側流暗場成像技術觀察內毒素休克兔小腸絨毛與舌下微循環改變*

高 飛， 傅小云， 錢明江， 張 宇， 李光素， 胡 杰

(遵義醫學院附屬醫院重癥醫學科， 貴州 遵義 563003)

·實驗技術·

側流暗場成像技術觀察內毒素休克兔小腸絨毛與舌下微循環改變*

高 飛， 傅小云△， 錢明江， 張 宇， 李光素， 胡 杰

(遵義醫學院附屬醫院重癥醫學科， 貴州 遵義 563003)

目的： 利用側流暗場(sidestream dark-field，SDF)成像技術觀察比較內毒素休克兔經液體復蘇至同一目標血壓水平下小腸絨毛微循環及舌下微循環變化的異同。方法: 新西蘭大白兔60只，隨機分為絨毛組及舌下組，每組30只。2組均行體外回腸造口術，用細菌脂多糖注射建立內毒素休克模型。建模成功后用乳酸林格氏液以復蘇劑量30 mL·kg-1·h-1進行液體復蘇使平均動脈壓(MAP)達到80 mmHg為目標血壓。若經單純液體復蘇，血壓仍不能達標者，則予以去甲腎上腺素0.5～1 μg·kg-1·min-1維持至目標血壓。通過SDF成像技術持續觀察2組動物休克前后以及液體復蘇后的小腸絨毛及舌下微循環灌注指標：絨毛血管數量(vessels per villus，VV)、微血管血流指數(microvascular flow index，MFI)、灌注絨毛比例(proportion of perfused villi，PPVi)、絨毛邊界量化評分、絨毛血管評分、總的血管密度(total vessel density，TVD)、灌注血管密度(perfused vessel density，PVD)、灌注血管比例(proportion of perfused vessels，PPVe)等的變化并比較兩者灌注特點的異同。結果: 休克后，小腸絨毛MFI、PPVi以及舌下微循環MFI、PPVe、TVD、PVD較休克前均顯著下降(P<0.01)，其中小腸絨毛微循環MFI顯著低于舌下微循環(P<0.01)；經液體復蘇至MAP達到目標血壓后，小腸絨毛MFI、PPVi以及舌下微循環MFI、PPVe、TVD、PVD較休克后均有明顯上升(P<0.05)，但復蘇后的小腸絨毛微循環MFI仍明顯低于舌下微循環(P<0.01)。結論: 內毒素休克兔小腸絨毛與舌下微循環灌注變化有差異，休克后小腸絨毛微循環灌注下降程度較舌下微循環更顯著，而液體復蘇后小腸絨毛微循環灌注恢復程度亦低于舌下微循環。

側流暗場成像； 微循環； 內毒素休克； 液體復蘇

膿毒癥休克早期液體復蘇治療達標后，宏觀的血流動力學恢復，但微循環功能障礙仍然可能存在[1]。膿毒癥休克期間，不同部位不同臟器的微循環功能障礙的發生時間和下降程度并非完全一致[2]，胃腸道是休克發生后最早受累的器官之一[3-4]。側流暗場(sidestream dark-field，SDF)成像技術是手持式正交極化頻譜(orthogonal polarization spectral，OPS)成像技術的衍生技術，由排列在探測器末端的二極管頻閃光源發出與血紅蛋白吸收波長(550 nm)相近的獨立極化綠色光源[(540±50) nm]，可以監測到組織內部的微循環血流變化。SDF技術上較OPS更成熟，形成圖像更清晰[5]，且更輕便、廉價。至1999年被用于臨床以后，其對器官微循環的監測作用才逐漸被證實認同[6]。目前主要應用于舌下、骨骼肌、肝臟、膈肌以及小腸絨毛等組織的微循環監測中[6]。因觀察部位的限制，既往的研究主要集中在舌下微循環，但據證實舌下微循環和腸道微循環結構上及數據分析間均存在實質性差異，故而舌下微循環的改變并不一定能完全反映腸道微循環的改變[7-8]。本實驗試圖獲得實時內毒素休克下腸絨毛與舌下微循環變化的圖像及參數，為SDF成像技術用于膿毒癥休克時床旁器官微循環功能監測、療效評估奠定前期研究基礎。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔60只，體重2～2.5 kg，雌雄不拘，母兔未孕，產地重慶，許可證號為SCXK-(軍)2012-0003。

1.2 主要試劑及儀器 細菌脂多糖(lipopolysaccha-ride，LPS)購于Sigma。LH-SDF-1型側流暗場成像觀測儀、支架、X-Y工作臺、獨立極化光源及外置光源、微循環分析工作站中文版(徐州利華電子科技發展有限公司)；PM-9000監護儀(上海杰韋弗醫療器械有限公司)；BL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟軟件有限公司)。

2 方法

2.1 麻醉與術前準備 手術前均被飼養在環境溫度為21 ℃的飼養籠內，自由飲水進食。術前禁食、不禁水過夜。腹腔內注入戊巴比妥30 mg/kg誘導麻醉。剔除標準：不適應飼養條件，術前、術中產生強烈應激反應;建模時血壓下降超出標準或因休克死亡;復蘇后血壓不達標。

2.2 實驗分組 實驗開始前將60只兔隨機分為絨毛組及舌下組，每組30只。

2.3 手術步驟 于股動脈內置入24 G聚乙烯導管用于連續性有創動脈監測。股靜脈內置入24 G聚乙烯導管用于復蘇治療通道。為排除呼吸道風險，行氣管切開，并置入14 G氣切導管開放氣道。經腹正中線剖腹，根據大白兔回腸末端特有的“圓小囊”結構確定回腸后，暴露回腸近端5 cm至遠端4 cm段至體外，小心處理腸系膜，充分游離外置回腸段，并小心放置在可調節的小塑料板上以避免呼吸運動所產生的偽影。實驗中除在SDF成像取圖時，均間斷給予以37 ℃溫鹽水飽和藥棉拭子輕蘸腸管表面潤濕以減少脫水。術中維持肛溫及有創動脈血壓穩定。

2.4 建立內毒素休克模型 2組均行體外回腸造口成功后經股靜脈注射LPS 2 mg/kg，建立內毒素休克模型，在注入LPS后15 min內，以較注藥前平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)下降30%～45%為建模成功的標準。

2.5 液體復蘇 建模成功后以乳酸林格氏液按復蘇劑量及目標血壓進行液體復蘇，最終維持MAP在目標水平(80 mmHg)。若給予規定劑量乳酸林格氏液液復蘇后血壓仍不能達標者，則予以適量去甲腎上腺素(0.5～1 μg·kg-1·min-1)維持至目標血壓。實驗過程絨毛組7只，舌下組8只實驗兔，共計15只動物需要持續靜脈泵入去甲腎上腺素協助維持血壓至目標血壓水平。

2.6 SDF成像技術觀察微循環 回腸造口術成功后連同專門制作的兔臺可靠放置在X-Y工作臺上，保證SDF設備放置合理、穩定，連接光源，電腦，啟動微循環工作站。分別采集2組動物休克前、休克時以及復蘇過程中的SDF圖像及視頻片段、收集數據并記錄時間。術前、術中盡量減少和/或排除可能影響腸道微循環的因素。

2.7 各定量及半定量參數的記錄與測定 參照2014年荷蘭圓桌會議推薦的小腸絨毛微循環參數評價系統[9]與2007年荷蘭圓桌會議推薦的舌下微循環參數系統[10]分別記錄小腸絨毛與舌下微循環變化，利用中國徐州利華電子科技發展有限公司研發的微循環分析工作站(中文版)聯合進行同步圖像及視頻幀分析，整理小腸絨毛及舌下微循環定量參數。

3 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，正態分布資料用均數±標準差(mean±SD)表示，重復測量資料采用重復測量方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小腸灌注絨毛比例(proportion of perfused villi，PPVi)與絨毛微血管血流指數(microvascular flow index，MFI)的變化

休克后小腸絨毛的PPVi和MFI分別較休克前顯著降低(P<0.01)；液體復蘇后的PPVi和MFI則較休克后增加(P<0.01)，但均未恢復至休克前水平,見表1。

表1 小腸灌注絨毛比例及絨毛微血管血流指數的變化

Table 1.The changes of proportion of perfused villi (PPVi) and microvascular flow index (MFI) of villi in the small intestine villus (Mean±SD.n=30)

GroupPPViMFIBeforeshock0.43±0.052.92±0.12Aftershock0.13±0.03**1.05±0.03**Afterfluidresuscitation0.38±0.05**#1.97±0.11**#

**P<0.01vsbefore shock;#P<0.05vsafter shock.

2 舌下微循環總的血管密度(total vessel density，TVD)、灌注血管密度(perfused vessel density，PVD)及灌注血管比例(proportion of perfused vessels，PPVe)的變化

休克后舌下微循環的TVD、PVD及PPVe較休克前均明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.01)；液體復蘇后的TVD、PVD及PPVe則均較休克后增加(P<0.01)，但與休克前比較差異仍有統計學顯著性(P<0.05)，見表2。

表2 舌下微循環TVD、PVD和PPVe的變化

Table 2.The changes of TVD, PVD and PPVe in the sublingual microcirculation (Mean±SD.n=30)

GroupTVD(vessels/mm2)PVD(vessels/mm2)PPVe(%)Beforeshock17.76±3.3412.78±3.0576.67±3.65Aftershock11.12±1.02*6.34±1.55*43.24±1.86*Afterfluidresuscitation16.74±2.09*#12.04±2.75*#68.13±3.13*#

*P<0.05vsbefore shock;#P<0.05vsafter shock.

3 小腸絨毛MFI與舌下微循環MFI變化程度的比較

休克后小腸絨毛MFI和舌下MFI較休克前均有顯著下降(P<0.01)。經液體復蘇至目標血壓后，小腸絨毛MFI與舌下微循環MFI較休克后增加(P<0.05)，但均未恢復至休克前水平。休克后絨毛微循環MFI的變化程度較舌下微循環MFI的變化程度大，但液體復蘇后，絨毛微循環MFI的變化程度較舌下微循環MFI的變化程度小，見表3。

表3 小腸絨毛MFI及舌下MFI的比較

Table 3.Comparison of MFI between small intestine villus and sublingual microcirculation (Mean±SD.n=30)

GroupMFIofsmallintestinevilliMFIofsublingualmicrocirculationBeforetheshock2.92±0.142.99±0.12Aftertheshock1.05±0.08*2.16±0.14*Afterfluidresuscitation1.97±0.11*#2.76±0.22*#

*P<0.05vsbefore shock;#P<0.05vsafter shock.

4 小腸絨毛和舌下微循環隨休克進展及液體復蘇過程的變化

休克尚未發生前，小腸絨毛微循環灌注血管充盈良好，小腸絨毛及舌下微循環內的微血管網內紅細胞流動狀態清晰可見，小腸絨毛結構完整無碎裂。休克發生后，隨MAP下降，小腸絨毛與舌下微循環灌注血管管徑變細，血流速度逐漸減慢、間歇停止甚至出現血液完全停止流動，灌注微血管數逐漸減少甚至消失。小腸絨毛腫脹程度迅速進展并繼之出現絨毛頂端碎裂且碎裂程度逐漸加重，最終絨毛結構完整性遭到完全破壞。經液體復蘇后，小腸絨毛及舌下微循環灌注較休克后改善，但舌下微循環灌注恢復優于同期小腸絨毛，但部分區域微血管灌注仍不均衡,小腸絨毛結構無恢復，見圖1。

討 論

微循環是指微動脈和微靜脈之間的血液循環，基本功能是進行新陳代謝及物質的交換[7]。它是直徑(diameter,D)小于100 μm脈管的總和，根據直徑不同分成小微血管(D<20 μm)、中微血管(20 μm≤D<50 μm)和大微血管(50 μm≤D<100 μm)。一個完善的微循環系統保障了全身器官的灌注。膿毒癥時的病理生理改變是以微循環障礙為主的全身炎癥反應。休克發生時，重要器官微循環血流灌注減少，引起缺血、缺氧，使微循環內皮細胞腫脹，微血管管壁通透性升高，組織水腫，氧攝取障礙逐漸加重，嚴重影響細胞的能量代謝，導致細胞功能障礙。因此，膿毒癥本質上也是一種微循環疾病[11]。

Figure 1.The changes of small intestine villus and sublingual microcirculation perfusion in the rabbits during endotoxic shock observed by SDF.

圖1 小腸絨毛微循環及舌下微循環在休克不同時期的變化

SDF成像數據分析為定量、半定量分析，圖像處理軟件進行半自主化血管識別以形成在活體組織拍攝基礎上更為清晰的血管圖像。參照2014年荷蘭圓桌會議推薦的小腸絨毛微循環參數評價系統[9]與2007年荷蘭圓桌會議推薦的舌下微循環參數系統[10]，要求每個觀測視野內必須包括3～10個絨毛便于分析，每個單個的、獨立的絨毛微循環為一個分析單元，分析時盡量計數每個單元內的微血管數、每個視野中絨毛微血管平均數，其中重點關注視野內每條微血管內的血流狀態即絨毛微血管血流指數：正常為連續流動狀態，計3分；低灌注為緩慢或間歇流動狀態，計2分；無流動狀態，計1分，據此量化視野內所有絨毛的平均MFI。灌注絨毛比例也可根據視野內正常流量(MFI=3)的絨毛數量與視野內可供分析的總的絨毛數量的比值×100%而獲得；絨毛邊界量化評分：邊界完整者計2分；邊界破壞<50%者計1分；邊界破壞>50%者計0分。舌下MFI與絨毛血流狀態量化方法相同。但因舌下微循環的圖像呈現的是一個平面，而反映絨毛微循環的圖像卻是一個三維立體呈現，基于這樣的差異，所以用于舌下微循環測量中的總的血管密度、灌注血管密度等指標則不推薦應用于腸道絨毛微循環的監測中。

本實驗通過建立內毒素休克模型，獲得了活體微循環觀測窗并利用SDF成像技術成功采集到高質量小腸絨毛及舌下微循環灌注圖像及視頻片段，觀察記錄到休克前、休克達標時及液體復蘇至目標血壓后的小腸絨毛及舌下微循環灌注情況，應用特定的定量、半定量及定性參數評價系統[9-10]，比較了液體復蘇前后對腸道微循環與舌下微循環灌注變化的異同。結果表明：休克尚未發生前，觀測到小腸絨毛的微循環灌注血管充盈良好，血流速度快，小腸絨毛及舌下微循環內的微血管網內紅細胞流動狀況清晰可見。注入內毒素后，隨著MAP下降，休克進展，小腸絨毛灌注血管管徑變細，血流速度逐漸減慢、間歇停止甚至出現血液停止流動，灌注微血管數逐漸減少甚至消失殆盡，PPVi迅速下降，小腸絨毛微循環灌注銳減。同樣的變化在舌下微循環中亦能觀察到。這與之前的一些研究膿毒癥及膿毒癥休克狀態下微循環改變的動物實驗或臨床研究的相關發現一致，例如：灌注血管密度的減少，血液流動狀態的改變(緩慢、間歇甚至停止流動)等[12-21]。另一方面從形態上觀察，休克未發生前，小腸絨毛結構完整無碎裂。隨休克進展，絨毛灌注微血管數明顯減少，小腸絨毛腫脹程度迅速進展并繼之出現絨毛頂端碎裂且碎裂程度逐漸加重，最終絨毛結構完整性遭到完全破壞。絨毛碎裂嚴重程度與MAP降低程度相關。

休克發生后，上述由灌注下降導致絨毛及舌下微循環內各種變化的原因可能與小腸與口腔頜面頸部的血液供應的解剖學構筑特點的不同、休克發生后對重要器官血流的2次分配以及腸絨毛與舌下微血管本身的異質性3種因素有關。口腔頜面頸部擁有充足的血液供應，而回腸的血液供應則主要來源為腸系膜上動脈，吻合血管網相對較少且需供應的器官組織較多。因此，舌及舌下與小腸血液供應的解剖學構筑特點的不同可能是造成兩者微循環灌注變化不同的一個重要因素。其次，休克早期，由于有效循環血量的減少，動脈血壓的降低，導致一系列壓力、體液調節機制發生，選擇性地收縮外周和內臟血管使循環血量重新分配，以達到保證心、腦等重要器官的有效灌注的目的。休克發生時，胃腸道、皮膚及骨骼肌等部位的血管首先收縮，尤以腸系膜上動脈阻力明顯增高[22]，血供顯著減少，因此成為休克后兩者微循環灌注變化不同的另一個重要因素。再次，腸絨毛微血管呈彎曲的線圈狀，其直徑在10 μm以下，尤其在血管彎曲的襻頂部分，血流速度較襻直部分更慢，而舌下微血管直而長且血管直徑普遍較絨毛微血管更大，當相同的病理狀態發生后，腸絨毛微血管的自身調節能力較舌下微血管更弱，更易受灌注血流減少的影響。這也可能是說明在休克早期，腸道功能會因灌注的改變而較早發生功能損傷的原因。

實驗中亦觀察到液體復蘇后絨毛微循環內灌注上升的變化低于舌下微循環。目前已證實膿毒癥性休克時，因血管內皮細胞損傷，多糖包被暴露，微血栓形成、毛細血管滲漏、白細胞滾動和紅細胞疊連，引起微循環血流異常，而內皮細胞的調節能力在此過程中起著核心作用。液體復蘇后腸絨毛及舌下微循環灌注恢復程度不同可能與休克時對腸絨毛微循環功能的影響及打擊更大以及絨毛微血管的自身調節能力較舌下微血管更弱等原因有關。

本實驗著眼于觀察分析活體動物內毒素休克時及液體復蘇至不同目標血壓后腸道絨毛及舌下微血管灌注的實時變化。研究表明，即使在相同的病理生理狀態下，不同器官組織之間微循環功能狀態可能存在差異，其變化特點仍需大量實驗研究揭示。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Changes of small intestine villus and sublingual microcirculation in rabbits during endotoxic shock observed by sidestream dark-field imaging

GAO Fei, FU Xiao-yun, QIAN Ming-jiang, ZHANG Yu, LI Guang-su, HU Jie

(DepartmentofCriticalCareMedicine,TheFirstAfiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail: 422318085@qq.com)

AIM: To investigate the changes of small intestine villus and sublingual microcirculation perfusion in the rabbits during endotoxic shock by sidestream dark-field imaging (SDF) after resuscitation to a mean arterial pressure (MAP) level.METHODS: New Zealand white rabbits (n=60) were randomly divided into 2 groups (group of villus and group of sublingua). The fistula operation of ileum was performed. Lipopolysaccharide was injected to establish endotoxic shock model, and fluid resuscitation (lactated Ringer’s solution, 30 mL·kg-1·h-1) was given to maitain the MAP of the animals to 80 mmHg. Continuous norepinephrine was intravenously injected at 0.5～1 μg·kg-1·min-1only if fluid therapy did not maintain the MAP level. The changes of microcirculatory perfusion indexes in small intestine villus and sublingual tissues such as vessels per villus (VV), microvascular flow index (MFI), proportion of perfused villi (PPVi), villus border score, villus vessel score, total vessel density (TVD), perfused vessel density (PVD) and proportion of perfused vessels (PPVe) were continuously observed and recorded by SDF before shock, during shock and after fluid resuscitation. RESULTS: MFI and PPVi in small intestine villus, and MFI, PPVe, TVD and PVD in sublingual tissues were significantly decreased after shock (P<0.01). Compared with MFI in sublingual microcirculation, MFI in villus was significantly decreased (P<0.01). MFI and PPVi in small intestine villus, and MFI, PPVe, TVD and PVD in sublingual tissues were improved after recovered to the target MAP by fluid resuscitation (P<0.05). However, MFI in small intestine villus was significantly lower than that in sublingual tissues after fluid resuscitation (P<0.01).CONCLUSION: The difference between small intestine villus and sublingual microcirculation perfusion during endotoxic shock is observed. The descent degree of microcirculation perfusion in small intestine villus is larger than that in sublingual tissues after shock, and the recovery degree of small intestine villus microcirculation is lower than that of sublingual microcirculation afer fluid resuscitation.

Sidestream dark-field imaging; Microcirculation; Endotoxic shock; Fluid resuscitation

1000- 4718(2017)04- 0764- 05

2016- 10- 14

2016- 12- 29

國家自然科學基金資助項目(No. 81560308)；貴州省科學技術基金資助項目(黔科合J字[2010]2180號)

R363; R515.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.032

△通訊作者 Tel: 0851-28608514; E-mail: 422318085@qq.com