LC-MS/MS快速測定人血漿中氯沙坦濃度及其生物等效性研究

黃 明，張全英，宗順麟

LC-MS/MS快速測定人血漿中氯沙坦濃度及其生物等效性研究

黃 明，張全英*，宗順麟

目的 建立人血漿中氯沙坦LC-MS/MS測定方法，計算氯沙坦人體藥動學參數并評價兩制劑生物等效性。方法 采用單劑量雙周期交叉試驗設計，完成試驗的23例受試者空腹口服受試或參比制劑氯沙坦鉀片100 mg后，用甲醇一步沉淀血漿蛋白，并用LC-MS/MS法測定人血漿中氯沙坦濃度。用DAS 3.2.3軟件計算氯沙坦人體藥動學參數，并評價兩制劑生物等效性。結果 服用受試和參比制劑后，血漿中氯沙坦的Cmax分別為(697.3±301.7)和(674.1±350.5) ng/mL，AUC0-12 h分別為(994±240)和(1 005±287)ng·h/mL，tmax分別為(1.23±0.38)和(1.37±0.75) h，t1/2分別為(2.04±0.28)和(2.00±0.40)h，生物利用度為102.4%±21.1%。結論 建立的分析測試方法靈敏、簡便、準確，受試制劑與參比制劑生物等效。

氯沙坦；高效液相-串聯質譜方法；藥動學；生物等效性

0 引言

氯沙坦鉀(Losartan potassium)是非肽類血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，可競爭性抑制AT1受體，降低血管阻力，具有良好的抗高血壓作用，主要用于高血壓的治療[1]。國內外文獻報道測定人血漿中氯沙坦濃度的方法有HPLC法、LC-MS法和LC-MS/MS法。血漿樣品前處理方法有：①液液萃取法[2-7]：樣品經提取、吹干、復溶等步驟后測定，操作繁瑣且提取回收率不高。②在線固相萃取法[8]：可獲得更干凈的樣品，但是流動相中含有的三乙胺具有離子淬滅作用，且整套系統價格昂貴。③蛋白沉淀法[9]：樣品經乙腈沉淀蛋白，檢測方法最低定量限為3.000 ng/mL。本研究建立了甲醇一步沉淀蛋白法處理氯沙坦血漿樣品，檢測方法最低定量限為1.000 ng/mL，低于文獻報道[2-10]，可用于氯沙坦鉀片一致性評價研究。

1 材料

1.1 儀器與試劑 液質聯用儀：API-4000三重四極桿串聯質譜儀，美國AB Sciex公司；Agilent1200高效液相色譜儀，主要包含真空脫氣機、四元輸液泵、自動進樣器、恒溫器和柱溫箱，美國Agilent公司；數據處理系統為Analyst 1.4.2，AB Sciex公司。分析天平：XS 105DU型(Max2=41 g，d2=0.01 mg)，瑞士METTLER TOLEDO公司。低溫高速離心機：Heraeus Biofuge Stratos，德國Thermo公司。渦旋混合器：Vortex Genie-2，美國Scientific Industries公司。純水機：Milli-Q，美國MILLIPORE公司。甲醇和甲酸：HPLC級，TEDIA COMPANY。乙酸銨：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。水：滅菌注射用水，安徽雙鶴藥業有限責任公司。空白血漿來自健康志愿者。

1.2 試驗藥物和對照品 氯沙坦鉀片(受試制劑，批號：31112002，規格100 mg/片)由浙江某制藥有限公司生產。氯沙坦鉀片(參比制劑，科素亞?，批號：120281，規格100 mg/片)由杭州默沙東制藥有限公司生產。氯沙坦鉀對照品(批號：100597-200501，分子量461.01，氯沙坦分子量422.91，純度100.0%)購自中國食品藥品檢定研究院。內標厄貝沙坦對照品(批號：201111-8，純度100.0%)由浙江某制藥有限公司生產。

2 方法

2.1 色譜、質譜條件 色譜條件：保護柱：Phenomenex Security GuardTMC18(4 mm×3.0 mm)；色譜柱：WATERS公司Xterra?RP18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流動相：甲醇-10 mmoL/L乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸)=66∶34(v/v)；流速900 μL/min；分析時間7.0 min；進樣量20 μL；柱溫30 ℃。

質譜條件:電噴霧(ESI)離子源，正離子電離模式，霧化氣50 psi，加熱輔助氣60 psi，離子源溫度650 ℃，噴霧電壓4 500 V；采用多反應監測(MRM)，氯沙坦檢測離子對m/z423.2→207.0，去簇電壓(DP) 60 V，射入電壓(EP) 10 V，碰撞能量(CE) 31 V，碰撞室射出電壓(CXP) 5 V。內標厄貝沙坦檢測離子對m/z429.3→207.0，去簇電壓(DP) 70 V，射入電壓(EP) 10 V，碰撞能量(CE) 30 V，碰撞室射出電壓(CXP) 15 V。

2.2 工作液配制 氯沙坦標準曲線儲備液及工作液：稱量氯沙坦鉀對照品10.90 mg(相當于氯沙坦 10.00 mg)于10 mL量瓶用甲醇定容，混勻得1.000 mg/mL的氯沙坦標準曲線儲備液，用甲醇稀釋，得濃度為0.020 00、0.060 00、0.200 0、0.600 0、2.000、6.000、20.00、30.00 μg/mL的標準曲線系列工作液。

氯沙坦質控儲備液及工作液：稱量氯沙坦鉀對照品10.90 mg(相當于氯沙坦10.00 mg)于10 mL量瓶用甲醇定容，混勻得1.000 mg/mL的氯沙坦質控儲備液，用甲醇稀釋得濃度為0.040 00、1.200、24.00 μg/mL的質控工作液。

內標厄貝沙坦儲備液及工作液：稱量厄貝沙坦對照品10.00 mg于10 mL量瓶用甲醇定容，混勻得1.000 mg/mL的內標厄貝沙坦儲備液，并于100 mL量瓶用甲醇稀釋得0.100 0 μg/mL的內標厄貝沙坦工作液。

2.3 血漿樣品前處理 取血漿樣品200 μL置1.5 mL離心管中，加入內標厄貝沙坦工作液50 μL，混勻，加甲醇600 μL沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，于4 ℃、23 755×g高速離心10 min。離心完畢后取上清液400 μL置進樣瓶中，加入水相200 μL，混勻后，置于自動進樣器中進樣測定氯沙坦濃度。

2.4 人體藥代動力學與生物等效性臨床試驗設計 臨床試驗方案經蘇州大學附屬第二醫院倫理委員會批準。24例男性受試者均簽署知情同意書，體重指數均在19～24 kg/m2范圍內，心電圖正常，肝、腎功能正常，均符合受試者入選標準。采用隨機、雙周期交叉試驗設計。參加試驗的24位受試者隨機分成2組，每組12例，分別于2個周期試驗當日空腹口服受試或參比制劑1片，250 mL溫開水送服，清洗期為1周。于服藥前和服藥后0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h由肘靜脈取血3 mL。所有血漿樣品置肝素化采血管中，離心(2 304×g，4 ℃，5 min)，分離上層血漿，于-30 ℃冰箱中保存，待測。用DAS 3.2.3軟件計算藥動學參數，并評價受試與參比制劑的生物等效性。

3 結果

3.1 特異性 分別取氯沙坦對照品溶液、厄貝沙坦對照品溶液、空白血漿按“2.3”項方法操作后樣品，空白血漿190 μL和氯沙坦對照品溶液(2.000 μg/mL)10 μL混勻后按“2.3”項方法操作后樣品，受試者口服氯沙坦鉀片100 mg后 0.5 h的血漿按“2.3”項方法操作后樣品，進樣測定。結果顯示，在本實驗條件下，氯沙坦的保留時間約3.59 min，內標厄貝沙坦的保留時間為4.34 min左右，內源性物質不干擾氯沙坦和內標厄貝沙坦的測定，見圖1。

3.2 標準曲線與最低定量限 取空白血漿190 μL，分別加入氯沙坦標準曲線工作液10 μL，制備成血漿中氯沙坦濃度為1.000、3.000、10.00、30.00、100.0、300.0、1 000、1 500 ng/mL的標準曲線血漿樣品，按“2.3”項方法操作，進行測定，記錄色譜圖，以氯沙坦濃度C為橫坐標，氯沙坦峰面積As與內標厄貝沙坦峰面積Ai比值f為縱坐標，進行線性回歸(權重系數為1/C2)。回歸方程為f=0.009 1 C-0.000 011 3，r=0.999 4。結果表明，氯沙坦線性范圍為1.000～1 500 ng/mL，最低定量限LLOQ為1.000 ng/mL。

圖1 血漿中氯沙坦的LC-MS/MS圖

注：A.氯沙坦對照品溶液(100.0 ng/mL),B.厄貝沙坦對照品溶液(25.00 ng/mL),C.空白血漿,D.空白血漿190 μL和氯沙坦對照品溶

液(2.000 μg/mL)10 μL混勻后按“2.3”項方法操作后樣品(血漿含氯沙坦100.0 ng/mL),E.受試者口服氯沙坦鉀片100 mg后0.5 h的

血漿按“2.3”項方法操作后樣品(血漿含氯沙坦262.4 ng/mL)

3.3 精密度與準確度 取空白血漿190 μL，分別加入氯沙坦最低定量限和質控工作液10 μL，制備成血漿中氯沙坦濃度分別為1.000 ng/mL的最低定量限樣品和2.000、60.00、1 200 ng/mL的質控樣品，每個濃度6個樣品，按“2.3”項方法操作，測定3批，根據每批隨行標準曲線，計算每個樣品的實測濃度，用Excel軟件單因素方差分析計算批內和批間精密度，同時計算每個樣品的相對偏差，結果顯示，最低定量限樣品批內和批間RSD均小于20%，RE均在±20%范圍內。低、中、高3個濃度質控樣品批內和批間RSD均<15%，RE均在±15%范圍內。

3.4 提取回收率 按精密度與準確度的實驗方法制備含氯沙坦濃度分別為2.000、60.00、1 200 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項操作，以其進樣得到的峰面積除以空白血漿經蛋白沉淀后，直接加入低、中、高氯沙坦質控系列工作液及內標厄貝沙坦工作液后進樣得到的峰面積，計算血漿中氯沙坦和內標厄貝沙坦的提取回收率。血漿中氯沙坦低、中、高濃度的提取回收率分別為107.8%±5.5%、103.1%±3.0%和103.5%±4.2%；厄貝沙坦的提取回收率為101.2%±1.7%。

3.5 基質效應 取6個不同來源的空白血漿190 μL置1.5 mL離心管中，分別加入甲醇600 μL沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，4 ℃離心(23 755×g)10 min，取空白上清液700 μL作為血漿基質；另取純化水190 μL置離心管中，同法處理得對照基質。分別取血漿基質和對照基質700 μL，加入氯沙坦質控工作液10 μL和內標厄貝沙坦工作液50 μL，混勻，吸取400 μL該混勻溶液樣品置進樣瓶中，加入水相200 μL，混勻。上述樣本每個濃度取6份，按“2.1”項下色譜條件及質譜條件測定，獲得氯沙坦和內標厄貝沙坦峰面積，根據每一濃度樣本2種基質中的峰面積比值計算基質效應。血漿中氯沙坦低、中、高濃度的基質效應分別為97.6%±3.7%、97.0%±1.1%和100.2%±4.2%；厄貝沙坦的基質效應為98.2%±2.0%。

3.6 穩定性 按“3.3”項下方法，分別制備低、中、高3個濃度質控血漿樣品，各15份，每個濃度各取3份分別進行如下考察：①-30 ℃反復凍融3次；②-30 ℃冰凍保存35 d；③室溫放置6 h；④待測樣品于自動進樣器4 ℃放置22 h；⑤血漿蛋白沉淀離心后，上清液樣品室溫放置6 h。按“2.3”項下方法處理后進樣測定(除條件④直接進樣測定，條件⑤吸取上清液400 μL和水相200 μL混勻)。所有血漿樣品實測濃度的RE均在±15%范圍內，RSD≤15%。結果顯示，氯沙坦血漿樣品-30 ℃反復凍融3次、-30 ℃冰凍保存35 d和室溫放置6 h，待測樣品于自動進樣器4 ℃放置22 h，血漿蛋白沉淀離心后,上清液樣品室溫放置6 h情況下均穩定。本實驗亦考察了氯沙坦和內標厄貝沙坦儲備液的穩定性。結果顯示，室溫放置6 h和2～8 ℃冷藏9 d情況下，氯沙坦和內標厄貝沙坦儲備液均穩定。

3.7 生物等效性評價 完成試驗的23例受試者口服受試和參比制劑氯沙坦鉀片后氯沙坦的平均血藥濃度-時間曲線見圖2，主要藥動學參數見表1。Cmax幾何均值比90%置信區間為88.6%～128.0%，AUC0-12 h為95.1%～106.1%，AUC0-∞為95.0%～105.9%。以上結果符合《中華人民共和國藥典(2010版)》相關要求(Cmax在75%～133%范圍，且AUC在80%～125%范圍)，因此，判定受試制劑氯沙坦鉀片(100 mg)與參比制劑氯沙坦鉀片(科素亞?，100 mg)生物等效。

圖2 單劑量分別口服受試和參比制劑后氯沙坦的平均 血藥濃度-時間曲線表1 單劑量口服受試和參比制劑后氯沙坦的主要 藥動學參數

藥動學參數受試制劑參比制劑t1/2(h)2.04±0.282.00±0.40tmax(h)1.23±0.381.37±0.75Cmax(ng/mL)697.3±301.7674.1±350.5AUC0-12h(ng·h/mL)994±2401005±287AUC0-∞(ng·h/mL)1002±2401014±289CL/F(L/h)104.7±22.4107.0±33.5Vd(L)308.9±87.3306.0±103.1F(%)102.4±21.1

4 討論

本研究對色譜和質譜條件進行了優化考察，水相中加入乙酸銨，有利于氯沙坦和內標峰形的改善，未加入醋酸銨，色譜峰拖尾嚴重。另外,選擇0.2%甲酸時,待測物的響應較高且保留時間適中。血漿樣品沉淀蛋白，離心后，取上清液400 μL，并加入水相200 μL，是為了將進樣樣品中水的比例提高至接近流動相的比例，防止發生二次化學平衡現象，改善峰形。同時，上清液中加入水相，進樣測定樣品含有的血漿內源性基質相對減少，避免了基質效應。

本研究建立的LC-MS/MS法測定人血漿中氯沙坦濃度，特異性高，測定時間短，另外采用甲醇一步沉淀蛋白的血漿樣品前處理方法，操作簡單快捷，發揮了LC-MS/MS法的快速定量優勢，可用于氯沙坦鉀片一致性評價研究。

本研究中，受試和參比制劑的主要藥動學參數t1/2和tmax與文獻[2-7,10]基本一致，Cmax、AUC0-∞與文獻[7,10]基本一致。Cmax90%置信區間為88.6%～128.0%，不在2015版藥典要求的80.00%～125.00%范圍內。若以2015版藥典為判定標準，則無法判定兩制劑生物等效，由此看來，我國生物等效性的評價標準已經提高，與歐美國家標準同步。

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Rapid determination of losartan in human plasma by LC-MS/MS and study on its bioequivalence

HUANG Ming,ZHANG Quan-ying*,ZONG Shun-lin

(Clinical Pharmacology Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China)

Objective To establish an LC-MS/MS method for the determination of losartan in human plasma,and evaluate the bioequivalence of losartan potassium tablet in healthy volunteers.Methods A single oral dose of test and reference formulations was given to 23 healthy male volunteers according to a randomized crossover design.Plasma concentration was determined by LC-MS/MS after deproteinized with methanol.The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 3.2.3.Results The main pharmacokinetic parameters of losartan in test and reference preparations were as follows:Cmax(697.3±301.7) and (674.1±350.5) ng/mL,AUC0-12 h(994±240) and (1 005±287) ng·h/mL,tmax(1.23±0.38) and (1.37±0.75) h,t1/2(2.04±0.28) and (2.00±0.40) h,respectively.The relative bioavailability of test formulations was 102.4%±21.1%.Conclusion LC-MS/MS method is proved to be sensitive,convenient and accurate.Losartan potassium tablet is bioequivalent to the reference tablet.

Losartan;LC-MS/MS;Pharmacokinetics;Bioequivalence

2016-08-17

蘇州大學附屬第二醫院臨床藥理實驗室，江蘇 蘇州 215004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201704021