缺血后處理增加脊髓miR-125b表達減輕大鼠脊髓缺血-再灌注損傷后神經元凋亡

李曉倩，陳鳳收，張再莉，馬 虹

·論著·

缺血后處理增加脊髓miR-125b表達減輕大鼠脊髓缺血-再灌注損傷后神經元凋亡

李曉倩，陳鳳收，張再莉，馬 虹*

目的 觀察缺血后處理(Ischemic postconditioning，IPC)對大鼠脊髓缺血再灌注損傷(Spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)后microRNA(miRNA，miR)-125b表達及下肢運動功能的影響。方法 45只SD大鼠平均隨機分為3組：假手術組(Sham組)、缺血-再灌注組(IR組)和缺血后處理組(IPC組)。Sham組僅暴露主動脈弓而不夾閉，其他各組夾閉主動脈弓14 min后再開放建立SCIRI模型。IPC組于再灌注5 min后給予5循環(huán)缺血后適應。再灌注后24 h，處死大鼠，提取脊髓組織，分別檢測脊髓組織濕/干重比(Wet-dry ratio，W/D)和總含水量(Total water content，TWC)，HE染色觀察脊髓組織病理學變化，qRT-PCR測定脊髓組織中miR-125b表達，TUNEL法檢測神經元凋亡數(shù)量(Apoptotic quantitiy，AQ)。結果 術后24 h，與Sham組比較，IR組大鼠脊髓W/D、TWC、AQ升高，脊髓組織中miR-125b表達下調(P<0.05)；與IR組比較，IPC組脊髓W/D、TWC、AQ降低，脊髓組織中miR-125b表達上調(P<0.05)。HE染色顯示，Sham組脊髓前角結構完好，可見大量胞核完整的運動神經元，IR組脊髓前角內大量空泡形成，神經元結構缺失，胞質呈嗜酸性，而IPC組脊髓前角存在部分結構正常的神經元。結論 缺血后處理可能通過上調脊髓組織中miR-125b的表達，減少脊髓組織前角運動神經元凋亡，從而改善大鼠SCIRI損傷。

凋亡；脊髓缺血-再灌注損傷；缺血后處理；microRNA

0 引言

胸心血管外科手術因術中需要短時阻斷腹主動脈、腰動脈等，可導致脊髓缺血再灌注損傷(Spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)，引起損傷平面以下感覺缺失和運動功能障礙，造成巨大的經濟和社會負擔[1]。研究表明，SCIRI后運動功能障礙的發(fā)生與前角運動神經元凋亡密切相關，減少神經元凋亡對改善SCIRI預后有重要意義[2-3]。microRNA (miRNA，miR)是約22 bp長的非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，調控多種生物學功能。其中miR-125b是一種具有缺氧誘導活性的miRNA，在缺血、缺氧等條件下異常表達，調節(jié)細胞凋亡和炎性反應[4]。缺血后處理(Ischemic postconditioning，IPC)是應用于再灌注早期的機械性干預措施，具有預知性和可控制性強的特點，臨床應用簡單、方便。IPC作用機制復雜，可通過抗炎、抗凋亡等多種途徑，在心、肝、腎等重要器官缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮保護作用[5-6]。目前，關于IPC能否在基因水平上特異性減輕SCIRI的研究甚少，因此，深入研究IPC對脊髓組織中miR表達的影響，對防治SCIRI有重要意義。故本研究以IPC對大鼠SCIRI模型進行干預，觀察脊髓組織中miR-125b表達的變化，以探討IPC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD成年大鼠45只，雄性，鼠齡6～8周，體重(200±20) g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。RWD407小動物呼吸機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；PCR反應儀(日本Bioer公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海圣科儀器設備有限公司)；光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；PrimeScriptTM反轉錄試劑盒；組織細胞凋亡熒光原位試劑盒(上海潤成生物科技有限公司)；其余均為市售分析純。

1.2 動物模型制備和分組 隨機數(shù)字表法隨機分為假手術組(Sham組)、IR組和缺血后處理組(IPC組)，每組15只。按照文獻[7]報道制備模型。水合氯醛腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，右側臥位，沿肋緣切口暴露心包，分離主動脈至與左鎖骨上動脈發(fā)出處上無創(chuàng)動脈夾夾閉14 min，即為缺血期；之后撤除動脈夾，形成再灌注期。逐層縫合傷口，腹腔注射0.3 mL氨芐青霉素(100 mg/mL)。Sham組只開胸不夾閉主動脈弓，IPC組再灌注5 min后，給予5循環(huán)缺血后適應(阻斷腹主動脈1 min/開放1 min為1個循環(huán))，遠端血壓控制在45～55 mmHg，其余步驟同IR組。術后24 h注射過量麻醉藥處死大鼠，留取L4～6節(jié)段脊髓組織。

1.3 大鼠脊髓組織濕/干重比(Wet-dry ratio，W/D)和總脊髓含水量(Total water content，TWC) 留取的脊髓組織用生理鹽水充分漂洗，濾紙吸干多余水分，稱重為濕重(W)；70 ℃下24 h烘干后稱重為干重(D)，兩者之比為W/D；TWC(%)=(W-D)/D×100%。

1.4 光鏡檢測大鼠脊髓前角運動神經元形態(tài)和數(shù)量變化 取 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小脊髓組織，經4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色后，采用光學顯微鏡觀察(100×，400×)，計數(shù)脊髓前角正常神經元數(shù)目。

1.5 大鼠脊髓組織細胞凋亡熒光原位檢測 采用原位缺口末端標記法(TUNEL)，按照試劑盒說明操作。熒光顯微鏡下細胞核中有綠色熒光者為陽性細胞。計數(shù)5個高倍鏡視野(100×)下的凋亡細胞數(shù)量(Apoptotic quantitiy，AQ)。

1.6 qRT-PCR法檢測大鼠脊髓組織miR-125b的表達變化 用miRNeasy mini試劑盒提取IR組和IPC組的脊髓組織miRNA。按照說明書將miR-125b反轉錄后行FQ-PCR。miR-125b檢測系統(tǒng)為StepOneTMSoftware v2.0，內參為U6。反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s；循環(huán)數(shù)為40次。Sham組脊髓組織作為對照，ΔΔCt=[Ct實驗組-Ct實驗組U6]-[Ct對照組-Ct對照組U6]。以2-ΔΔCt值表示miR-125b的相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠脊髓組織濕/干重比(W/D)和總脊髓含水量(TWC)比較 損傷后24 h，與Sham組比較，IR組脊髓組織W/D、TWC均升高(P<0.05)。與IR組比較，IPC組脊髓組織W/D、TWC均降低(P<0.05)，見表1。

2.2 各組大鼠脊髓組織形態(tài)學的比較 光鏡下，Sham組大鼠脊髓前角結構完好，可見大量結構正常，胞質內含顆粒狀尼氏體，胞核完整的運動神經元；與Sham組比較，IR組脊髓前角內神經元結構缺失，灰質內有大量空泡形成，胞質呈嗜酸性，而IPC組脊髓灰質結構相對完好，前角存在部分結構正常的神經元。見圖1。

同時，計數(shù)脊髓灰質前角內健存運動神經元數(shù)量顯示，損傷后24 h，與Sham組比較，IR組前角內健存運動神經元數(shù)量(Number，N)明顯減少(P<0.05)；與IR組相比，IPC組前角內健存運動神經元數(shù)量明顯增多(P<0.05)。見表1。

表1 再灌注后24 h各組脊髓組織濕/干重比(W/D)、總脊髓含水量(TWC)、正常(N)和凋亡 神經元(AQ)數(shù)量和miR-125b表達的變化(n=15)

注：*與Sham組比較，P<0.05；#與IPC組比較，P<0.05

圖1 再灌注后24 h各組大鼠脊髓組織形態(tài)學變化(100×，400×)

2.3 TUNEL法檢測大鼠脊髓組織神經元凋亡數(shù)量的比較 TUNEL法熒光染色時，可以在515～565 nm激發(fā)波長下熒光顯微鏡觀察出鮮艷光亮的綠色熒光。損傷后24 h，Sham組幾乎沒有綠色熒光；IR組可見脊髓前角灰質內有大量綠色并呈神經元樣細胞形態(tài)的熒光團，即TUNEL陽性細胞；與IR組相比，IPC組損傷后綠色的熒光強度和數(shù)量明顯減少(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 再灌注后24 h后TUNEL法觀察各組大鼠脊髓組織 神經元凋亡變化(100×)

2.4 各組大鼠脊髓組織miR-125b表達的比較 qRT-PCR結果顯示，損傷后24 h，與Sham組比較，IR組脊髓組織miR-125b表達明顯下調(P<0.05)；與IR組比較，IPC組脊髓組織miR-125b表達明顯上調(P<0.05)。見表1。

3 討論

SCIRI后運動功能障礙是最難以預測和最為嚴重的并發(fā)癥之一[1]，其機制復雜，探尋能夠有效用于臨床預防和治療SCIRI的藥物或措施已成為該領域的熱門課題[7]。IPC即在缺血后立即給予幾個短暫的灌注再缺血的循環(huán)處理，最先在心臟的缺血再灌注損傷中被證明有保護作用[5-6]。隨著認識的不斷深入，學者對IPC的研究已不局限于心肌保護，發(fā)現(xiàn)IPC可能通過抗炎、抗凋亡等多途徑發(fā)揮神經保護作用，并確定再灌注開始的數(shù)分鐘是保護作用的關鍵，具有更好的臨床應用前景[6，8-9]。

miRNA通過與靶基因mRNA特異性結合，對細胞內多種基因進行負性調控，嚴格調控神經細胞的分化，影響神經系統(tǒng)的發(fā)育和功能，成為近年來研究的熱點[2,10]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在缺血缺氧等病理狀態(tài)下，一些miRNAs表達也迅速發(fā)生變化，其不僅在上游對神經元凋亡、自噬等相關分子信號途徑進行調控，對中下游炎癥反應、膠質細胞增殖也產生了廣泛的影響[11-12]。miR-125b作為心肌缺血調控網絡的重要成員之一，上調其表達，可以有效抑制心肌細胞凋亡、NF-κB激活以及下游炎性因子釋放[4]。同時，miR-125b在脊髓中呈特異性表達或高度分布[13]。本研究結果顯示，損傷后24 h，與Sham組比較，IR組大鼠脊髓組織miR-125b表達明顯下降，而IPC處理后，大鼠脊髓組織中的miR-125b表達上調，提示miR-125b參與調節(jié)SCIRI，與Chawla等[4,14]的研究結果一致。

SCIRI后脊髓水腫、運動神經元凋亡，是臨床出現(xiàn)損傷平面以下運動缺失為主的神經功能障礙的重要原因[8]。本研究結果證實，SCIRI模型中，損傷后24 h與Sham組相比，IR組大鼠脊髓組織明顯腫脹，W/D、TLW含量增加，病理學檢查可見損傷區(qū)脊髓前角正常運動神經元數(shù)目明顯下降，TUNEL提示凋亡神經元數(shù)目上升；而給予IPC處理后，脊髓組織中W/D、TLW下降，病理學檢查提示脊髓損傷形態(tài)減輕，凋亡神經元數(shù)量明顯減少。上述變化與SCIRI后脊髓組織中miR-125b的變化趨勢一致，其機制可能與SCIRI后抑制氧化應激、激活炎性反應所誘發(fā)的miR-125b表達下調有關，而IPC可對抗上述病理變化、增加miR-125b表達，從多種途徑綜合減輕脊髓水腫和神經元凋亡[4,9-10]。因此，IPC在miRNA水平上對SCIRI的保護機制僅是其中一個環(huán)節(jié)，綜合多因素進行干預才能獲得最佳的SCIRI治療效果。

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Ischemic postconditioning alleviates neuronal apoptosis after spinal cord ischemia reperfusion injury by increasing spinal microRNA-125b expression in rats

LI Xiao-qian,CHEN Feng-shou,ZHANG Zai-li,MA Hong*

(Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

Objective To observe the effects of ischemic postconditioning (IPC) on expressions of microRNA (miRNA,miR)-125b and lower limb motor function after spinal cord ischemia reperfusion injury (SCIRI) in rats.Methods Forty-five rats were divided into three groups:sham group (n=15),IR group (n=15),and IPC group (n=15).Aortic arch was only exposed but not occluded in rats of sham group.SCIRI was established by aortic arch occlusion for 14 min.IPC was induced by 5 cycles of ischemic adaptation at 5 min after reperfusion.At 24 h after reperfusion,spinal cord was extracted to determine the spinal wet-dry ratio (W/D) and total water content (TWC).Changes of spinal morphology and neuronal apoptotic quantitiy (AQ) were detected by HE and TUNEL staining,respectively.miR-125b expression was assessed by qRT-PCR.Results Compared with sham group,rats in IR group and IPC group had significantly higher W/D,TWC and AQ,but lower miR-125b expression at 24 h after SCIRI (P<0.05).Compared with IR group,rats in IPC group had lower W/D,TWC and AQ,but higher miR-125b expression (P<0.05).As showed in represented HE staining,the neuronal morphologies in sham group were intact with integrated nucleus.But in IR group,a large number of vacuoles and absent of structure were formed in neurons of anterior horn,and the cytoplasm was eosinophilic.There were still some neurons with normal structure left in IPC group.Conclusion Ischemic postconditioning can decrease the neuronal apoptosis in anterior horn and further alleviate SCIRI by increasing the spinal miR-125b expression

Apoptosis;Spinal cord ischemia reperfusion injury;Ischemic postconditioning;microRNA

2016-10-12

中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽 110001

國家自然科學基金項目(81601053、81401000)；遼寧省教育廳科學技術研究項目(LK201636)；遼寧省博士科研啟動基金項目(20141035)

10.14053/j.cnki.ppcr.201704001

*通信作者