Xpert MTB/RIF技術在骨關節結核臨床診斷中的應用研究

董偉杰 秦世炳 蘭汀隆 范俊 唐愷 李元 嚴廣璇 王桂榮 黃海榮

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·論著·

Xpert MTB/RIF技術在骨關節結核臨床診斷中的應用研究

董偉杰 秦世炳 蘭汀隆 范俊 唐愷 李元 嚴廣璇 王桂榮 黃海榮

目的 評價利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(GeneXpert MTB/RIF，簡稱“Xpert技術”)快速診斷骨關節結核及其耐藥性的臨床應用價值。方法 2015年11月至2016年10月連續收集首都醫科大學附屬北京胸科醫院的272例疑似骨關節結核患者的病灶標本，每份標本行涂片抗酸桿菌檢查、BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養、羅氏培養和Xpert技術檢測；羅氏培養陽性的結核分枝桿菌行絕對濃度法藥物敏感性試驗(DST)檢測。以臨床診斷參考標準(CRS)為金標準，評價涂片抗酸桿菌檢查、BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養、羅氏培養和Xpert技術檢測骨關節結核病灶標本中結核分枝桿菌感染的敏感度和特異度。以DST為金標準，評價Xpert技術檢測病灶標本中結核分枝桿菌利福平耐藥性的敏感度和特異度。結果 以CRS為金標準，涂片抗酸桿菌檢查、BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養、羅氏培養和Xpert技術檢測的敏感度分別為23.90%(60/251)、47.81%(120/251)、25.50%(64/251)和78.09%(196/251)；21例非骨關節結核患者標本中4種技術檢測結果均為陰性。以DST為金標準，17例對利福平耐藥的標本中，Xpert技術檢測利福平耐藥全部陽性。結論 Xpert技術檢測骨關節結核標本中結核分枝桿菌的敏感度和特異度高，并且可同時檢測結核分枝桿菌對利福平是否耐藥，值得推薦用于臨床早期診斷骨關節結核。

結核,骨關節； 核酸擴增技術； 診斷技術和方法； 抗藥性； 評價研究

在21世紀，結核病仍然是一個威脅全球公共衛生安全的嚴重問題，對結核病進行及時準確的早期診斷對控制結核病疫情至關重要。肺外結核是指結核分枝桿菌通過呼吸系統感染而使人患肺結核，由肺部病變通過血液或淋巴系統播散到人體的各個臟器，發生在肺部以外任何解剖部位的結核病。在中國，肺外結核患者約占全部結核病患者的10%～20%，骨關節結核約占肺外結核患者的11.3%～34.5%[1]。骨關節結核病變組織由于處于循環終末端，病灶中結核分枝桿菌數量少，加之脊柱等深部病灶病變組織直接獲取困難，傳統的培養及涂片法面臨陽性率低、時效性差等劣勢，直至目前骨關節結核的早期診斷仍然面臨挑戰。

2010年由美國的Cepheid公司研發的利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert技術”)問世，并在秘魯、南非、阿塞拜疆及印度的肺結核多中心試驗中進行了驗證[2]，同年即得到WHO的推薦應用于肺結核的快速診斷[3]。2013年WHO又推薦Xpert技術應用于肺外結核的診斷，但以淋巴結結核、結核性胸膜炎及結核性腦膜炎為主[4]。Xpert技術作為全球第一套全自動一體化半巢式熒光PCR檢測系統，以rpoB基因為靶基因，將PCR檢測的3個步驟(樣品準備、DNA擴增和檢測)集成于一體。該技術在專有的反應盒中完成核酸提取、擴增與熒光檢測，通過檢測rpoB基因是否突變來判斷對利福平是否耐藥，在100 min內即可報告結核分枝桿菌復合群是否感染和對利福平的耐藥情況。

由于骨關節結核發病率低，以脊柱結核危害最大，標本獲取的便利性和量均受限，Xpert技術用于骨關節結核臨床診斷中的國內國外可借鑒的數據較少。為探討Xpert技術在骨關節結核早期診斷中的可行性，本研究通過對Xpert技術與羅氏培養及BACTEC MGIT 960檢測結果的對比，就Xpert技術的診斷敏感度和特異度進行分析。

對象和方法

一、 研究對象

選取2015年11月至2016年10月期間，首都醫科大學附屬北京胸科醫院骨科收治的疑似骨關節結核患者272例。男137例，女135例；中位年齡為42歲(15～76歲)。根據臨床診斷標準分為骨關節結核組251例和非骨關節結核組21例。骨關節結核組診斷脊柱結核者171例，診斷關節結核者80例。所有患者通過手術或穿刺獲得至少4 ml的膿液或組織標本，然后進行涂片抗酸桿菌檢查、BACTEC MGIT 960、羅氏培養、藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)和Xpert技術檢測。

二、 試驗方法

1.標本處理：膿液標本依照N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-氫氧化鈉法進行標本處理[5]。干酪、肉芽及死骨組織在加入適量磷酸鹽緩沖液后，應用微型研磨器Fast-prep-24(美國MP Biomeidcals公司)進行勻漿，之后直接接種[6]。

2.涂片抗酸桿菌檢查：按照文獻[7]中的標準化操作程序執行。

3. BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養：取2 ml標本用于培養，嚴格按照BACTEC MGIT 960系統操作說明書進行，培養時間設定為42 d。儀器報告陽性后，取培養液進行涂片鏡檢，若查到抗酸桿菌則為陽性；若未見抗酸桿菌則為陰性。

4.羅氏培養：接種后的改良羅氏培養基置于37 ℃環境下進行分枝桿菌培養，每周檢查1次細菌的生長狀態，直至有菌落生長為止。以結核分枝桿菌標準株H37Rv作為陽性對照，以空白管作為陰性對照[5]。

5.絕對濃度法藥敏試驗：按照中國防癆協會基礎專業委員會制定的《結核病診斷實驗室檢驗規程》[5]進行。

6. Xpert技術檢測：按照Xpert MTB/RIF操作說明書進行。取1 ml標本于有螺旋蓋的無菌管中，然后加入2 ml 標本處理液，旋緊管蓋，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10 s，室溫靜置10 min，在渦旋振蕩器上再次渦旋振蕩10 s，室溫靜置5 min，使標本充分液化。吸取2 ml 液化標本至Xpert反應試劑盒，然后將反應試劑盒放置到檢測模塊，儀器開始進行自動化檢測。反應結束后，在檢測系統窗口下可直接觀察測試結果。

三、 臨床診斷標準

[8]中關于骨關節結核診斷的指導意見，本研究臨床診斷為骨關節結核標準為：(1)患者臨床癥狀、體征與影像學(包括X線攝影、CT及MRI檢查)發現的局部結核病的膿腫、死骨表現相符；(2)病灶標本的病理學提示為干酪樣壞死并為朗罕細胞肉芽腫；(3)病灶標本的微生物學檢測證實為結核分枝桿菌感染；(4)規律抗結核藥物治療6個月以上，結核中毒癥狀及局部癥狀消失。以上全部符合診斷為骨關節結核。

四、統計學分析

采用Excel 2010軟件收集試驗數據，應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。以臨床診斷標準作為金標準，計算涂片抗酸桿菌檢查、BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養、羅氏培養和Xpert技術檢測標本中結核分枝桿菌的敏感度和特異度及95%CI。敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%，特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%。

結 果

一、 各種方法檢測MTB的比較

細菌學檢測結果：272例患者病灶標本中，按照臨床診斷標準分為骨關節結核組251例，非骨關節結核組為21例。涂片抗酸染色檢查陽性60例(23.90%)，95%CI為18.80%～29.70%；陰性21例(100.00%)，95%CI為83.90%～100.00%。BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養陽性120例(47.81%)，95%CI為41.50%～54.20%；陰性21例(100.00%)，95%CI為83.90%～100.00%。羅氏培養陽性64例(25.50%)，95%CI為20.20%～31.40%；陰性21例(100.00%)，95%CI為83.90%～100.00%。Xpert技術檢測陽性為196例(78.09%)，95%CI為72.50%～83.00%，陰性21例(100.00%)，95%CI為83.90%～100.00%(表1)。120例患者的標本進行BACTEC MGIT 960培養陽性者，經菌種鑒定均為MTB感染。

表1 各種檢測方法診斷骨關節結核的敏感度和特異度

注 表中括號外數值為“敏感度(%)”或“特異度(%)”；“敏感度”括號內數值分子為真陽性數，分母為真陽性數+假陰性數；“特異度”括號內數值分子為真陰性數，分母為真陰性數+假陽性數

二、 Xpert技術與絕對濃度法藥敏試驗檢測利福平耐藥性的比較

羅氏培養陽性的64例患者標本中，9例因標本量未做藥敏試驗，采用絕對濃度法藥敏試驗檢測結果對利福平耐藥者有17例，證實為MDR-TB者有9例。196例Xpert技術檢測陽性的患者中，rpoB基因突變的患者有29例。以絕對濃度法藥敏試驗為金標準，檢測結果對利福平耐藥的17例患者中，Xpert技術檢測均存在rpoB基因突變。

討 論

一、 Xpert技術快速檢測對臨床的應用價值

抗酸染色涂片、BACTEC MGIT 960液體培養及羅氏培養等傳統技術診斷骨關節結核的敏感度在本研究中不超過50.00%，抗酸染色涂片結果回報時間為1～2 d，BACTEC MGIT 960液體培養技術結果回報時間為2周左右，羅氏培養結果回報時間為3～4周，如果加上藥敏試驗，回報時間為6～8周[9]，在科學技術不斷進步的現代社會，明顯不能適應臨床需求。傳統PCR技術由于假陽性的問題在21世紀初曾被禁用，隨著2010年Xpert技術在結核病診斷中的應用，這種半自動的巢式PCR技術解決了標本處理過程中的污染問題，將核酸擴增、提取及熒光檢測融為一體，大大地提高了生物安全度，同時按照本研究的結果，在骨關節結核診斷中的敏感度達到驚人的78.09%，將骨關節結核的診治進程大大提前。

Xpert技術以rpoB基因為靶點，在獲取診斷結果同時可以探測到基因是否突變，從而可以證實標本是否對利福平耐藥，我國作為全球耐多藥結核病高負擔國家，骨關節結核耐藥情況亦不鮮見[10]。如果不能及時發現耐藥，往往導致病灶清除手術失敗，出現多次手術的現象，給患者及社會帶來巨大經濟損失。本研究中，傳統羅氏培養在64例陽性患者中，發現了17例利福平耐藥者；而Xpert技術在196例患者中發現了29例患者，不僅將耐藥治療的時間大大提前了4～6周，并且發現了傳統技術不能鑒別出來的耐藥患者，保證了治療的成功率，節省了大量的治療經費，帶來了良好的社會效益。

二、Xpert技術在國內骨關節結核領域的研究現狀

由于骨關節結核所提供的標本為膿液和肉芽組織，與肺結核患者的痰標本在性質方面存在較大差異，因此需針對不同性質標本進行預處理。根據WHO關于不同組織的預處理做出的推薦，使Xpert技術應用在骨關節結核的診斷具有一定的可行性。2013年，WHO推薦Xpert技術用于診斷肺外結核。2014年李力韜等[11]采用Xpert技術對骨關節結核臨床標本進行了結核分枝桿菌對利福平的耐藥性檢測的驗證性研究，得出的結論是Xpert技術能夠同時對骨關節結核標本行結核分枝桿菌檢測與對利福平的耐藥性檢測，具有很好的臨床應用價值，但此研究標本為標本庫的冷凍菌株，不能很好地反映在臨床中的實際應用價值。2015年Gu 等[12]驗證了Xpert技術在骨關節結核的臨床應用價值，得出的結果是Xpert技術對骨關節結核診斷的敏感度是82.00%，特異度是100.00%，從一定程度上說明Xpert技術在臨床上用于診斷骨關節結核的可行性。2016年唐愷等[13]在膝關節結核診斷中以臨床診斷為參考標準，應用Xpert檢測技術的敏感度為69.00%，特異度為90.00%。本研究的樣本量為272例，以臨床診斷標準為金標準，骨關節結核組診斷脊柱結核者171例，診斷關節結核者80例，涵蓋了骨關節結核的所有常見發病部位，應用Xpert技術檢測的敏感度為78.09%，特異度為100.00%，以更大的樣本量再次證實Xpert技術在骨關節診斷中的必要性和可行性。

三、骨關節結核檢測的金標準選擇及現狀

在肺結核對Xpert技術的診斷試驗中，多采用結核分枝桿菌培養為金標準[2, 9, 14-15]，這與痰液標本的易獲取及含菌量高有很大關系。

骨關節結核屬于肺外結核的一種，很多患者從發病到最終確診往往需要幾個月到幾年的時間，嚴重影響了治療的及時性。隨著影像學技術的發展，尤其是MRI技術的推廣應用，使得骨關節結核診斷所需時間有所提前。但結核病的細菌學診斷作為最直接可靠的診斷金標準，由于骨關節結核病灶標本不易獲得及培養陽性率低的原因，使得細菌學診斷在骨關節結核的診斷中沒能很好地發揮作用。骨關節結核因為屬于少見疾病，從業人員少，至今尚未制定出合理的、令人信服的診斷標準，在全國范圍內如何科學合理地推行臨床試驗是一個亟待解決的迫切問題。本研究采用的骨關節結核臨床診斷標準需要符合以下所有4條：(1)患者臨床癥狀、體征與影像學(包括X線攝影、CT及MRI檢查)發現的局部結核病的膿腫、死骨表現相符；(2)病灶標本的病理學提示為干酪樣壞死并為朗罕細胞肉芽腫；(3)病灶標本的微生物學檢測證實為結核分枝桿菌感染；(4)規律抗結核藥物治療6個月以上，結核中毒癥狀及局部癥狀消失。該標準過于嚴苛，目的是為了盡量減少疑似病例，在一個相對理想的環境下對Xpert技術進行評價，未來有必要采用相對寬松的標準以檢驗Xpert技術在真實世界中對骨關節結核的診斷效率。

四、骨關節結核標本的獲取與Xpert技術的限度

本研究中90%以上的標本為通過手術獲取，而手術獲取的標本由于患者在術前通常進行了抗結核藥物治療，會影響檢測的敏感度；如何在日后通過穿刺技術獲得標本，同時減輕病灶負荷是日后發展的方向。

Xpert技術要在骨關節結核快速診斷中發揮作用，也需要與臨床穿刺技術相結合，以便在疾病早期獲得有意義的病灶組織標本；尤其是在占骨關節結核發病率50%以上的脊柱結核的診斷中，穿刺技術應該得到更多重視。

Xpert技術在骨關節結核應用中受到限制的另外一個因素是標本獲取量的問題。在疾病早期穿刺獲得的標本中，除非患者病灶內存在較多膿液，否則無法提供同時滿足病理、傳統培養及Xpert技術檢測所需的標本量，即使是在開放手術中所獲得的標本，亦同時面臨這一問題。因為在中國由于老年人骨關節結核發病呈上升趨勢，但老年患者病灶一般相對較局限，以侵蝕椎間盤及相鄰終板為主，提供病灶標本的量一般不會超過2 ml。因此，未來如何利用少于2 ml的標本來進行分子生物學檢測仍然是一個亟待解決的問題。

五、Xpert技術臨床應用的性價比

Xpert技術臨床檢測的費用是涂片及羅氏培養檢測法的2倍，中國是一個發展中國家，如何在推廣過程中進一步降低價格也是一個非常迫切需要解決的問題。Meyer-Rath等[16]對南非推行Xpert技術作為常規手段來檢測結核病所帶來的醫療費用的大幅提升進行了初步測算，認為目前要實現這一篩查目標只適合于中等以上發達國家。由于我國幅員遼闊，各地經濟發展不平衡，在一定程度上制約了Xpert技術的推廣應用。但對于可疑耐藥的患者仍然有必要優先進行Xpert技術的檢測，以對治療方案進行及時調整，希望日后國家的衛生政策能基于此做出相應的調整。

綜上所述，Xpert技術作為一種全自動的分子生物學檢測技術，大大減少了對標本的人工處理步驟，不僅使生物安全度得到大幅提升，保護了實驗室操作人員的健康與安全，而且通過集成一系列模塊與熒光探測技術，使得結果獲取時間較液體培養及固體培養由以周計算縮短到以小時計算；在臨床如果能與穿刺技術結合，將使骨關節結核的實時快速診斷成為現實。

參 考 文 獻

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(本文編輯：薛愛華)

Study on GeneXpert MTB/RIF for rapid diagnosis of bone and joint tuberculosis and detection of rifampin resistance

DONGWei-jie,QINShi-bing,LANTing-long,FANJun,TANGKai,LIYuan,YANGuang-xuan,WANGGui-rong,HUANGHai-rong.

DepartmentofOrthopedics,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity;BeijingBoneandJointTuberculosisDiagnosisandTreatmentCenter,Beijing101149，China

QINShi-bing,Email:qinsb@sina.com

Objective To evaluate the performance of a real-time polymerase-chain reaction (PCR) assay, Xpert MTB/RIF (Xpert), for the rapid diagnosis of bone and joint tuberculosis (BJTB) and the detection of rifampin (RFP) resistance. Methods The specimens were obtained from 272 patients who were suspected to be BJTB when they visited the Beijing Chest Hospital between November 2015 and October 2016. Smear, BACTEC MGIT 960 culture，L?wenstein-Jensen’s solid culture and Xpert were performed for each specimen, and L-J culture based drug susceptibility testing (DST) was conducted for all the recovered isolates. The sensitivity and specificity of Xpert in detectingMycobacteriumtuberculosiswere assessed in comparison to a composite reference standard (CRS). The sensitivity and specificity of Xpert for detection of RFP resistance was assessed in comparison to the DST results. Results The sensitivities of Smear, BACTEC MGIT 960, culture and Xpert were 23.90% (60/251), 47.81% (120/251), 25.50% (64/251) and 78.09% (196/251) respectively. The results of these 4 techniques were negative in 21 non-tuberculosis patients. Seventeen RFP-resistant isolates were identified by culture based DST. Xpert was 100% concordant with MGIT based DST for the detection of RFP resistance. Conclusion With high sensitivity and specificity, and its ability to detect drug resistance simultaneously in less than 2 h, Xpert is feasible and valuable to be recommended as a quick diagnostic tool for BJTB in clinical practice.

Tuberculosis, osteoarticular; Nucleic acid amplification techniques; Diagnostic techniques and methods; Drug resistance; Evaluation study

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.04.006

北京市科技計劃課題(D141107005214002)

101149 首都醫科大學附屬北京胸科醫院骨科 北京骨關節結核診療中心(董偉杰、 秦世炳、蘭汀隆、范俊、唐愷、李元、嚴廣璇)，北京市結核病胸部腫瘤研究所 國家結核病臨床實驗室 北京市耐藥結核病研究重點實驗室(王桂榮、黃海榮)

秦世炳, Email:qinsb@sina.com

2017-02-28)