川芎嗪通過抗炎作用減輕2型糖尿病大鼠心肌病變*

趙辛元， 徐 魁， 李彩容， 李 娟， 林鳳平， 李彩艷， 孫家忠, 陳 曉

(1湖北科技學院臨床醫學院內分泌科, 2咸寧市中心醫院內分泌科， 湖北 咸寧 437100； 3武漢大學中南醫院內分泌科， 湖北 武漢 430071； 4湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室， 湖北 咸寧 437100)

川芎嗪通過抗炎作用減輕2型糖尿病大鼠心肌病變*

趙辛元1， 徐 魁1， 李彩容1， 李 娟1， 林鳳平2， 李彩艷2， 孫家忠3, 陳 曉4△

(1湖北科技學院臨床醫學院內分泌科,2咸寧市中心醫院內分泌科， 湖北 咸寧 437100；3武漢大學中南醫院內分泌科， 湖北 武漢 430071；4湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室， 湖北 咸寧 437100)

目的： 觀察川芎嗪對抗糖尿病引起的大鼠心肌細胞損傷的作用。方法: 雄性Wistar大鼠高糖高脂飼料喂養4周后空腹自尾靜脈注射STZ制造2型糖尿病模型，觀察不同給藥劑量川芎嗪對糖尿病大鼠體重、血糖、心臟組織形態以及心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IKKβ和NF-κB蛋白水平的影響。結果: 高劑量川芎嗪可緩解糖尿病大鼠的體重減輕和血糖升高，并且可以減少促炎因子 IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，降低IKKβ和NF-κB的蛋白水平。結論: 川芎嗪通過拮抗炎癥通路能減輕糖尿病引起的大鼠心肌細胞損傷。

川芎嗪； 心肌炎癥； 2型糖尿病

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種常見的獨立于其它發病因素的糖尿病(diabetes mellitus，DM)慢性并發癥，也是導致糖尿病患者心血管疾病的一個重要的原因[1]。DCM的臨床表現早期主要為左心室舒張功能障礙，晚期為收縮功能障礙，并且可以誘發心源性休克、心力衰竭和猝死等[2]。DCM的發病機制尚未完全闡明，但大多數學者認為是由糖、脂代謝紊亂導致的，其中氧化應激、炎癥、線粒體損傷等在DCM的發病機制中具有重要地位，而氧化應激和炎癥機制更受關注[3]，因此有許多研究將DCM的治療方向選在抗炎、抗氧化上[4-5]。川芎嗪是從傘形科藁本屬植物川芎根中提取的生物堿，目前應用于臨床的有川芎嗪片、川芎嗪注射劑等，具有廣泛的藥理活性[6]。諸多研究表明川芎嗪具有良好的對心腦血管的保護作用如防治腦缺血、抗血栓、抗腫瘤以及對心臟心肌細胞和冠狀動脈的防治效果[7-8]。雖然近年來川芎嗪通過清除自由基，抗脂質過氧化的作用機制來產生藥理活性的報道屢見報到，但文獻多集中在腫瘤[9]、高血壓[10]、腦中風[11]等方面，而對糖尿病引起病變的改善作用研究較少。即使川芎嗪在糖尿病人和動物水平上都具有治療作用[12-15]，但是甚少研究關注到其改善糖尿病所引起的心臟病變。本實驗將從炎癥因子方向來探討川芎嗪對DCM的防治作用及可能機制，為其應用于臨床提供實驗及理論依據。

材 料 和 方 法

1 藥物、試劑與儀器

川芎嗪(純度98%，上海晶純)、羧甲基纖維素鈉和鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自優寧維生物有限公司；抗IKKβ和NF-κB抗體(Abcam)；抗β-actin抗體(武漢谷歌生物科技有限公司)；檢測IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子的ELISA試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；其余試劑均為國產分析純。

血糖儀(深圳市三諾電子有限公司)；電泳儀和電泳槽(北京六一公司)；全波長多功能酶標儀(Bio-Tek)；熒光掃描儀(奧德賽)；3-18K高速冷凍離心機(Sigma)；正置顯微鏡(Olympus)。

2 實驗動物

雄性Wistar大鼠共50只，體重120～150 g，動物合格證為編號SYXK(鄂)2013-0071，伺養于SPF級動物房。維持正常的室溫和光照12 h的晝夜節律。正常組給予普通飼料，常規飲水、進食。模型組和川芎嗪組給予高糖高脂喂養和常規飲水。

3 方法

3.1 糖尿病模型制備 用0.1 moL/L的枸櫞酸緩沖液(pH 4.2)在冰浴中配制10 g/L的STZ溶液，現配現用。給禁食12 h 后的大鼠尾靜脈注射STZ(25 mg/kg)。注射完7 d后測血糖，若餐后餐前血糖小于6.1 mmoL/L和2 h血糖大于11.2 mmoL/L，且有多飲、多食、多尿現象者，確定為糖尿病大鼠。

3.2 實驗動物分組與處理 隨機選擇10只健康雄性Wistar大鼠為正常(normal, Nor)組，30 只造模成功的糖尿病大鼠隨機分為3 組，分別為糖尿病模型組(DM組)、川芎嗪高劑量治療組(High組)和低劑量治療組(Low組)。川芎嗪用1% 的羧甲基纖維素鈉助溶。各治療組分別以50和100 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃1次。空白組和模型組，每日以等體積1%的羧甲基纖維素鈉灌胃1 次。于給藥16 周末空腹12 h后測定空腹血糖和餐后血糖，每周進行體重監控。16周后，苯巴比妥鈉麻醉，開胸取心臟，一部分用4% 多聚甲醛固定，用于HE 染色；另一部分凍存在-80 ℃冰箱，用于Western blot 檢測和ELISA分析。

3.3 心肌組織結構的觀察 4%多聚甲醛固定心肌組織24 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備4 μm 石蠟切片，常規HE 染色，中性樹脂封片，光鏡顯微鏡下觀察分析心肌組織病理變化。

3.4 ELISA試劑盒檢測心肌組織炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量 剪取體積約100 mg的心肌組織，加入1 mL 生理鹽水，勻漿器勻漿后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，按ELISA 試劑盒說明書操作，450 nm 波長下檢測吸光度(A)值，繪制標準曲線，計算各組心肌組織IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子的含量。

3.5 Western blot 檢測IKKβ和NF-κB蛋白表達 從-80 ℃冰箱取100 mg 凍存的心肌組織，稱重，按照質量體積比1∶10加入1 mL RIPA 裂解液(含1 mmoL/L PMSF)，冰上快速用剪刀剪碎成小團塊，用超聲波粉碎儀粉碎30 s，冰上靜置30 s，重復3次后，靜止30 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清于另一EP管中。用BCA 法進行蛋白含量測定，根據所需樣品體積，加5×SDS 上樣緩沖液， 沸水加熱8 min，使蛋白變性。制作10%分離膠和5%的濃縮膠，取60 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE分離蛋白，轉至PVDF膜，5% BSA封閉1 h，加入適量比例的抗體，4 ℃過夜孵育，然后，孵育相應的熒光 II 抗1 h，同樣TBST洗膜3次，熒光掃描得到目的條帶。

4 統計學處理

采用GraphPad Prism 5統計軟件進行分析。數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，多組間的比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey’s檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 川芎嗪對大鼠體重和血糖的影響

與糖尿病大鼠相比，High組大鼠體重顯著增加(P<0.05)，并且與正常組的差異沒有統計學顯著性；糖尿病組與正常組比較，體重顯著降低(P<0.01)。同樣，在血糖水平上，與糖尿病組比較，高劑量川芎嗪組具有明顯降低餐后血糖的作用(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The body weight and blood glucose of the rats were detected. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsNor group;#P<0.05vsDM group.

圖1 川芎嗪對糖尿病大鼠體重和血糖的影響

2 川芎嗪對糖尿病大鼠心臟形態學的影響

觀察糖尿病大鼠心肌細胞組織HE染色切片，發現Nor組心肌細胞排列整齊，形態清晰可見；DM組心肌細胞形態上出現紊亂，結構模糊，細胞連接不緊密；隨著藥物劑量從低劑量到高劑量，細胞間隙逐漸減少，細胞排列較整齊，形態比較均一,見圖2。

3 Western blot檢測川芎嗪對IKKβ和NF-κB蛋白表達的影響

如圖3所示，與正常組相比，糖尿病大鼠心臟組織中IKKβ和NF-κB蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；與DM組比較，川芎嗪組劑量依賴性地降低了IKKβ和NF-κB蛋白表達(P<0.05)。

4 川芎嗪對心臟炎癥因子的影響

DM組IL-6和IL-1β的水平明顯增加(P<0.01)，而川芎嗪劑量依賴性地降低了IL-6和IL-1β的表達，高劑量組與糖尿病模型組比較差異具有統計學顯著性(P<0.05)；與正常組相比，糖尿病大鼠心臟中的TNF-α明顯增加(P<0.01)，而高劑量川芎嗪具有明顯降低TNF-α表達的作用(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.The changes of myocardial structure in different groups (HE staining, ×200).

圖2 川芎嗪對糖尿病大鼠心臟組織形態學的影響

Figure 3.The modulation of ligustrazine on the expression of IKK and NF-κB in different groups. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsNor group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group.

圖3 川芎嗪對糖尿病大鼠心臟IKKβ和NF-κB的調控

Figure 4.Effect of ligustrazine on inflammatory cytokines in different groups. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsNor group;#P<0.05vsDM group.

圖4 川芎嗪對糖尿病大鼠心臟炎癥因子的調控

討 論

糖尿病業已成為一種繼心腦血管、腫瘤之后嚴重威脅人類健康和生命安全的第三大殺手[16]。糖尿病引起的并發癥在糖尿病的致死和致殘過程中起到舉足輕重的作用。越來越多由糖尿病引起的心肌病得到全世界科學家們的關注。據報道[17]，長期的糖尿病狀態具有提高心肌氧化應激和炎癥的風險。同時，高糖刺激過多的ROS生成也引起多種炎癥因子表達升高[18-19]，如核轉錄因子NF-κB及炎癥小體等，在胞漿中NF-κB通過與抑制蛋白IκB的結合，以無活性的形式存在。大部分NF-κB 的激活有賴于IκB的磷酸化和泛素化。IκB是首先被IKK(IκB激酶)所磷酸化，然后快速泛素化繼而被26S蛋白酶體所降解。降解會解離出NF-κB，導致胞漿中NF-κB濃度升高。游離的NF-κB轉運至細胞核內，啟動靶基因轉錄，生成相應的mRNA和蛋白質[20]。本實驗中糖尿病組IKK和NF-κB蛋白表達水平顯著升高，涉及到NF-κB可能被激活。相反，在糖尿病狀態下，川芎嗪可以劑量依賴地逆轉激活反應。目前在糖尿病心肌病中發現的炎癥小體很多，其中NLRs家族中的NLRP3尤為值得關注。研究發現其促進caspase-1的自我剪切，形成活性的caspase-1 p20/p10復合物，促進IL-1β的釋放。后者在心肌細胞的凋亡過程中起到重要的作用。同時[21]，高糖環境下的ROS也會促進IL-6和TNF-α的表達上調。在這過程中，核轉錄因子NF-κB具有間接的橋梁作用，通過轉錄促進炎癥小體過度激活，導致心肌間質炎癥反應、心肌細胞凋亡及心肌纖維化等發生。本實驗中， DM組炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α的釋放均出現顯著增加。這些表明在糖尿病狀態下，炎癥信號通路可能被激活。而川芎嗪顯著降低了炎癥因子的釋放水平，特別是高劑量組，對糖尿病大鼠心肌細胞起到明顯的保護作用。

大量研究已經表明川芎嗪對心血管系統的具有防治保護作用[22-23]，可以抑制AngⅡ引起的心肌細胞凋亡，抑制糖尿病大鼠心肌細胞的外鈣內流和肌漿網的內鈣釋放，來避免心肌細胞內鈣超載，從而維持細胞內鈣離子的水平，保護心肌的作用。但是對川芎嗪降低高血糖所導致的炎癥方面的研究甚少。本課題試圖從炎癥因子相關途徑來闡述川芎嗪對大鼠糖尿病的有益作用，結果發現川芎嗪不僅可以降低血糖、維持大鼠體重；組織形態上劑量依賴性地改善心肌細胞結構，恢復組織間隙，使細胞排列整齊，形態均一；還可以抑制心肌細胞中的炎癥因子的含量，降低炎癥信號通路中的IKKβ和轉錄因子NF-κB的表達，從而表現出對糖尿病心肌炎的治療作用。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of ligustrazine on cardiac inflammation in rats with type 2 diabetes mellitus

ZHAO Xin-yuan1, XU Kui1, LI Cai-rong1, LI Juan1, LIN Feng-ping2, LI Cai-yan2, SUN Jia-zhong3, CHEN Xiao4

(1DepartmentofEndocrinology,HubeiUniversityofScienceandTechnologyClinicalMedicalCollege,2DepartmentofEndocrinology,CentralHospitalofXianningCity,Xianning437100,China;3DepartmentofEndocrinology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China;4HubeiProvincalKeyLaboratoryforDiabeticCardiovascularandCerebrovassularDiseases,HubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning437100,China.E-mail:gxzpwk69@126.com)

AIM: To study the effect of ligustrazine on the cardiacmyocyte lesion in rats with type 2 diabetes mellitus. METHODS: Male Wistar rats were injected with STZ via tail vein under high-glucose and high-fat feeding for 4 weeks to establish the animal model of type 2 diabetes mellitus. Ligustrazine at different doses was used to treat the diabetic rats. The body weight, blood glucose and the morphology of heart tissues were observed. The myocardial levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were detected by ELISA, and the protein expression of IKKβ and NF-κB in the myocardium was determined by Westeren blotting. RESULTS: Ligustrazine at high dose alleviated the body weight reduction and blood glucose elevation cause by diabetes, and reduced pro-inflammatory factors IL-1β, TNF-α and IL-6. Moreover, the protein expression of IKKβ and NF-κB was significant decreased by ligustrazine. CONCLUSION: Ligustrazine inhibits the myocardial inflammation caused by diabetes through anti-inflammatory pathway.

Ligustrazine; Myocardial inflammation; Type 2 diabetes mellitus

1000- 4718(2017)04- 0744- 05

2016- 10- 10

2016- 12- 19

湖北科技學院校級科研項目(No. KY14068)

R363； R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.028

△通訊作者 Tel: 0715-8236051; E-mail: gxzpwk69@126.com