白細胞介素1β對破骨細胞空泡型質子泵活性與胞內酸化的影響*

朱偉平， 鄭 晶， 李一杰， 李中和△

(中山大學附屬第五醫院 1腎內科， 2普外科，廣東 珠海 519000)

白細胞介素1β對破骨細胞空泡型質子泵活性與胞內酸化的影響*

朱偉平1， 鄭 晶1， 李一杰2， 李中和1△

(中山大學附屬第五醫院1腎內科，2普外科，廣東 珠海 519000)

目的： 通過體外實驗研究白細胞介素1β(IL-1β)對破骨細胞空泡型質子泵與細胞內pH值的影響，以探討IL-1β促進破骨細胞骨吸收的機制。方法: 骨髓單核巨噬細胞經過誘導成為破骨細胞后，予以0.1、0.3和0.5 μg/L 的IL-1β干預48 h，檢測破骨細胞空泡型質子泵mRNA和蛋白的表達以及IL-1β對破骨細胞胞內酸化的影響，觀察空泡型質子泵活性的改變與破骨細胞骨吸收功能的變化。結果: 研究結果提示破骨細胞經IL-1β干預48 h后，空泡型質子泵的表達與活性均顯著增加，并且細胞內pH值下降。破骨細胞與含有IL-1β的細胞培養液共同孵育后，其骨吸收能力增強，培養液中IL-1β的濃度越高，該作用越趨明顯。結論: IL-1β可能是通過上調空泡型質子泵的表達與酶的活性，促進氫離子的產生和(或)轉運，引發破骨細胞骨吸收活動增加，最終導致骨質破壞，由此參與骨關節炎癥性疾病的發生。

白細胞介素1β； 空泡型質子泵； 破骨細胞

人體的骨骼組織中含有大量的成骨細胞和破骨細胞，共同負責完成骨吸收和骨形成這2個持續的骨重塑生理過程，兩者處于動態平衡。破骨細胞是主要的骨吸收細胞，來源于骨髓造血干細胞，由骨髓中的多個單核巨噬細胞融合而成[1]，其基底側有許多不規則的皺褶緣，是細胞膜折疊突向骨基質吸收表面的微絨毛形成的。破骨細胞的皺褶緣呈波浪型接觸骨的表面，經整合素αvβ3結合到骨的表面，包圍吸附區的骨質，形成一個有利于骨吸收的密閉帶[2]，胞漿膜上的質子泵將胞漿中的氫離子泵至破骨細胞與骨質之間的密閉腔隙中，使羥磷灰石晶體溶解成磷酸鈣，基質中的有機成分則被酸性蛋白水解酶分解[3]。白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)是一個重要的骨質溶解細胞因子，它可誘導成骨細胞產生PGE2，介導骨吸收，還可刺激核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)誘導的破骨細胞的分化，活化破骨細胞而促進骨吸收，在病理性骨吸收中發揮重要作用[4-5]，但IL-1β誘導破骨細胞骨吸收的具體途徑尚未闡明。本文旨在通過體外實驗研究IL-1β對破骨細胞空泡型質子泵(vacuolar proton pump，V-ATPase)表達與活性的影響，以探討IL-1β促進破骨細胞骨吸收的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

α-MEM培養液和青/鏈霉素(含青霉素1×107U/L與鏈霉素1×104mg/L)購自Gibco；胎牛血清和BSA(Biological Industries)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色試劑盒(Sigma)；巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)與可溶性小鼠RANKL 購自R&D；重組小鼠IL-1β 來自PeproTech；BCA蛋白檢測試劑盒購自Beyotime；兔抗鼠V-ATPase抗體(GenScript)；羊抗兔IgG II 抗(Santa Cruz)；4周齡C57BL/6小鼠(中山大學動物實驗中心)；培養板(Corning)。

2 方法

2.1 骨髓細胞培養 拉頸處死4周齡C57BL/6小鼠，用75%乙醇浸泡5 min；無菌條件下切開皮膚及肌層分離出股骨，清除骨表面的軟組織；剪斷兩側骨骺端，用1 mL注射器將培養液沖洗骨髓腔；收集骨髓細胞混合液共10 mL，吹打均勻，加入小鼠M-CSF至終濃度25 mg/L，并接種至培養瓶中，在含有10% BSA的α-MEM培養液中添加1%青/鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2培養箱內；培養48 h后，用PBS漂洗，去除未黏附的淋巴細胞及血細胞，以貼壁的骨髓單核巨噬細胞用于誘導破骨細胞。

2.2 破骨細胞的誘導 收獲骨髓單核巨噬細胞后，采用細胞計數板計數，按104/cm2的密度接種于培養板。小鼠RANKL與M-CSF按說明書用相應的溶媒進行溶解。培養基中加入30 μg/L小鼠RANKL與25 μg/L的M-CSF共同誘導。置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養5 d，隔天換液1次，保持培養液中RANKL終濃度為30 μg/L，觀察細胞形態特征變化。培養4～5 d 后可以觀察到成熟破骨細胞的形成。

2.3 TRAP染色 骨髓單核巨噬細胞按上述方法在培養板中培養5 d后取出，以PBS沖洗1次；2.5%的多聚甲醛固定10 min；PBS沖洗3次；加入TRAP染色液，將培養板置入37 ℃的恒溫箱避光孵育1 h；倒置相差顯微鏡下觀察及拍片。

2.4 實時熒光定量PCR 在破骨細胞的培養板中加入TRIzol分離并提取出總RNA。所用內參照GAPDH的上游引物序列為5’-CCATGTTTGTGATGGGTGTGAACC-3’，下游引物序列為5’-CCAACACTGAGCATCTCCCTCACA-3’；V-ATPase的上游引物序列為5’-GAGACCTCAACGAATCCGTGA-3’，下游引物序列為5’-GCTAGGCAAAGGAGGACCT-3’。逆轉錄設定反應條件為 37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 min，4 ℃。實時熒光定量PCR 采用25 μL反應體系，包含前后引物各1 μL，12.5 μL SYBR? Premix Ex Taq II，8.5 μL無酶水與2 μL的cDNA。反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s， 60 ℃ 1 min， 72 ℃ 2 min，40個循環。通過熔解曲線分析PCR 產物的特異性。結果采用2-ΔΔCt法分析。

2.5 Westen blot 成熟破骨細胞與IL-1β(0.1、0.3和0.5 μg/L)共培養48 h，用RIPA緩沖液裂解細胞。取蛋白提取液(30 μg) 在12 % SDS 聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。隨后轉移至硝酸纖維素膜，與兔抗鼠V-ATPase抗體(0.2 mg/L)孵育，GAPDH 作為內參照，II抗是1 mg/L的羊抗兔IgG-辣根過氧化物。使用數字凝膠電泳圖像處理與分析系統(Tanon)分析條帶灰度。

2.6 V-ATPase活性的測定 將破骨細胞與IL-1β(0.1、0.3和0.5 μg/L)共培養48 h，按試劑盒說明書制備蛋白質樣品。通過BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。然后使用V-ATPase活性檢測試劑盒(Genmed)測定酶的活性。巴弗洛霉素A1是V-ATPase的特異性抑制劑。在巴弗洛霉素A1存在與否的情況下，V-ATPase在丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶反應系統中水解底物ATP，同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide，NADH) 被轉換成了氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(oxidized form of nicotinamide-adenine dinucleotide，NAD)，根據兩者在340 nm的吸光度差異可以計算出V-ATPase的相對活性。通過分光光度計對各組V-ATPase活性進行檢測，樣品活性讀數于340 nm處讀取。

2.7 胞內pH值的測定 骨髓單核巨噬細胞接種于預先置有血蓋片的24孔板，5 d后獲得成熟破骨細胞，與不同劑量的IL-1β共培養48 h，用20 mmol/L的氯化銨處理15 min，不含酚紅及血清的MEM培養基沖洗2次，吸去培養基，加入濃度為10 μmol/L的BCECF AM染色，37 ℃孵育30 min；然后將細胞放置于共聚焦顯微鏡(Leica)上檢測熒光強度。

2.8 骨吸收功能檢測 骨髓單核巨噬細胞以104/cm2的密度接種于底部覆蓋羥磷灰石結晶的OAAS培養板(24孔)中培養，加入30 μg/L的RANKL與25 μg/L的M-CSF共同誘導，隔天換液 1 次。誘導5 d后分別加入不同濃度的IL-1β(0.1、0.3和0.5 μg/L)；繼續培養2 d后取出培養板，PBS沖洗3次；1 mol/L氫氧化鈉與6%次氯酸鈉混合液洗滌5 min；PBS沖洗3次；在倒置顯微鏡下觀察骨吸收陷窩的形成并拍片，骨吸收面積用Image-Pro Plus軟件分析。

3 統計學處理

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。計量資料數據以均數±標準差(mean±SD)表示，結果采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法，各組均數間兩兩比較用LSD法，方差不齊用Dunnett’s T3法進行組間比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 V-ATPase的表達

成熟的破骨細胞與不同濃度IL-1β共培養48 h后，按前述方法分離出總RNA以及提取蛋白，評估IL-1β對V-ATPase mRNA與蛋白表達的影響。結果提示隨著IL-1β濃度的增加，V-ATPase 的mRNA表達逐漸增加，呈上升趨勢，處理組與對照組之間差異有統計學意義，見圖1A。Western blot實驗結果表明V-ATPase蛋白的表達隨著IL-1β濃度的增高而增加，處理組與對照組之間差異有統計學意義，見圖1B。這提示IL-1β可促進破骨細胞V-ATPase的mRNA和蛋白表達，為破骨細胞下一步的骨吸收活動提供足夠具有分泌氫離子功能的V-ATPase。

2 V-ATPase活性的變化

為評價IL-1β對V-ATPase活性的影響，我們按前述方法對各組V-ATPase活性進行檢測及計算，結果表明IL-1β處理組的V-ATPase活性顯著增加，并且V-ATPase活性的增加與IL-1β濃度呈劑量依賴性，提示IL-1β可提高破骨細胞V-ATPase的活性，促進氫離子的產生和/或轉運，見圖1C。

Figure 1.The effect of IL-1β on V-ATPase in osteoclasts. The osteoclasts were cultured with different doses of IL-1β for 48 h. A: the relative mRNA expression of V-ATPase; B: the protein expression of V-ATPase in the osteoclasts; C: the changes of V-ATPase activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L group.

圖1 IL-1β對破骨細胞V-ATPase的影響

3 對破骨細胞胞內pH值的影響

BCECF AM是能夠檢測活細胞內pH值的染料，在細胞內的pH值從9.5降低至6.2的范圍內，隨著pH值的增高熒光強度增加。通過激光掃描共聚焦顯微鏡檢測IL-1β對破骨細胞內pH值的影響，結果發現隨著培養液中IL-1β濃度的增加，細胞內熒光強度逐漸減弱，破骨細胞內pH水平降低，提示IL-1β可以促進破骨細胞胞內酸化，為骨吸收活動儲備更多氫離子。當破骨細胞被激活后，即可通過質子泵在密閉帶的微環境中釋放大量氫離子，溶解構成骨礦化物的羥磷灰石結晶，造成局部骨質破壞，見圖2。

4 對骨吸收的影響

通過測定不同IL-1β濃度下破骨細胞骨質吸收面積的變化，結果發現破骨細胞經IL-1β刺激后，處理組骨基質的骨吸收面積顯著增加，這種作用與IL-1β濃度呈正相關，見圖3。這說明IL-1β可以直接促進破骨細胞的骨吸收活動，IL-1β的濃度越高，促進骨吸收的作用越強。

Figure 2.The effect of IL-1β on the pH value in the osteoclasts. The osteoclasts were cultured with different concentrations of IL-1β for 48 h. BCECF AM was capable of sensing intracellular pH in living cells with the green fluorescence intensity increasing upon promoting the pH value. The images were captured by a laser scanning confocal microscope (×40). The relative fluorescence intensity of the osteoclasts was quantitatively analyzed. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L group.

圖2 IL-1β對破骨細胞胞內pH值的影響

Figure 3.The effect of IL-1β on the bone resorption capability of the osteoclasts (×100). The osteoclasts were cultured with different doses of IL-1β for 48 h in OAAS multiwell plates to evaluate the bone resorption capability of the cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 IL-1β對破骨細胞骨質吸收的影響和骨吸收面積的比較

討 論

近年來IL-1已被公認是一種參與免疫及炎癥反應的重要細胞因子，與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素6等細胞因子共同調節炎癥中多種相關細胞的相互反應并參與損傷后的修復過程[6-7]。IL-1可由多種細胞產生，如滑膜細胞、軟骨細胞、巨噬細胞等，分為IL-1α和IL-1β 2種亞型，僅IL-1β能被分泌到細胞外發揮生物效應[8]。當發生急性或慢性炎癥時，IL-1β會引發發熱、急性期蛋白質合成等機體的全身反應，局部則可引起組織炎癥和破壞性病變[9]。

在類風濕性關節炎中，IL-1β可刺激軟骨細胞及成纖維細胞產生基質金屬蛋白酶、中性蛋白酶與膠原酶，抑制基質大分子如Ⅱ型膠原及蛋白多糖聚合體的合成，促進前列腺素E2的合成分泌，從而導致軟骨破壞和骨質吸收；同時IL-1β可以作用于成骨細胞，增加核因子κB受體活化因子配體的表達，促使巨噬細胞進一步向破骨細胞分化，導致關節骨質的吸收及破壞[10]。IL-1β在骨性關節炎的發病機制中亦起重要作用，是參與關節滑膜炎性病變及軟骨基質降解最主要的細胞因子[11]。IL-1β能誘導軟骨細胞在短期內大量表達基質金屬蛋白酶13、聚蛋白多糖酶4、聚蛋白多糖酶5、聚蛋白多糖酶7、聚蛋白多糖酶12等，通過這些酶的作用直接降解軟骨細胞外基質[12]；同時，IL-1β還能夠促進軟骨細胞凋亡，參與滑膜炎性病變[13]。此外，有報道稱在小鼠的骨質疏松模型中，IL-1β、TNF-α和IL-6的表達增高，破骨活動增強，使骨吸收大于骨形成，影響到骨重塑活動的內在平衡，引起骨代謝活動的紊亂[14]。

V-ATPase是破骨細胞表達的特殊蛋白質，其主要作用是驅動氫離子分泌，引起骨礦物主要成分羥磷灰石結晶的溶解。破骨細胞分泌氫離子是骨骼脫礦的關鍵環節。此過程與破骨細胞膜上的質子泵(V-ATPase)密切相關。V-ATPase的缺陷可導致骨硬化病[15]。根據質子泵所在質膜，可分為細胞膜型(P-ATPase)、線粒體型(F-ATPase)和空泡型(V-ATPase)[16]。迄今為止，V-ATPase核心結構已得到了很好的建模，它由胞內的V1結構、跨膜的V0兩個不同的結構域和輔助亞基AC45、M8-9共同組成[17]。V-ATPase廣泛存在于真核細胞中，參與調控細胞內pH值的生理過程。研究發現V-ATPase以高密度在特定的細胞膜中表達，如腎閏細胞和破骨細胞，它們在尿液酸化和骨吸收中發揮重要的作用[18-19]。許多以全身的骨量丟失為特征的骨代謝性疾病是由于破骨細胞的骨吸收活性增加，引發骨質疏松甚至骨折，結果導致病人生活質量顯著降低[20]。

通過實驗分析，我們發現IL-1β不僅能夠促進V-ATPase mRNA與蛋白的表達，提高V-ATPase活性，而且可促進破骨細胞胞內酸化；而體外實驗尚提示IL-1β可增強破骨細胞的骨吸收功能。根據這些研究結果，我們推測IL-1β作用于成骨細胞，增加RANKL表達，分泌的RANKL進一步促進單核巨噬細胞相互融合向成熟破骨細胞分化；并且IL-1β通過上調V-ATPase的表達與酶的活性，促進氫離子的產生和(或)轉運，引發骨關節炎癥區域破骨細胞骨吸收活動增加，溶解骨基質和羥磷灰石結晶，最終導致骨關節骨質破壞。因此，我們認為IL-1β可能是通過該途徑參與骨關節炎癥性疾病的發病機制，下一步研究的方向是對每一個V-ATPase亞基在此過程中所發揮的具體作用進行探索。由于該研究主要為體外實驗，結論具有一定的局限性，有待通過相關動物實驗作進一步的分析與論證。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of interleukin-1β on activity of vacuolar proton pump and intracellular acidosis in osteoclasts

ZHU Wei-ping1, ZHENG Jing1, LI Yi-jie2, LI Zhong-he1

(1DepartmentofNephrology,2DepartmentofGeneralSurgery,TheFifthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Zhuhai519000,China.E-mail:zhongheli88@163.com)

AIM: To study the effect of interleukin-1β (IL-1β) on the activity of vacuolar proton pump (V-ATPase) and intracellular pH value in the osteoclasts for exploring the mechanism of IL-1β to promote osteoclastic bone absorption. METHODS: The mature osteoclasts were attained by induction of bone marrow monocytes/macrophages. The osteoclasts were cultured with α-MEM and treated with different concentrations (0.1, 0.3 and 0.5 μg/L) of IL-1β. After cultured for 48 h, the mRNA and protein expression of V-ATPase was detected. The effect of IL-1β on intracellular pH value, activity of V-ATPase and the bone absorption abilities of osteoclasts were examined. RESULTS: The expression level and activity of V-ATPase were significantly increased and the intracellular pH value of the osteoclasts decreased after incubated with IL-1β for 48 h. Under the same culture condition, the bone absorption capacity of the osteoclasts was promoted. The enhanced bone absorption capability of the osteoclasts was accompanied by an increase in the concentration of IL-1β. CONCLUSION: The mechanism of IL-1β participating in pathological bone absorption in the bone and joint inflammatory diseases is that IL-1β increases the expression and activity of V-ATPase, boosts the production and/or transportation of hydrogen ion, leading to increased osteoclastic bone absorption activity, and resulting in bone destruction.

Interleukin-1β; Vacuolar proton pump; Osteoclasts

1000- 4718(2017)04- 0749- 05

2016- 08- 22

2017- 02- 13

廣東省自然科學基金博士啟動項目(No. 2016A030310193)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.029

△通訊作者 Tel: 0756-2528703； E-mail: zhongheli88@163.com