄術后第3周，模型組大鼠心肌血管周圍及間質可見膠原纖維沉積，心肌膠原容積分數高于假手術組(P<0.01)；第4周時心肌膠原纖維明顯增多，心肌組織內可見被染成藍色的纖維，心肌間質有較多膠原沉積，心肌膠原容積分數明顯高于假手術組(P<0.01)；第8和12周時心肌血管周圍及間質纖維化仍呈高水平狀態(P<0.01)，且隨時間延長膠原沉積明顯增多，見圖2。

Figure 2.Masson staining of the myocardium tissues in rats (×200) and the change of collagen volume fraction. Mean±SD.n=8.**P<0.01vssham.

圖2 大鼠心肌組織Masson染色及膠原容積分數變化

3 心肌HYP含量的變化

與假手術組相比，模型組大鼠心肌HYP含量均明顯增加(P<0.01)，且隨時間延長大鼠HYP含量有升高的趨勢，見圖3。

Figure 3.The content of HYP in rats. Mean±SD.n=8.**P<0.01vssham.

圖3 大鼠心肌羥脯氨酸含量

4 血清膠原代謝產物水平的變化

與假手術組相比，模型組大鼠血清PⅠCP濃度顯著升高，在第4、8和12周時差異有統計學意義(P<0.05)，且隨時間延長有增高的趨勢；模型組大鼠血清PⅢNP濃度顯著升高，CTX-Ⅰ濃度顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

討 論

心肌纖維化是高血壓左室肥厚的核心病理改變。通過在大鼠右腎動脈上方0.5 cm處部分結扎腹主動脈，導致心臟后負荷增加，同時縮窄部位遠心端供血量減少，引起雙腎動脈血流相對減少，血管緊張素Ⅱ等體液因素也參與了心肌纖維化的形成。HYP在膠原蛋白中占13.4%，在彈性蛋白中含量極少，其它蛋白中幾乎不存在，因此測定心HYP的含量可以間接反映心肌膠原蛋白的水平，纖維化病灶內HYP含量常與纖維化程度呈正相關。本研究結果顯示，壓力超負荷大鼠心肌HYP含量明顯增加，且隨時間延長大鼠心肌HYP含量有升高的趨勢。

Figure 4.The levels of myocardial collagen metabolites in rats. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vssham.

圖4 大鼠血清膠原代謝產物水平

心肌纖維化是心肌膠原合成與降解失衡的過程。心臟細胞外基質(extracellular matrix, ECM)中含量最多的是膠原，其中85%是Ⅰ型膠原，11%為Ⅲ型膠原，其它的為Ⅳ、Ⅴ型等膠原。Ⅰ、Ⅲ型膠原之間保持適當數量和比例，是維持心臟正常結構和功能的前提。心肌膠原合成與降解失衡，導致Ⅰ、Ⅲ型膠原比例改變及過度沉積，從而形成心肌纖維化。心肌纖維化過程中伴隨著多種心肌膠原代謝相關產物的增加，如：PⅠCP、PⅢNP、CTX-Ⅰ等。臨床研究顯示，老年舒張性心功能不全患者血清PⅠCP水平明顯高于健康對照組，并且無論有無左心室肥厚，血清PⅠCP水平均明顯增高，表明心肌纖維化是舒張性心功能不全的主要原因[4]。PⅠCP和PⅢNP是心肌Ⅰ型和Ⅲ型膠原的前體多肽，是前膠原轉換為膠原過程中脫離前膠原的游離肽段，其隨膠原纖維合成的增加而增加，是心肌Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成的間接標志[5-6]。CTX-Ⅰ是Ⅰ型膠原特異成分，在Ⅰ型膠原降解過程中釋放入血，是Ⅰ型膠原降解的標志物[7]。研究顯示，自發性高血壓大鼠血清CTX-Ⅰ濃度并未隨著膠原合成增加而升高，提示相對于較高的膠原合成率，膠原的降解可能不足[7]。心肌膠原代謝標志物主要用于評估心肌纖維化水平，定量測定血清濃度有助于了解心肌纖維化程度，對于評價療效及近遠期預后有著重要意義。本研究結果顯示，壓力超負荷大鼠心肌膠原代謝紊亂，心肌膠原合成增加、降解不足，導致心肌膠原沉積，從而引起心肌纖維化，乃至左室肥厚，且隨時間的延長，病變更加顯著。然而，壓力超負荷導致心肌纖維化效應的機制尚需深入研究。有研究表明，外源性血管緊張素-(1-7)可減輕壓力負荷增高所致的心肌肥厚，其機制可能與抑制心肌p-ERK1/2表達有關，這為進一步研究提供了參考[8]。

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[2] 孫寧玲， Jaw-Wen Chen， 王繼光， 等. 亞洲高血壓合并左心室肥厚診治專家共識[J]. 中華高血壓雜志， 2016， 24(7)：619-627.

[3] Doering CW, Jalil JE, Janicki JS, et al. Collagen network remodelling and diastolic stiffness of the rat left ventricle with pressure overload hypertrophy[J]. Cardiovasc Res, 1988, 22(10):686-695.

[4] Roongsritong C, Bradley J, Sutthiwan P, et al. Elevated carboxy-terminal peptide of procollagen type I in elderly patients with diastolic dysfunction[J]. Am J Med Sci, 2006, 331(3):131-133.

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[6] Ho CY, López B, Coelho-Filho OR, et al. Myocardial fibrosis as an early manifestation of hypertrophic cardiomyopathy[J]. N Engl J Med, 2010, 363(6):552-563.

[7] Díez J, Panizo A, Gil MJ, et al. Serum markers of collagen type I metabolism in spontaneously hypertensive rats: relation to myocardial fibrosis[J]. Circulation, 1996, 93(5):1026-1032.

[8] 何建桂， 黃藝儀， 馬 虹， 等. 血管緊張素-(1-7)對心肌肥厚的影響及其與細胞外信號調節激酶的關系[J]. 中國病理生理雜志， 2005， 21(9)：1713-1716.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Dynamic changes of myocardial collagen metabolism in pressure-overloaded rats

LV Shi-chao1, ZHANG Jun-ping1, LI Meng2, WU Mei-fang2, WANG Qiang2, WANG Xiao-jing2, XU Ling2

(1DepartmentofGeriatricMedicine,FirstTeachingHospital,2GraduateSchool,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China.E-mail:tjzhtcm@163.com)

AIM: To observe the dynamic changes of myocardial collagen metabolism in pressure-overloaded rats.METHODS: The pressure-overloaded rat model was established by partial abdominal aortic coarctation. The rats underwent surgery but not constrictive were used as sham-operated control group. The rats were euthanized at 3, 4, 8 and 12 weeks. The body mass, heart mass and left ventricular mass were weighed, and the heart mass index (HMI) and left ventricle mass index (LVMI) were calculated. Masson trichrome staining was used on the myocardial sections, alkaline hydrolysis was used to detect the content of myocardial hydroxyproline (HYP), and the serum levels of procollagen type I carboxy-terminal peptide (PICP), procollagen type III amino-terminal peptide (PIIINT), and collagen C telopeptide type I (CTX-I) were also measured. RESULTS: Compared with sham-operated control group, the collagen deposition was evident, and collagen volume fraction (CVF) was increased significantly in model group (P<0.01), which further increased over time. HMI, LVMI and HYP significantly increased in model group (P<0.05), and HYP showed a tendency to increase over time. In addition, the serum concentration of PICP was increased significantly in model group, and the difference was significant at 4, 8 and 12 weeks (P<0.05). The serum concentration of PIIINP was increased significantly, but CTX-I was lowered significantly in model group (P<0.01). CONCLUSION: In the state of pressure overload, myocardial collagen metabolism is in disorder, and myocardial fibrosis is the major pathological change, which further increases over time.

Abdominal aortic coarctation; Pressure overload; Myocardium collagen; Myocardial fibrosis

1000- 4718(2017)04- 0740- 04

2016- 10- 10

2017- 01- 20

國家自然科學基金資助項目(No. 81603559)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.027

△通訊作者 Tel： 022-27432016； E-mail： tjzhtcm@163.com